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Programa de la asignatura:
U2 Medios de cultivo
Índice
Presentación de la unidad
Propósitos de la unidad
Competencia específica
Las bases teóricas para el cultivo de tejidos de plantas fueron propuestas por Gottlieb
Haberlandt en la Academia Alemana de Ciencias en 1902 sobre sus experimentos
relativos al cultivo de células individuales. Él opinó lo siguiente: “[a] mi conocimiento, no
se han hecho intentos organizados de manera sistemática al cultivo de células vegetativas
aisladas de plantas superiores. Sin embargo, los resultados de tales experimentos de
cultivos deben dar una idea interesante para las propiedades y potencialidades que posee
la célula como un organismo elemental” (Haberlandt, 1902). Él experimentó sin éxito, con
células aisladas de hojas y otras células funcionalmente diferenciadas, aun así, predijo
que “se podría cultivar con éxito embriones artificiales a partir de células vegetativas”. Así
estableció claramente el concepto de totipotencia e indicó además que “la técnica de
cultivos de células vegetales aisladas en solución nutritiva permite la investigación de los
problemas importantes a partir de un nuevo enfoque experimental”. Sobre la base de
1902 y su experimentación pionera antes y después, Haberlandt se reconoce
justificadamente como el padre del cultivo de tejidos de plantas. Mayores detalles sobre
los primeros eventos pioneros en el cultivo de tejidos vegetales se pueden observar con
los trabajos de White (1963), Bhojwani y Razdan (1983) y Gautheret (1985).
El cultivo de embriones tuvo también su inicio a principios del siglo XX, cuando Hanning
en 1904, cultivó satisfactoriamente embriones de crucíferas y Brown en 1906 embriones
de cebada. Esto fue seguido por el exitoso rescate de embriones a partir de semillas no
viables de una cruza entre Linum perenne X L. austriacum (Laibach, 1929). Tukey (1934)
fue capaz de permitir el desarrollo de un embrión completo de algunas especies de
maduración temprana de árboles frutales, proporcionando de este modo una de las
primeras aplicaciones del cultivo in vitro.
suplemento de vitaminas del grupo B permitieron que los tejidos pudieran estar en
crecimiento continuo e incluso lograr diferenciar raíces y brotes, esto fue reconocido en
las demostraciones casi simultaneas de Gautheret y Nobécourt (1939) con tejidos de raíz
de zanahorias y de White (1939) con tejido tumoral de un híbrido entre Nicotiana glauca X
N. langsdorffii, el cual no requirió de la auxina. Todos los explantes iniciales utilizados por
estos pioneros incluyeron el tejido meristemático. Estos resultados sientan las bases para
el aumento dramático en el uso de los cultivos in vitro en las décadas posteriores.
Estudios por Skoog y sus asociados mostraron que la adición de adenina y altos niveles
de fosfato permitieron que tejidos de médula (pith) no meristemática fueran cultivados
produciendo brotes y raíces, pero solo en la presencia de tejido vascular (Skoog y Tsui,
1948). Estudios posteriores usando ácidos nucleícos permitieron descubrir la primera
citocinina (cinetina) como el producto de degradación del DNA de esperma de arenque
(Miller et al., 1955). La disponibilidad de cinetina, incrementó posteriormente el número de
especies que pueden ser cultivadas indefinidamente, pero quizás lo más importante, es
que permitió reconocer el balance exógeno de auxinas y citocininas en el medio influye el
destino morfogenético de callos de tabaco (Skoog y Miller, 1957). Un alto nivel relativo de
auxina/cinetina, favorecen el enraizamiento, a la inversa, conducen a la formación de
brotes, y los niveles intermedios a la proliferación de callos. Este modelo morfogénico ha
sido adecuado para operar en numerosas especies. Citocininas nativas fueron
descubiertas subsecuentemente en varios tejidos, incluyendo en el agua de coco
(Letham, 1974). Además se reportaron independientemente por Reinert, (1958, 1959) y
Steward et al. (1958) la formación de yemas de brotes unipolares y raíces, la formación de
embriones bipolares somáticos (zanahoria).
Vasil y Hildebrandt (1965), utilizando agua de coco como un aditivo al medio fresco
finalmente realizaron el sueño de Haberlandt de producir una planta completa (tabaco) a
partir de una célula individual, demostrando así la totipotencia de las células de plantas.
Los primeros medios nutritivos usados para el crecimiento de tejidos de plantas in vitro
fueron basados en la formulación de nutrientes para plantas completas. Las soluciones de
Knop y la de Uspenski y Uspenskia fueron muy usadas proveyendo al menos 200 mg/l de
las sales totales. Heller (1953), basado en estudios sobre zanahorias y en tejidos de
enredadera de Virginia, incrementó la concentración de sales dos veces, y Nitsh y Nitsh
(1956) incrementaron posteriormente la concentración de sales a 4 g/l, basados en sus
trabajos con la alcachofa de Jerusalén. Sin embargo, estos cambios no proporcionaron el
crecimiento óptimo para tejidos, siendo requeridos frecuentemente complementos, tales
como el extracto de levadura, la proteína hidrolizada y el agua de coco. En diferentes
aproximaciones basadas en el estudio de la ceniza de los callos de tabaco, Murashige y
Skoog (1962) desarrollaron un nuevo medio. Las concentraciones de algunas sales fuero
25 veces más que las de la solución de Knop. En particular el nivel de NO3- y NH4+ fueron
muy altos y el arreglo de micronutrientes se incrementó. Esta formulación permitió un
incremento en el número de especies de plantas cultivadas, muchas de ellas empleando
solo un medio definido consistiendo de macro y micro nutrientes, una fuente de carbono,
nitrógeno reducido, vitaminas del grupo B y reguladores de crecimiento.
Ball en 1946, produjo con éxito plántulas por cultivo de extremos de brotes, pero la
importancia de esta conclusión no fue reconocida sino hasta que Morel (1960), usando
esta aproximación obtuvo orquídeas libres de virus, realizando una potencial propagación
clonal. Este potencial fue rápidamente explotado, particularmente con ornamentales. Los
primeros estudios de White (1934) mostraron que el cultivo de los extremos de raíz (cofia)
era libre de virus. Posteriormente Limmaset y Cornuet (1949) observaron que la
concentración de virus en los brotes era muy lentos. Esto fue confirmado cuando plantas
libres de virus de Dhalia se obtuvieron a partir de plantas infectadas al cultivar extremos
de brotes (Morel y Martin, 1952). La eliminación de virus fue posible ya que el tejido
Los protoplastos, o células de plantas sin sus paredes celulares, fueron aisladas primero
de manera mecánica a partir de tejidos plasmolizados hace más de 100 años por Klercker
en 1892, y la primera fusión fue lograda por Küster en 1909. Sin embargo, esta tecnología
permaneció sin explotar hasta el uso de celulasa fungal por Cocking (1960),
acomodándose a esta nueva era. En la década de 1970, la disponibilidad comercial de
enzimas degradadoras de pared celular, permitieron su amplio uso y el desarrollo de la
tecnología de protoplastos. La primera demostración de totipotencia de protoplastos fue
realizada por Takebe et al. (1971), quien obtuvo plantas de tabaco a partir de protoplastos
mesofílicos. Esto fue seguido por la generación de la primer planta hibrida inter-específica
(Nicotiana glauca X Nicotiana langsdorffii) realizada por Carlson et al. (1972).
Braun (1941) mostró que en el girasol Agrobacterium tumefaciens puede inducir tumores,
no solo en sitios inoculados pero también a puntos distantes. Estos tumores secundarios
se encontraron libres de la bacteria y estas células pueden ser cultivadas sin auxinas
(Braun y White, 1943). Otros experimentos mostraron que tejidos de “agalla de la corona”,
libres de bacterias, contenían un principio activo inductor de tumores (PIT), el cual fue
probablemente una macromolécula (Braum 1950). La naturaleza del PIT, fue elaborada
en la década de 1970 (Zaenen et al. 1974), pero el trabajo de Braum sirvió de base para
las transformaciones basada en Agrobacterium. Hay que señalar que el hallazgo de
Ledoux (1965) en donde células de plantas podían tomar e integrar DNA, permaneció en
polémica por un tiempo mayor a esa década.
progreso científico fundamental, que sigue siendo la mejor esperanza para lograr una
agricultura sostenible y estable medioambientalmente. Los avances realizados en los
últimos 100 años con la tecnología in vitro ha ido mucho más allá de lo que Haberlandt y
los otros pioneros hubiera imaginado.
El medio de Gamborg (B5) (Gamborg et al., 1968) fue diseñado para el cultivo de callos
de soya, y contiene menos cantidades de nitratos y particularmente sales de amonio que
el medio MS. Sin embargo el medio B5 fue originalmente desarrollado con el propósito de
obtener callos o par el uso en cultivos en suspensión, es adecuado para trabajar como
medio basal en la regeneración de plantas completas. Sheck y Hildebrandt (1972)
desarrollaron el medio SH para el cultivo de callos de mono y dicotiledóneas. El medio de
White (White, 1963), fue diseñado para el cultivo de raíces de tomate, este tiene una baja
concentración de sales en relación al medio MS. El medio de Nitsch (Nitsch y Nitsch,
1969) fue desarrollado para el cultivo de anteras, contiene una concentración intermedia
de sales entre el medio MS y el de White.
Tabla 1.Composición de cinco medios de cultivo de tejidos más comunes en concentraciones de miligramos por litro y concentraciones
molares (Beyl CA, 2005)
Compuesto MS Gamborg B5 WP Nitsch and Nitsch Schenk and Hildebrandt White
Macronutrientes en mg/l (mM)
NH4NO3 1650 (20.6) - 400 (5.0) - - -
NH4H2PO4 - - - - 300 (2.6) -
(NH4)2SO4 - 134 (1.0) - - - -
CaCl2∙2H2O 332.2 (2.3) 150 (1.0) 96 (0.7) 166 (1.1) 151 (1.0) -
Ca(NO3)2∙4H2O - - 556 (2.4) - - 288 (1.2)
MgSO4∙7H2O 370 (1.5) 250 (1.0) 370 (1.5) 185 (0.75) 400 (1.6) 737 (3.0)
KCl - - - - - 65 (0.9)
KNO3 1900 (18.8) 2500 (24.8) - 950 (9.4) 2500 (24.8) 80 (0.8)
K2SO4 - - 990 - - -
KH2PO4 170 (1.3) - 170 (1.3) 68 (0.5) - -
NaH2PO4 - 130.5 (0.9) - - - 16.5 (0.12)
Na2SO4 - - - - - 200 (1.4)
Micronutrientes en mg/l (mM)
H3BO3 6.2 (100) 3.0 (49) 6.2 (100) 10 (162) 5 (80) 1.5 (25)
CoCl2∙6H2O 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) - - 0.1 (0.4) -
CuSO4∙5H2O 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) 0.25 (1) 0.025 (0.1) 0.2 (0.08) 0.01 (0.04)
Na2EDTA 37.3 (100) 37.3 (100) 37.3 (100) 37.3 (100) 20.1 (54) -
Fe2(SO4)3 - - - - - 2.5 (6.2)
FeSO4∙7H2O 27.8 (100) 27.8 (100) 27.8 (100) 27.8 (100) 15.4 (54) -
MnSO4∙H2O 16.9 (100) 10.0 (59) 22.3 (132) 18.9 (112) 10.0 (59) 5.04 (30)
KI 0.83 (5) 0.75 (5) - - 0.1 (0.4) -
MoO3 - - - - - 0.001 (0.001)
Na2MoO4∙2H2O 0.25 (1) 0.25 (1) 0.25 (1) 0.25 (1) 0.1 (0.4) -
ZnSO4∙7H2O 8.6 (30) 2.0 (7.0) 8.6 (30) 10 (35) 1 (3) 2.67 (9)
Orgánicos en mg/l (µM)
Mio-inositol 100 (550) 100 (550) 100 (550) 100 (550) 1000 (5500) -
Glicina 2.0 (26.6) - 2.0 (26.6) 2.0 (26.6) - 3.0 (40)
Ác. nicotínico 0.5 (4.1) 1.0 (8.2) 0.5 (4.1) 5.0 (40.6) 5.0 (40.6) 0.5 (4.1)
Pirodoxina HCl 0.5 (2.4) 0.1 (0.45) 0.5 (2.4) 0.5 (2.4) 0.5 (2.4) 0.1 (0.45)
Tiamina HCl 0.1 (0.3) 10.0 (30) 1.0 (3.0) 0.5 (1.5) 5.0 (14.8) 0.1 (0.3)
Biotina - - - 0.2 (0.05) - -
Agua
Así como el crecimiento de plantas in vivo requiere muchos elementos diferentes, ya sea
del suelo o de fertilizantes el crecimiento de tejidos de plantas in vitro requiere una
combinación de macro y micronutrientes (ver Tabla 2). La selección de las micro o macro
sales y sus concentraciones es dependiente de la especie. El medio MS es muy popular
ya que muchas plantas reaccionan a él favorablemente; si no es así, será debido al alto
contenido de sales.
Las micro-sales típicas incluyen boro (H3BO3), cobalto (CoCl2∙6H2O), hierro (un complejo
de FeSO4∙7H2O y Na2EDTA, o raramente, Fe2[SO4]3), manganeso (MnSO4∙H2O),
molibdeno (NaMoO3), cobre (CuSO4∙5H2O) y zinc (ZnSO4∙7H2O). Las micro-sales son
necesarias en concentraciones más bajas (micromolar [µM]) que los macro-nutrientes.
Algunos medios contienen muy pocas cantidades de yodo (KI), pero cantidades
suficientes de muchos de los elementos traza, ya que éstos pasan inadvertidos como
contaminantes inorgánicos en muchos químicos de grado reactivo (ver Tabla 2).
Con respecto a la tabla 2, su objetivo es preparar una solución concentrada o “stock”, por
lo que el número de gramos o miligramos indicados en la columna de cantidad debe ser
adicionado a 1000 ml de agua des-ionizada para preparar 1 litro de la solución “stock”
necesaria.
Posteriormente, para cada litro de medio a elaborar, deben ser usados 10 ml de cada
solución “stock”.
Para preparar una solución “stock” 100X para alguno de los medios listados en la Tabla 1,
multiplicar la cantidad del químico listado en la tabla por 100 y disolver en un litro de agua
desionizada-destilada.
Con respecto a la nota “a” para CuSO4∙5H2O, considerar lo siguiente: ya que esta
cantidad (250 mg) es muy pequeña para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de
CuSO4∙5H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada, para después adicionar 10 ml de
esta solución a la solución “stock” de sulfatos.
“b” para CoCl2∙6H2O, proceder de manera similar, ya que esta cantidad es muy pequeña
para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de CoCl2∙6H2O en 100 ml de agua
desionizada-destilada, después adicionar 10 ml de esta solución a la solución “stock” de
haluros.
Compuestos orgánicos
por la planta. Pueden ser usados otros tipo de mono – disacáridos o azúcares alcohol
tales como glucosa, fructosa, sorbitol y maltosa. La concentración de azúcar elegida
depende del tipo y edad del explante en el cultivo. Por ejemplo, embriones muy jóvenes
requieren una alta concentración relativa de azúcar (>3%). Para yemas de mora in vitro, la
fructosa es mejor que la sacarosa, glucosa, maltosa, rafinosa o lactosa (Coffin et al.
1976). Para manzanos, el sorbitol y la sacarosa soportan igual de bien, la iniciación de
callos y crecimiento, pero el sorbitol es mejor para el durazno después de cuatro
subcultivos (Oka y Ohyama, 1982). El azúcar (sacarosa) comprado ordinariamente en el
mercado es generalmente adecuado, pero que su origen sea solamente de caña de
azúcar, ya que el proveniente de maíz es principalmente fructosa. La caña de azúcar es
purificada y, de acuerdo a los análisis de los productores de azúcar, éste consiste de
99.94% sacarosa, 0.02% de agua y 0.04% de otros materiales (elementos inorgánicos
tales como rafinosa, fructosa y glucosa). Las sales de nutrientes contribuyen
aproximadamente entre el 20-50% del potencial osmótico del medio de cultivo, quedando
responsable la sacarosa del resto. La contribución de la sacarosa al potencial osmótico se
incrementa cuando este es hidrolizado a glucosa y fructosa durante el autoclaveado. Esto
debe de ser tomado en consideración cuando se desarrollan procedimientos sensibles
tales como el cultivo y aislación de protoplastos.
Las vitaminas son sustancias orgánicas que forman parte de enzimas o cofactores para
funciones metabólicas esenciales. De las vitaminas, sólo la tiamina (vitamina B1 a 0.1-5.0
mg/l) es esencial en un cultivo, ya que está involucrada en el metabolismo de
carbohidratos y en la biosíntesis de algunos aminoácidos. Es usual adicionar al medio de
cultivo de tejidos tiamina HCl. El ácido nicotínico, también conocido como niacina,
vitamina B3, o vitamina PP, forma parte de una coenzima respiratoria y es usada en
concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/l. El medio MS contiene tiamina-HCl, así como otras
dos vitaminas, el ácido nicotínico y la piridoxina (vitamina B6) en la forma HCl. La
piridoxina es una coenzima importante en muchas reacciones metabólicas y es usada en
medios en concentraciones de 0.1-1.0 mg/l. La biotina (vitamina H) es adicionada
comúnmente a medios de cultivo de tejidos a 0.01-1.0 mg/l. Otras vitaminas que son
comúnmente usadas son el ácido fólico (vitamina M; 0.1-0.5 mg/l), riboflavina (vitamina B2;
0.1-10 mg/l), ácido aspártico (vitamina C; 1-1000 mg/l), ácido pantotenico (vitamina B5;
0.5-2.5 mg/l), tocoferol (vitamina E; 1-50 mg/l) y ácido p-aminobenzoíco (0.5-1.0 mg/l).
El inositol es algunas veces caracterizado como uno de las vitaminas del complejo B, pero
es realmente un azúcar alcohol involucrado en la síntesis de fosfolípidos, pectinas de
pared celular y sistemas de membranas en citoplasma celular. Esta es adicionada a
medios de cultivo de tejidos a concentraciones de 0.1-1.0 g/l y ha sido demostrado
necesario para algunas mono, dicotiledóneas y gimnospermas.
Además, otros aminoácidos son algunas veces usados en medios de cultivo de tejidos.
Estas incluyen L-glutamina, asparagina, serina y prolina, que son usadas como fuentes de
El agar es usado para solidificar el cultivo de tejidos (gel). Este capacita al explante a ser
colocado en contacto preciso con el medio (sobre la superficie o embebido en él), pero
permanece aireado. El agar es un polisacárido de alto peso molecular que puede enlazar
el agua y es obtenida de algas marinas. El agar es adicionado al medio en intervalos de
concentraciones de 0.5 a 1.0% (p/v). Altas concentraciones de agar resultan en un medio
duro. Si una concentración baja de agar es empleada (0.4%) o si el pH es bajo, el medio
estará tan suave y no gelificará apropiadamente. La consistencia del agar puede también
influir en el crecimiento. Si es muy duro, el crecimiento de la planta será reducido. Si es
muy suave, pueden resultar plantas hiperhídricas (Singha, 1982). Para gelificar
apropiadamente, un medio con 0.6% de agar debe tener un pH por encima de 4.8.
Algunas veces el carbón activado en el medio interfiere con la gelificación. En cultivos de
tejidos típicos el agar se fusiona a 65ºC y se gelifica a 45ºC aproximadamente.
El agar también contiene contaminantes orgánicos e inorgánicos, la cantidad de ellos
varía entre las distintas marcas comerciales. Contaminantes comunes son: ácidos
orgánicos, compuestos fenólicos, ácidos grasos de cadena larga. Un análisis del
fabricante, muestra que los agares Difco® Bacto® contienen (cantidades en ppm): 0.0-0.5
cadmio; 0.0-0.1 cromo; 0.5-1.5 cobre; 1.5-5.0 hierro; 0.0-0.5 plomo; 210.0-430.0
magnesio; 0.1-0.5 manganeso y 5.0-10.0 zinc. Generalmente se realizan ensayos en los
cultivos de tejidos vegetales de plantas para determinar el tipo de agar que se debe
emplear. Una calidad pobre del agar puede interferir o inhibir el crecimiento de cultivos.
Gomas tales como Gelrite™ y Phytagel™ son alternativas de agentes gelificantes. Están
hechas de polisacáridos producidos por una bacteria. En lugar de ser traslúcidas (como el
agar) son claras, por lo que es mucho más fácil de detectar la contaminación.
2.2.2. Preparación
El primer paso para elaborar un medio de cultivo es el de aprovisionarse de todos los
materiales y equipos necesarios para tal fin, por ejemplo:
Unidades de concentración
Porcentaje basado sobre el volumen (v/v). Usado para diluir el agua de coco,
jugo de tomate y de naranja. Por ejemplo, si deseamos 100 ml de agua de coco al
5%, requerimos tomar 5 ml de agua de coco y diluirlo con agua hasta alcanzar 100
ml.
Porcentaje basado en peso (p/v). Frecuentemente usado para expresar
concentraciones de agar o azúcar. Por ejemplo, para preparar una solución al 1%
de agar, es necesario disolver 10 g de agar en un litro de medio nutritivo.
Solución molar. Para ello es necesario recordar que un mol (M) corresponde al
mismo número de gramos como peso molecular corresponda (número de
Avogadro), por lo tanto una solución 1M representa el peso molecular de la
sustancia en un litro de solución, y 0.01 M representa 0.01 veces el peso
molecular contenido en un litro de solución. Por lo que una solución milimolar (mM)
representa 0.001 veces el peso molecular contenido en un litro. Las sustancias
tales como los RCP están activas a concentraciones de micromoles (µM). La
concentración molar es usada exactamente para comparar la reactividad relativa
entre diferentes compuestos. Por ejemplo, a la concentración 1 µM de AIA (ácido
indol acético) puede contener el mismo número de moléculas que 1 µM de
cinetina, aunque realizando las conversiones correspondientes, esto puede ser
también dichas en unidades basadas al peso (mg/ml). La tabla 3, ilustra la
conversión entre concentraciones molares y las dadas en mg/l.
Miligramos por litro (mg/l). Aunque no es posible comparar sustancias con
exactitud molecular, esta es una forma simple para realizar cálculos y usarlo en
pesos directos. Cada medición directa es usada comúnmente en los
macronutrientes y en RCP. Un miligramo por litro significa el colocar 1 mg de la
sustancia deseada en un volumen final de 1 litro de solución. Recuerde que 1 mg
= 0.001 g (10-3 g).
Microgramos por litro (µg/l). Este es usado con micronutrientes y también en
algunas ocasiones con RCP. Significa 1 µg de una sustancia y se lleva a un
volumen de 1 L de solución. 1 microgramo = 0.001 o 10-3 mg = 0.000001 o 10-6 g.
Partes por millón (ppm). Algunos componentes de medios son expresados en
ppm, 1 ppm es igual a 1 mg/l.
El ajuste del pH es el último paso antes de adicionar y disolver el agar para después
distribuirlo en frascos de cultivo y “autoclavearlo” o esterilizar. Si el pH no se encuentra en
los intervalos establecidos, éste debe ser ajustado usando NaOH para elevar el pH o HCl
para bajarlo (0.1-1.0N). Mientras que el KOH puede ser usado, cuando existe un
indeseable incremento de iones de sodio. El pH en un medio de cultivo generalmente
decae de 0.3 a 0.5 unidades después del autoclaveado y después cambia a través del
periodo de cultivo, debido a la oxidación y a la toma diferencial y secreción de sustancias
del crecimiento de tejidos.
Finalmente, es importante señalar que las fotografías son solamente un apoyo para
imaginar el proceso, por lo que los colores mostrados aquí, son solo para resaltar la
imagen, esto es entonces, que las soluciones “stock” son incoloras y al final el medio de
cultivo permanece incoloro. El uso en nuestro caso de una autoclave horizontal, como la
mostrada en el paso 6, implica ordenar los frascos conteniendo el medio de cultivo
impidiendo que estos queden inclinados o que puedan derramarse.
Las sales minerales pueden ser preparadas como soluciones madre o soluciones “stock”
de 10 a 100 veces (10X a 100X) la concentración especificada en el medio. Las sales
minerales son frecuentemente agrupadas en dos soluciones stock, una para macro-
elementos y una para micro-elementos, pero al menos que éstos se mantengan
relativamente diluidos (10X), la precipitación puede ocurrir. Con la finalidad de producir
soluciones más concentradas, el método preferido es el de agrupar los componentes por
los iones que ellos contienen, tales como nitratos, sulfatos, haluros, fósforo (P), boro (B),
molibdeno (Mo) y hierro (Fe) haciéndolos en “stocks” de 100X. La tabla 2 lista las
soluciones “stock” para el medio MS para una concentración final de 100X, lo cual
significa que 10 ml de cada solución “stock” será usada para elaborar un litro de medio de
cultivo. Algunas soluciones “stock” requieren pasos extras para obtener los componentes
de la solución (por ejemplo, el “stock” de NaFeEDTA), o que requieran una dilución serial
para obtener la cantidad de componentes traza de la solución “stock” (sulfatos o haluros).
Algunas veces la cantidad de componentes particulares necesarios para el medio de
cultivo de tejidos es tan pequeña que hace difícil el pesar la cantidad incluso para el
“stock” 100X. Por lo que estas cantidades tan pequeñas no pueden ser pesadas
exactamente, la técnica de diluciones seriales es usada. El siguiente ejemplo ilustra cómo
una dilución serial puede ser empleada para obtener la cantidad correcta de un
componente (en este caso CuSO4∙5H2O) del medio de cultivo para su apropiada solución
“stock”.
El estudio de la función de RCP puede ser complejo, ya que varios RCP trabajan de
manera típica en concierto con algunos otros y sus concentraciones en la planta cambian
con el tiempo, estación del año y etapa de desarrollo. Algunos RCP son sintetizados
localmente por las células para su propio consumo, mientras que otras son sintetizadas
en un órgano y transportado a otras partes de la planta para una acción específica, por lo
que en este caso su actividad puede ser muy similar a una “hormona” para la planta y son
referidos como RCP endógenos. En esta sección solo se describirán los RCPs naturales y
sintéticos identificados y comúnmente suministrados a plantas intactas y a cultivo de
tejidos, esto es RCP exógenos.
mismo o diferente tipo para obtener el resultado deseado, o para obtener tratamientos
secuenciales con diferentes RCP.
Aunque el papel de los RCP en el cultivo de tejidos vegetales es crítico, los RCP
interactúan dentro de importantes determinantes biológicos. El factor más importante en el
cultivo de tejidos vegetales, es el genotipo; en otras palabras, la habilidad genética del
material vegetal para producir la respuesta deseada. Por ejemplo, algunas especies o
cultivos regeneran brotes, o producen embriones somáticos, con una relativa pequeña
estimulación, mientras que otros no. De forma adicional, el estado fisiológico del material
vegetal podrá determinar la respuesta biológica. Por lo tanto, ciertas partes de plantas
(explantes) tendrán una mejor respuesta que otros en el mismo lapso de tiempo.
Existen cinco principales grupos de RCP endógenas: auxinas, citocininas, giberelinas,
ácido abcísico y etileno. Muchos de éstos grupos tienen múltiples roles en el crecimiento y
desarrollo de plantas, y son muy usadas para la manipulación de plantas en el cultivo de
tejidos. Todos ellos pueden ser divididos en tres grupos, mismos que a continuación se
revisarán.
2.3.1. Auxinas
El primer RCP aislado fue la auxina endógena (natural), ácido indol-3-acético (AIA) (Fig.
3A). El AIA es rápidamente degradado ya sea en el medio de cultivo o en la planta, sin
embargo existen análogos químicos más estables con los que pueden ser sustituidos.
Son llamados auxinas, debido a su actividad biológica similar al AIA. Auxinas sintéticas
tales como el 2,4-D (Fig. 3B), el ácido 3-indol butírico (AIB) (Fig. 3C) y al ácido 1-
naftalenacético (ANA) (Fig. 3D) son los más frecuentemente usados. Es interesante notar
en las auxinas las similitudes de las estructuras químicas.
Figura 3. Estructuras químicas de algunos RCP tipo auxinas. (A) Ác. Indol-3-acético (AIA); (B)
ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D); (C) ácido 3-indol-butirico (AIB); (D) ácido 1-naftalenacético
(ANA) (Gaba, VP, 2005).
2.3.2. Citocininas
Las citocininas causan división celular. Cada división celular puede dirigir a regeneración
de brotes in vitro, por estímulo a la formación de brotes apicales meristemáticos y,
subsecuentemente a yemas. El término citocinina es usado para componentes con
actividad biológica similar. Además, la división celular causada por citocininas puede
producir callos no diferenciados. Generalmente, un alta concentración de citocininas
bloqueará el desarrollo de raíces. Las citocininas pueden causar la liberación de
dominancia apical de brotes, por lo tanto estimulará el crecimiento de yemas laterales
resultando en múltiples formaciones de brotes. La primera citocinina aislada fue la cinetina
(Fig. 4A); un poco después de su descubriendo, la adenina fue identificada como
poseedora de actividad de citocininas (Fig. 4C), tales como muchos derivados de la
adenina (Fig. 4). La zeatina (Fig.4C) y la N6-2-isopentenil adenina (2-iP; Fig. 4D) son otras
dos citocininas que se encuentran de forma natural que se usan frecuentemente en cultivo
de tejidos. Adicionalmente, la citocininas sintética 6-benciladenina (BA) (también conocida
como 6-bencil aminopurina [BAP]; Fig. 4E) y thidiazuron (TDZ, Fig. 4F) son también
usadas en el cultivo de tejidos vegetales. La zeatina ribósido es un ejemplo de un RCP
acomplejado con una molécula de azúcar, alterando sus propiedades biológicas de un
RCP (Fig. 4 G).
Figura 4. Estructuras químicas de algunos RCP tipo citocininas. (A) cinetina; (B) adenina; (C)
zeatina; (D) N6-2-isopentenil adenina (2-iP); (E) 6-benciladenina; (F) thidiazuron (TDZ); (G) zeatina
ribósido (Imágenes transcritas de Gaba, BP, 2005).
2.3.3. Giberelinas
Las giberelinas son otra tipo de RCP con cerca de 100 diferentes variantes identificadas
de varias fuentes, todas ellas basadas en la misma estructura de giberelano. La actividad
de giberelinas exógenas aplicadas varía con el tipo de giberelinas y la especie de plantas
tratadas. Las giberelinas comúnmente aplicadas en el cultivo de tejidos vegetales es el
GA3, también conocida como ácido giberélico (Fig. 5A). Aunque las giberelinas tienen
importantes papeles en el ciclo de vida de plantas (controlando longitud del tallo,
florecimiento y secado del fruto), en el cultivo de tejidos el GA3 ha sido generalmente
usado para estimular ya sea la elongación del brote o la conversión de yemas a brotes.
GA3 interfiere con la iniciación de las yemas en estados muy tempranos de la formación
del meristemo, por lo que puede reducir la producción de brotes in vitro si se adiciona a
los cultivos de tejidos vegetales en la etapa de iniciación de brotes. De forma similar, GA3,
reduce la formación de raíces y la embriogénesis in vitro. Por lo anterior, para usos
prácticos, es necesario optimizar los efectos de la etapa específica de GA3.
Figura 5. Estructuras químicas de RCP de acciones variadas. (A) Ácido giberélico (GA3); (B) ácido
abscísico (ABA); (C) etileno; (D) ancymidol (imágenes transcritas de Gaba, BP, 2005).
2.3.5. Etileno
El etileno es el único RCP gaseoso natural (Fig. 5C). A pesar de que el etileno se conoce
sobre todo en biología de plantas por sus efectos en la maduración de frutas, este es
naturalmente producido por todos los órganos de la planta superior en una manera
controlada. En el cultivo de tejidos de plantas, el etileno producido endógenamente puede
acumular en un recipiente cerrado a niveles que son perjudiciales para el crecimiento y
desarrollo de plantas. El resultado en especies sensibles al etileno, se muestra en un
síndrome típico de la reducción de la elongación del tallo, restringido crecimiento de hojas,
prematura senescencia foliar y, algunas veces, incremento en el crecimiento de yemas
auxiliares. Mejorando concentraciones de etileno, se puede estimular la formación de
callos, reduciendo la regeneración de yemas y brotes. La embriogénesis somática puede
ser afectada por la concentración de etileno –bajas concentraciones estimula, mientras
que altas concentraciones lo inhiben.
Actividades
Autorreflexiones
Cierre de la unidad
Uno de los principales pasos para desarrollar estas técnicas es el de conocer los
diferentes ingredientes que conforman el medio de cultivo y su función, por lo que en la
siguiente unidad, concluiremos con la construcción del conocimiento relacionada al
establecimiento físico de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
Fuentes de consulta
La gran mayoría de citas se encuentran referenciadas directamente en los documentos
revisados de Smith HR (2013) y Trigiano RN - Gray DJ (2005).
Beyl CA, (2005). Getting started with tissue culture: Media preparation, sterie technique,
and laboratory equipment. En: Trigiano RN y Gray DJ. Plant development and
biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6
Bhojwani, S.S., y Razdan, M.K. (1983). Plant tissue culture: Theory and practice:
Developments in crop science. Amsterdam: Elsevier.
Gautheret, R.J. (1985). “History of plant tissue and cell culture: A personal account”. En:
I.K. Vasil (Ed.) Cell culture and somatic cell genetics of plants (Vol. 2, pp. 1-59). New
York:Academic Press.
Laimer M. y Rücker W. (Eds) 2003. Plant Tissue Culture, 100 years since Gottlieb
Haberlandt. Vienna: Springer-Verlag Wien. ISBN 978-3-211-83839-6
Thorpe T.A. (2013). History of plant cell culture. En: Smith HR. Plant Tissue Culture,
techniques and experiments (2 ed.). USA: Academic Press. ISBN 978-0-12-415920-4.
White, P.R. (1963). The cultivation of animal and plant cells (2ª ed.) New York: Ronald
Press.
ANEXO
Nombres de algunos compuestos químicos que aparecen en esta etapa.
Compuesto Nombre