Production and membrane fractionation of bioactive peptides from a whey

protein concéntrate

Producción y fraccionamiento de membrana de péptidos bioactivos a partir

de un concentrado de proteína de suero
RESUMEN

Whey proteins carry bioactive sequences that can be released by enzymatic hydrolysis. Often, the
resulting hydrolysates are in the need of a fractionation process to improve or define their
bioactivity. In this work, a whey protein concentrate was hydrolysed with trypsin and the obtained
peptides were separated by means of membrane ultrafiltration/nanofiltration. Three pH values (2,
6 and 8) were assayed for two polyethersulfone membranes having different pore sizes (1 and 5
kDa). b-lactoglobulin peptides predominated in the hydrolysate as it was preferentially cleaved.
Peptides net charge, charge distribution and size explained peptide transmissions. The highest
transmissions were achieved at pH values near peptides isoelectric point. The best separation
factors were obtained at basic pH values. A new membrane strategy was developed for obtaining
permeates enriched in bioactive peptides from a complex hydrolysate.

Las proteínas de suero llevan secuencias bioactivas que pueden ser liberadas por hidrólisis
enzimática. A menudo, los hidrolizados resultantes necesitan un proceso de
fraccionamiento para mejorar o definir su bioactividad. En este trabajo, se hidrolizó un
concentrado de proteína de suero de leche con tripsina y los péptidos obtenidos se
separaron por medio de una membrana de ultrafiltración / nanofiltración. Se ensayaron
tres valores de pH (2, 6 y 8) para dos membranas de polietersulfona que tienen diferentes
tamaños de poro (1 y 5 kDa). Los péptidos de b-lactoglobulina predominaron en el
hidrolizado ya que se escindió preferencialmente. Péptidos de carga neta, distribución de
carga y tamaño de las transmisiones de péptidos explicados. Las transmisiones más altas
se lograron a valores de pH cerca del punto isoeléctrico de los péptidos. Los mejores
factores de separación se obtuvieron a valores de pH básicos. Se desarrolló una nueva
estrategia de membrana para obtener permeatos enriquecidos en péptidos bioactivos a
partir de un complejo hidrolizado.

1. INTRODUCCIÓN
Traditionally, whey has been considered a troublesome byproduct of the dairy industry, as
it is produced in large amounts and entails high polluting poweR. In order to find
economical means to treat it, an intense scientific research was performed over whey
components, especially proteins. Although whey proteins have been reported to possess
relevant nutritional and biological properties, their activities are mainly associated with
the bioactive peptides encoded within the protein sequence. Biopeptides can be
generated by in vitro hydrolysis of proteins. They are defined as specific protein fragments
that have a positive impact on body functions or conditions and may ultimately influence
health. These peptides can exert a large variety of activities.

Tradicionalmente, el suero se ha considerado un subproducto problemático de la industria

láctea, ya que se produce en grandes cantidades y conlleva un alto poder contaminante.
Con el fin de encontrar medios económicos para tratarlo, se realizó una intensa
investigación científica sobre los componentes del suero, especialmente las proteínas.
Aunque se ha informado que las proteínas de suero de leche poseen propiedades
nutricionales y biológicas relevantes, sus actividades se asocian principalmente con los
péptidos bioactivos codificados dentro de la secuencia de la proteína. Los biopéptidos
pueden generarse por hidrólisis in vitro de proteínas. Se definen como fragmentos de
proteína específicos que tienen un impacto positivo en las funciones o condiciones del
cuerpo y, en última instancia, pueden influir en la salud. Estos péptidos pueden ejercer
una gran variedad de actividades.

But even if hydrolysates are so rich in beneficial properties, they are still in the need of a
fractionation or purification process, so as to turn them into saleable products with
defined properties and characteristics. The main drawback for their fractionation is that
most of the peptides share very similar physicochemical characteristics, therefore, only a
separation technology able to distinguish between subtle differences in charge, size,
solubility or hydropathicity results of utility. Membrane technologies offer the possibility of
a relatively easy scale up. Additionally, it is a low-cost technology, and mild operation
conditions are used so substrate nutritional properties remain almost intact. Among
membrane processes, nanofiltration (NF) is considered as especially appropriate for
peptide separation, due to the molecular weight cut-off (MWCO) used (within bioactive
peptides range) and the importance of charge effects (as peptides are charged molecules).

Pero incluso si los hidrolizados son tan ricos en propiedades beneficiosas, todavía
necesitan un proceso de fraccionamiento o purificación, para convertirlos en productos
vendibles con propiedades y características definidas. El principal inconveniente para su
fraccionamiento es que la mayoría de los péptidos comparten características
fisicoquímicas muy similares, por lo tanto, solo una tecnología de separación capaz de
distinguir entre diferencias sutiles en carga, tamaño, solubilidad o hidropatía resulta de
utilidad. Las tecnologías de membrana ofrecen la posibilidad de una ampliación
relativamente fácil. Además, es una tecnología de bajo costo, y se utilizan condiciones de
operación suaves para que las propiedades nutricionales del sustrato permanezcan casi
intactas. Entre los procesos de membrana, la nanofiltración (NF) se considera
especialmente adecuada para la separación de péptidos, debido al corte de peso
molecular (MWCO) utilizado (dentro del rango de péptidos bioactivos) y la importancia de
los efectos de carga (ya que los péptidos son moléculas cargadas).

Whey protein hydrolysates (WPH) have already been filtered with ultrafiltration (UF) and
NF membranes, but with purposes such as obtaining permeate streams with low
antigenicity, collecting enriched fractions in a determined bioactivity or studying the
influence of diverse parameters on the operation mode. Even so, little effort has been
done to attempt to elucidate the reasons of peptide transmission in those complex
mixtures. Fractionated a tryptic WPH in order to evaluate peptide separation under
different conditions. However, they exclusively studied a selected group of previously
characterized peptides, and the hydrolysate was previously fractionated with a 10 kDa
MWCO membrane, so as to remove proteins and non-hydrolysed material.

Los hidrolizados de proteína de suero (WPH) ya se han filtrado con ultrafiltración (UF) y
membranas NF, pero con fines tales como obtener corrientes permeadas con baja
antigenicidad, recoger fracciones enriquecidas en una bioactividad determinada o estudiar
la influencia de diversos parámetros en el modo de operación. Aun así, se ha hecho poco
esfuerzo para tratar de dilucidar las razones de la transmisión de péptidos en esas mezclas
complejas. Se fraccionó una WPH tríptica para evaluar la separación de péptidos bajo
diferentes condiciones. Sin embargo, estudiaron exclusivamente un grupo seleccionado de
péptidos previamente caracterizados, y el hidrolizado se fraccionó previamente con una
membrana de MWCO de 10 kDa, para eliminar las proteínas y el material no hidrolizado.

The purposes of this research work were two: First, to develop a separation process by
means of membrane filtration in order to obtain a permeate product with potential to
become a functional ingredient. Second, to study the influence of feed pH, membrane
pore size and peptides characteristics on the fractionation process. For this, a WPC was
digested with trypsin in order to produce peptides with any reported bioactivity
(antihypertensive, antioxidant, glucose regulatory, antimicrobial …); and the resulting
hydrolysate was characterized in terms of peptide composition. The WPH was then filtered
with two different UF/NF membranes at three different pH values, in order to compare
separation performances. The mechanisms underlying peptide separation were assessed,
and the enrichment in bioactive peptides under different conditions evaluated.

Los propósitos de este trabajo de investigación fueron dos: Primero, desarrollar un proceso
de separación por medio de filtración de membrana para obtener un producto filtrado con
potencial para convertirse en un ingrediente funcional. Segundo, estudiar la influencia del
pH de la alimentación, el tamaño de los poros de la membrana y las características de los
péptidos en el proceso de fraccionamiento. Para esto, se digirió un WPC con tripsina para
producir péptidos con cualquier bioactividad informada (antihipertensivos, antioxidantes,
reguladores de glucosa, antimicrobianos ...); y el hidrolizado resultante se caracterizó en
términos de composición de péptidos. El WPH se filtró luego con dos membranas
diferentes de UF / NF en tres valores de pH diferentes, con el fin de comparar el
rendimiento de separación. Se evaluaron los mecanismos subyacentes a la separación de
péptidos y se evaluó el enriquecimiento en péptidos bioactivos en diferentes condiciones.

2. MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 MATERIALS

WPC was kindly supplied by Armor Proteines (Saint Brice en Cogles, Brittany, France). The
powder contained 82% protein by Kjeldahl [N*6,38 (FIL 20/ISO 8968)], comprising 60% of
b-lactoglobulin (b-lg), 20% of a-lactalbumin (a-la), 10% of Immunoglobulin G (IgG), 8% of
Bovine Serum Albumin (BSA), 1% of Lactoferrin (LF) and 1% of other proteins. Trypsin
(T1426 from bovine pancreas TPCK treated) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO, USA). Trifluoroacetic acid (TFA) was from Merck (Darmstadt, Germany). Acetonitrile
(ACN), hydrochloric acid (HCl) and orthophosphoric acid (H3PO4) were obtained from
VWR (Barcelona, Spain). Sodium hydroxide (NaOH) was from Panreac (Barcelona, Spain).
Protein standards (bovine b-lg, a-la and BSA) were supplied by Sigma.

WPC fue amablemente provisto por Armor Proteines (Saint Brice en Cogles, Bretaña,
Francia). El polvo contenía 82% de proteína por Kjeldahl [N * 6,38 (FIL 20 / ISO 8968)], que
comprende 60% de b-lactoglobulina (b-lg), 20% de a-lactalbúmina (a-la), 10% de
inmunoglobulina G (IgG), 8% de albúmina sérica bovina (BSA), 1% de lactoferrina (LF) y 1%
de otras proteínas. La tripsina (T1426 de páncreas bovino tratado con TPCK) se adquirió en
Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ácido trifluoroacético (TFA) era de Merck
(Darmstadt, Alemania). El acetonitrilo (ACN), el ácido clorhídrico (HCl) y el ácido
ortofosfórico (H3PO4) se obtuvieron de VWR (Barcelona, España). El hidróxido de sodio
(NaOH) era de Panreac (Barcelona, España). Las normas de proteínas (bovina b-lg, a-la y
BSA) fueron suministradas por Sigma.

2.2 Preparation of WPC solutions WPC

Solutions were prepared by dissolving 50 g of WPC in 1 L of ultrapure water. The powder

was allowed to dissolve for 15 min at 37 C under constant agitation in a magnetic stirrer
hotplate (MR Hei-standard, Heidolph, Schwabach, Germany). Complete solubilization of
WPC in water was verified by 10 min centrifugation at 12.000g at ambient temperature.

Preparación de WPC solutions WPC

Las soluciones se prepararon disolviendo 50 g de WPC en 1 l de agua ultrapura. El polvo se

dejó disolver durante 15 min a 37 ° C bajo agitación constante en una placa calefactora con
agitador magnético (MR Hei-estándar, Heidolph, Schwabach, Alemania). La solubilización
completa de WPC en agua se verificó por 10 min de centrifugación a 12,000 g a
temperatura ambiente.

2.3 Enzymatic hydrolysis

For all experiments, hydrolysis conditions were pH 8, temperature 37 C (trypsin optimum

conditions) and constant agitation at 375 rpm. The pH was maintained throughout
reactions by titration with 2 M NaOH, using a pH burette 24 2S unit (Crison, Barcelona,
Spain). The enzyme:substrate (E/S) ratio was 1:200 (w/w). Reactions were stopped by the
addition of 0.1 M HCl after 6 h. Aliquots of the hydrolysate were collected before enzyme
addition and every 15 min, and stored at 40 C for further analyses.

Hidrólisis enzimática

Para todos los experimentos, las condiciones de hidrólisis fueron pH 8, temperatura 37ºC
(condiciones óptimas de tripsina) y agitación constante a 375 rpm. El pH se mantuvo a lo
largo de las reacciones por titulación con NaOH 2 M, usando una unidad de bureta de pH
24 2S (Crison, Barcelona, España). La relación enzima: sustrato (E / S) fue 1: 200 (p / p). Las
reacciones se detuvieron mediante la adición de 0.1 M de HCl después de 6 h. Se
recogieron alícuotas del hidrolizado antes de la adición de la enzima y cada 15 minutos, y
se almacenaron a 40ºC para análisis posteriores.

2.4 Calculation of the degree of hydrolysis

The degree of hydrolysis (DH) is defined as the percentage of peptide bonds cleaved
during the enzymatic reaction. Thus, a DH of 100% means the total degradation of a
protein to free amino acids. However, when enzymes with specificity to individual peptide
bonds are used, DH values are always lower than 100%. In case of the system WPC-trypsin,
the maximum theoretical DH (DHmax the) was calculated as 10.70%.
The DH was calculated according to the amount of base consumed to maintain constant
the pH value (pH-stat), using Eq. (1) (Adler-Nissen, 1986):

Where B is the base consumption (mL), Nb the normality of the base (meq/mL), MP is the
mass of protein (g), htot corresponds to the total number of peptide bonds in the
substrate protein (meq/g) and a is the average degree of dissociation of the α-NH groups.
The parameters a and htot for whey proteins were previously calculated and take the
values of 1 and 8.8 respectively (Nielsen et al., 2001).
Cálculo del grado de hidrólisis

El grado de hidrólisis (DH) se define como el porcentaje de enlaces peptídicos escindidos

durante la reacción enzimática. Por lo tanto, un DH de 100% significa la degradación total
de una proteína a aminoácidos libres. Sin embargo, cuando se usan enzimas con
especificidad para enlaces peptídicos individuales, los valores DH siempre son inferiores al
100%. En el caso del sistema WPC-tripsina, el máximo teórico DH (DHmax el) se calculó
como 10.70%. El DH se calculó de acuerdo con la cantidad de base consumida para
mantener constante el valor de pH (pH-stat), usando Eq. (1) (Adler-Nissen, 1986):

Donde B es el consumo base (mL), Nb la normalidad de la base (meq / mL), MP es la masa

de proteína (g), htot corresponde al número total de enlaces peptídicos en la proteína del
sustrato (meq / g) y a es el grado medio de disociación de los grupos α-NH. Los parámetros
a y htot para proteínas de suero se calcularon previamente y toman los valores de 1 y 8,8
respectivamente (Nielsen et al., 2001).

2.5 Membrane fractionation

2.5.1. Membrane rig

The filtration system consisted of a Pellicon 2 mini cassette holder (88 cm2 & 0.11 m2 ,
Millipore, Billerica, MA, USA) and a GJ series 120 pump (I-Drive, Micropump Inc.,
Vancouver, WA, USA), connected to a 1 L jacketed glass tank reactor coupled to a
thermostatic water bath for temperature control (Ultraterm, P Selecta, Barcelona, Spain).

2.5.2. Characterization of the UF/NF membranes Two different polyethersulfone (PES)

membranes, each with a filtration area of 0.1 m2 , were used for the fractionation
experiments. They had a nominal molecular weight cut-off (NMWCO) of 5 (PES5)
(Millipore) and 1 kDa (PES1) (Sartorius, Goettingen, Germany) respectively.
The membranes were characterized with distilled water at two temperatures, room
temperature (25 C) and filtration temperature (37 C). Permeate flux (Jp) (L/m2 h) was
measured vs. transmembrane pressure (TMP) (MPa), temperature (ºC) and time (min).
The membranes cleaning procedure was performed before first use and after every
filtration run, according to the membrane supplier recommendations, rinsing thoroughly
with distilled water before and after every cleaning process. Cleaning agents used were 1
M NaOH and 2% H3PO4; and cleaning protocol was a 10 min rinse followed by a 60 or 30
min recirculation at 40 C respectively. The constant TMP values used were 0.12 MPa for
PES1 membrane and 0.20 MPa for PES5 membrane, and the respective recirculation rates
were 4 and 55 L/hm2 . The pure water flux (Jw) was measured before use and after each
cleaning procedure, so as to check cleaning efficiency. Jw was always 100% recovered. The
membranes were stored in 20% ethanol (PES1) or 0.1 M NaOH (PES5) under refrigeration
(2-8°C).

2.5.3. Fractionation of the WPH

The fresh hydrolysate was diluted at a ratio of 1:15 with ultrapure water in order to
minimize concentration polarization effects and allow acceptable permeate flow rates. For
each experiment run, 1.5 L hydrolysate dilutions were adjusted to pH 2, 6 or 8 with 0.1 M
HCl or NaOH, and temperature and pressure set to the corresponding values. Then, the
filtration was started, letting the system equilibrate for 15 min. Retentate was returned to
the feed tank and permeate was collected into a beaker. All filtration experiments were
performed at fixed conditions of temperature (37 C) and TMP (0.15 MPa). The observed
transmissions (Trobs) of individual peptides through the membranes were calculated using
Eq. (2):

A Pi
Tr ( ) = x 100
A Ri

where APi and ARi are the i peptide peak areas obtained from the HPLC chromatograms of
each membrane permeates and retentates, respectively. The theoretical transmissions
(Trtheo) were also calculated according to Eq. (3) (Zeman and Wales, 1981):

with

The separation factors (S) between two peptides or group of peptides (x/y) were
calculated as the ratio of mean Tr values (%) with Eq. (4):
where n and m are the number of peptides comprised in groups x and y respectively. This
value (Sx/y) represents the selectivity of the membrane to distinguish between specific
peptides or groups of peptides.

2.5 Fraccionamiento de la membrana

2.5.1. Aparejo de membrana

El sistema de filtración consistía en un minicastucho Pellicon 2 (88 cm2 y 0.11 m2,

Millipore, Billerica, MA, EE. UU.) Y una bomba GJ serie 120 (I-Drive, Micropump Inc.,
Vancouver, WA, EE. UU.), Conectado a un reactor de tanque de vidrio encamisado de 1 L
acoplado a un baño termostático de agua para control de temperatura (Ultraterm, P
Selecta, Barcelona, España).

2.5.2. Caracterización de las membranas UF / NF

Se usaron dos membranas diferentes de polietersulfona (PES), cada una con un área de
filtración de 0.1 m2, para los experimentos de fraccionamiento. Tenían un límite de peso
molecular nominal (NMWCO) de 5 (PES5) (Millipore) y 1 kDa (PES1) (Sartorius, Goettingen,
Alemania), respectivamente.

Las membranas se caracterizaron con agua destilada a dos temperaturas, temperatura

ambiente (25ºC) y temperatura de filtración (37ºC). El flujo de permeado (Jp) (L / m2 h) se
midió frente a la presión transmembrana (TMP) (MPa), temperatura (ºC) y tiempo (min). El
procedimiento de limpieza de las membranas se realizó antes del primer uso y después de
cada pasada de filtración, de acuerdo con las recomendaciones del proveedor de la
membrana, enjuagar cuidadosamente con agua destilada antes y después de cada proceso
de limpieza. Los agentes de limpieza usados fueron NaOH 1 M y H3PO4 al 2%; y el
protocolo de limpieza fue un enjuague de 10 minutos seguido de una recirculación de 60 o
30 minutos a 40ºC, respectivamente. Los valores constantes de TMP utilizados fueron 0,12
MPa para la membrana PES1 y 0,20 MPa para la membrana PES5, y las respectivas tasas de
recirculación fueron de 4 y 55 L/hm 2. El flujo de agua pura (Jw) se midió antes del uso y
después de cada procedimiento de limpieza, para verificar la eficacia de la limpieza. Jw
siempre se recuperó al 100%. Las membranas se almacenaron en 20% de etanol (PES1) o
0,1 M de NaOH (PES5) en refrigeración (2-8 °C).

2.5.3. Fraccionamiento de la WPH

El hidrolizado fresco se diluyó en una proporción de 1:15 con agua ultrapura para
minimizar los efectos de polarización de concentración y permitir velocidades de flujo de
permeado aceptables. Para cada experimento ejecutado, se ajustaron diluciones de 1,5 L
de hidrolizado a pH 2, 6 u 8 con HCl 0, 1 M o NaOH, y se ajustaron la temperatura y la
presión a los valores correspondientes. Luego, se inició la filtración, permitiendo que el
sistema se equilibrara durante 15 minutos. El retenido se devolvió al tanque de
alimentación y el permeado se recogió en un vaso de precipitados. Todos los experimentos
de filtración se realizaron en condiciones fijas de temperatura (37ºC) y TMP (0,15 MPa).
Las transmisiones observadas (Trobs) de péptidos individuales a través de las membranas
se calcularon usando Eq. (2):

A Pi
Tr ( ) = x 100
A Ri

donde APi y ARi son las áreas del pico del péptido i obtenidas a partir de los
cromatogramas de HPLC de cada membrana impregnada y retenida, respectivamente. Las
transmisiones teóricas (Trtheo) también se calcularon de acuerdo con Eq. (3) (Zeman y
Wales, 1981):

Con

Los factores de separación (S) entre dos péptidos o grupo de péptidos (x / y) se calcularon
como la relación de valores medios de Tr (%) con Eq. (4):

dónde n y m son el número de péptidos comprendidos en los grupos x e y

respectivamente. Este valor (Sx/y) representa la selectividad de la membrana para distinguir
entre péptidos específicos o grupos de péptidos.

2.6 Analytical methods

Hydrolysates, retentates and permeates chromatographic profiles were obtained using a
Jupiter C18 (5 mm, 4.6 150 mm) column (Phenomenex, Torrance, CA, USA), installed
within a highperformance liquid chromatograph (HPLC) Agilent 1200 series (Agilent
technologies, Santa Clara, CA, USA). The data-processing software was ChemStation for LC
3D systems (Agilent). Samples were filtered with 0.45 mm cellulose acetate syringe filters
(Phenomenex) before injection. The chromatographic runs were performed at 25 C of
temperature and a flow rate of 1 mL/min. Solvent A was composed of 0.1% (v/v) TFA in
ultrapure water, and solvent B consisted of 0.1% (v/v) TFA in ACN. The linear gradient
chosen was: 10% B for 1 min, 10e30% B in 49 min, 30e70% B in 10 min, 70e90% B in 5 min
and 90% B for 5 min. The elution was monitored at 214 nm. Peaks were separated and
isolated utilizing a Varian ProStar HPLC system (Palo Alto, CA, USA) equipped with a
fraction collector (Model 701). The data-processing software was Galaxie
Chromatrography Data System (Varian). Samples were fed onto a XBridge BEH 130 Prep
C18 (OBD 10 mm 19 250 mm) column (Waters, Dublin, Ireland). The analyses were as with
the analytical equipment, with the exception of the flow rate (10 mL/min), the
temperature (ambient), the injection (manual, using a 2 mL loop), and the linear gradient
(5%e20% B in 30 min, 20%e25% B in 50 min and 25%e60% B in 10 min). Fractions were
collected and stored at 40 °C until further analyses.
For each isolated fraction, reverse phase ultra performance liquid chromatography (RP-
UPLC) coupled to mass spectrometry (LC-MS) analyses were performed on an Agilent 1200
infinity system connected on-line to an Agilent 6460 triple quadrupole mass spectrometer.
The column used was an Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (1.8 mm 2.1 50 mm). Solvent A
was composed of ultrapure water with 0.1% formic acid. Solvent B was composed of ACN
with 0.1% formic acid. Gradient ranged from 20% to 80% B in 8 min. Mass spectra were
acquired in the positive ion mode using a 120 V fragmentation with a scan range of
100e2000 m/z. Nitrogen was used both as the drying gas at flow rate of 5.0 L/min and a
temperature of 300 C and as the nebulizer gas at a pressure of 0.31 MPa. The capillary
voltage was set at 4000 V. The peptide masses obtained with the MS analysis were fed into
the ExPASy FindPept database (ca.expasy.org/tools/findpept. html). FindPept displays all
possible peptide masses and their corresponding amino acid sequences resulting from
both specific and non-specific cleavage of a known protein by a known enzyme. The
program compares the experimental peptide masses to the theoretical ones, matching the
similar and thus allowing identification. Unassigned masses are also indicated. For the
FindPept analyses, mass tolerance limit was set to 0.3 Da, and minimum peptide sequence
length to 3 amino acids. In order to know which one of the identified peptide sequences
had reported bioactivity, a search was performed through bibliography and using BIOPEP
database (Minkiewicz et al., 2008), which provides a collection of bioactive peptide
sequences with any reported activity. Peptide sequences GRAVY (average hydropathy
score) and isoelectric points (pI) values were calculated with the ExPASy ProtParam tool
(http://www.expasy.ch/tools/protparam-doc.html).

Métodos analíticos
Los perfiles hidrolizados, retenidos e infiltrados se obtuvieron utilizando una columna
Jupiter C18 (5 mm, 4,6 150 mm) (Phenomenex, Torrance, CA, EE. UU.), Instalada dentro de
un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento (HPLC) serie Agilent 1200 (tecnologías
Agilent, Santa Clara , CA, USA). El software de procesamiento de datos era ChemStation
para sistemas LC 3D (Agilent). Las muestras se filtraron con filtros de jeringa de acetato de
celulosa de 0,45 mm (Phenomenex) antes de la inyección. Los ensayos cromatográficos se
realizaron a 25ºC de temperatura y a un caudal de 1 ml / min. El disolvente A estaba
compuesto de TFA al 0,1% (v / v) en agua ultrapura, y el disolvente B consistía en TFA al
0,1% (v / v) en ACN. El gradiente lineal elegido fue: 10% B durante 1 min, 10e30% B en 49
min, 30e70% B en 10 min, 70e90% B en 5 min y 90% B durante 5 min. La elución se
controló a 214 nm. Los picos se separaron y aislaron utilizando un sistema Varian ProStar
HPLC (Palo Alto, CA, EE. UU.) Equipado con un colector de fracciones (Modelo 701). El
software de procesamiento de datos fue Galaxie Chromatrography Data System (Varian).
Las muestras se alimentaron a una columna XBridge BEH 130 Prep C18 (OBD 10 mm 19
250 mm) (Waters, Dublín, Irlanda). Los análisis fueron como con el equipo analítico, con la
excepción de la velocidad de flujo (10 ml / min), la temperatura (ambiente), la inyección
(manual, utilizando un bucle de 2 ml) y el gradiente lineal (5% e20%) B en 30 min, 20%
e25% B en 50 min y 25% e60% B en 10 min). Las fracciones se recogieron y almacenaron a
40 ° C hasta análisis adicionales.
Para cada fracción aislada, se realizaron análisis de cromatografía líquida de ultrafunción
de fase inversa (RP-UPLC) acoplados a espectrometría de masas (LC-MS) en un sistema de
infinidad Agilent 1200 conectado en línea a un espectrómetro de masas de triple
cuadrupolo Agilent 6460. La columna utilizada fue Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (1,8 mm
2,1 50 mm). El solvente A estaba compuesto de agua ultrapura con 0.1% de ácido fórmico.
El solvente B estaba compuesto de ACN con 0.1% de ácido fórmico. El gradiente varió de
20% a 80% B en 8 min. Los espectros de masas se adquirieron en el modo de ion positivo
usando una fragmentación de 120 V con un rango de exploración de 100e2000 m / z. Se
usó nitrógeno como el gas de secado a una velocidad de flujo de 5,0 l / min y una
temperatura de 300ºC y como gas nebulizador a una presión de 0,31 MPa. El voltaje
capilar se ajustó a 4000 V. Las masas peptídicas obtenidas con el análisis MS se
introdujeron en la base de datos ExPASy FindPept (ca.expasy.org/tools/findpept. Html).
FindPept muestra todas las masas peptídicas posibles y sus correspondientes secuencias
de aminoácidos resultantes de la escisión específica y no específica de una proteína
conocida por una enzima conocida. El programa compara las masas peptídicas
experimentales con las teóricas, haciendo coincidir las similares y permitiendo así la
identificación. Las masas no asignadas también están indicadas. Para los análisis FindPept,
el límite de tolerancia de masa se estableció en 0,3 Da, y la longitud mínima de secuencia
de péptido en 3 aminoácidos. Para conocer cuál de las secuencias peptídicas identificadas
había informado de bioactividad, se realizó una búsqueda a través de bibliografía y
utilizando la base de datos BIOPEP (Minkiewicz et al., 2008), que proporciona una
colección de secuencias de péptidos bioactivos con cualquier actividad informada. Se
calcularon las secuencias peptídicas GRAVY (puntuación media de hidropatía) y los puntos
isoeléctricos (pI) con la herramienta ExPASy ProtParam
(http://www.expasy.ch/tools/protparam-doc.html).

2.7. Statistical analyses

All hydrolysis, membranes and analytic experiments were performed in duplicate. The data
obtained were reported as mean ± error. Analysis of variance (One-Way ANOVA) was
carried out to assess whether the differences between groups or experiments were
statistically significant, using StatPlus:Mac (AnalystSoft Inc., Walnut,). The significance level
was established for P < 0.05.

Análisis estadístico

Todas las hidrólisis, membranas y experimentos analíticos se realizaron por duplicado. Los
datos obtenidos se informaron como media ± error. El análisis de varianza (ANOVA de una
vía) se llevó a cabo para evaluar si las diferencias entre los grupos o experimentos eran
estadísticamente significativas, utilizando StatPlus: Mac (AnalystSoft Inc., Walnut,). El nivel
de significancia se estableció para P <0.05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3. Results and discussion

3.1. Tryptic hydrolysis of WPC

The DH as a function of time during WPC trypsinolysis is shown in Fig. 1. The maximum DH
reached after 360 min of hydrolysis was of 4.73 ± 0.17% on average. This meant a 44.22 ±
1.62% of the DHmax the for the system WPC-trypsin. The DH increased with digestion
time. However, the increase was very fast over the first 30 min, while during the rest of the
hydrolysis time the slope of the curve decreased steadily, finally remaining almost constant
for the last 2 h. The relatively low DH reached is not an unusual result, and is explained
because of the globular nature of some whey proteins, as for example a-la, which can
hinder potential cleavage sites (Adjonu et al., 2013). Ferreira et al. (2007) only obtained a
4.2% DH when hydrolysing WPC with trypsin for 180 min with a higher ratio E/S. A low DH
is in any case sufficient for bioactive peptides production, as it has been demonstrated
that low-intermediate DH values lead to significant bioactivities. For instance, Mullally et
al. (1997) obtained ACE inhibitory hydrolysates of WPC with only a 3% DH, and increasing
to 8% did not result in an increase of the ACE inhibitory activity.

3. Resultados y discusión

3.1. Hidrólisis tríptica de WPC

La DH en función del tiempo durante la tripsinólisis de WPC se muestra en la Fig. 1. La DH

máxima alcanzada después de 360 min de hidrólisis fue de 4.73 ± 0.17% en promedio. Esto
significó un 44.22 ± 1.62% del DHmax para el sistema WPC-tripsina. El DH aumentó con el
tiempo de digestión. Sin embargo, el aumento fue muy rápido durante los primeros 30
min, mientras que durante el resto del tiempo de hidrólisis, la pendiente de la curva
disminuyó constantemente, permaneciendo casi constante durante las últimas 2 h. El DH
relativamente bajo alcanzado no es un resultado inusual, y se explica debido a la
naturaleza globular de algunas proteínas de suero de leche, como por ejemplo a-la, que
puede obstaculizar sitios potenciales de escisión (Adjonu et al., 2013). Ferreira et al. (2007)
solo obtuvieron un 4,2% DH al hidrolizar WPC con tripsina durante 180 min con una
relación E / S más alta. Un DH bajo es en cualquier caso suficiente para la producción de
péptidos bioactivos, ya que se ha demostrado que los valores de DH intermedios bajos
conducen a bioactividades significativas. Por ejemplo, Mullally et al. (1997) obtuvieron
hidrolizados inhibidores de ECA de WPC con solo un 3% de DH, y el aumento al 8% no dio
como resultado un aumento de la actividad inhibidora de ACE.

3.2. Characterization of the hydrolysate

The WPH was analysed by semi-preparative HPLC. 16 peaks were isolated to perform over
them LC-MS analyses. Only the HPLC peaks that had an area that accounted for more than
the 10% of the total were considered, so as to avoid errors derived from the baseline
noise; and mass signals that accounted for less than the 10% of the total were not
considered for the LC-MS analyses. The WPH chromatogram is shown in Fig. 2. A total of
48 masses were detected among the 16 hydrolysate peaks, and it was possible to assign 42
of them to peptide sequences. The peptide sequences corresponding to each peak are
listed in Table 1, plus some relevant physicochemical characteristics.

A 68.18% of the peptide sequences corresponded to fragments of b-lg, 18.18% derived

from a-la, 11.36% were from BSA and 2.27% belonged to LF. In order to find out the
degree in which each protein was hydrolysed, WPH samples at time zero (before enzyme
addition) and after 360 min were analysed by RP-HPLC (chromatograms not shown). b-lg
and a-la peaks were integrated. BSA and LF peaks were not integrated because their
extremely small area and because they are minority proteins in a WPC. Over the course of
the hydrolysis, the b-lg peak almost disappeared, while the one corresponding to a-la only
showed a 14% area reduction. Consequently, not only b-lg derived peptides were more
frequent because it was the protein in higher concentration in the WPC, but also because
it was almost completely hydrolysed by trypsin. a-la, on the contrary, was much more
resistant to the enzyme action. The existing literature about whey proteins trypsinolysis is
controversial. Mota et al. (2006) and Ferreira et al. (2007) hydrolysed WPC with trypsin
and they both achieved a complete and fast hydrolysis of a-la, in contrast with that much
more slower of b-lg, in spite of the fact that a-la has been described as noticeably resistant
to trypsin action (Cheison et al., 2012; Schmidt and Poll, 1991). On the contrary, other
authors have reported that a-la on whey is only hydrolysed by trypsin when b-lg is almost
totally degraded (Konrad and Kleinschmidt, 2008). This current work supports the latter
study. The cause of the low yield in BSA-derived peptides is its low concentration in the
WPC (8%), as no mention of a special resistance of BSA against trypsin was found on the
literature.

Of the 42 identified peptides, 15 were acidic (pI < 5), 13 were basic (pI > 7) and 14 were
neutral (5 < pI < 7) (see Table 1). Amongst the identified peptides, the ones that were
previously reported as bioactive in the bibliography are presented in Table 2. They
represented the 16.7% of all the peptides identified in the WPH, so the need for a
separation process for enriching bioactive peptide content resulted evident. To the best of
our knowledge, the rest of the sequences have not been assayed yet for their bioactivity.
With the exception of VAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLR, which was acidic, all the rest of
the bioactive peptides were basic or neutral. Even though the intermediate DH, a
symptom of excessive digestion was found for one bioactive peptide (ALPMHIR), that was
further digested by trypsin or fragmented, as evidenced by the portions also found (ALPM,
HIR, PMHIR). However, the existence of peptides with missed cleavages, such as
IAEKKADAVTLDGGM, also meant incomplete hydrolysis. This situation highlights the diffi-
culty of finding an optimum DH for the highest yield in peptides with bioactivity.
Nevertheless, some of the peptides containing missed cleavages were precursors of
bioactive peptides. For example, TKIPAVFK of IPAVFK, and IIAEKTKIP of IIAEK. Hence, if
carefully optimising hydrolysis conditions, these peptides could turn into the bioactive
ones, improving the bioactive peptide yield. Further research into DH optimisation could
be of interest.

The b-lg derived peptides that possessed bioactivity (see Table 2) were the classical ones
that can be found in a b-lg tryptic hydrolysate. Moreover, some other peptides identified
with no confirmed bioactivity were also coincident with the ones found in other works. As
an example, Lapointe et al. (2005a) also identified the peptides HIR, FDK, LIVTQMK,
TKIPAVF, LSFNPTQLEEQCHI or SLAMAASDISLLDAQSAPLR. With regard to the peptides
derived from a-la, the peptide ILDKVGINYWLAHKALCSEKLDQWLCEK corresponded to a big
fragment of the C-terminal side of the protein. This fragment contains peptides that are
normally found in an a-la tryptic hydrolysate, such as WLAHK, ALCSEK or KILDK (Tulipano et
al., 2015). Since the hydrolysis was only in the initial steps (See 3.2), they appear still
bound to each other. Hence, this fragment is cut first by the enzyme, and then more easily
attacked in subsequent hydrolysis steps so as to produce the aforementioned final
peptides. ELK and DLK are common products of trypsin hydrolysis as they end in the amino
acid lysine (K). The rest of the peptides are the result of unspecific cleavage, as they are
not ending in K or arginine (R). Although these peptides were not found in other works,
Demers-Mathieu et al. (2013) also reported peptides from a- la trypsinolysis that were not
the result of an specific cleavage.

3.2. Caracterización del hidrolizado

El WPH se analizó mediante HPLC semipreparativa. Se aislaron 16 picos para realizar sobre
ellos análisis de LC-MS. Solo se consideraron los picos de HPLC que tenían un área que
representaba más del 10% del total, a fin de evitar errores derivados del ruido de
referencia; y las señales de masa que representaron menos del 10% del total no se
consideraron para los análisis LC-MS. El cromatograma WPH se muestra en la Fig. 2. Se
detectó un total de 48 masas entre los 16 picos hidrolizados, y fue posible asignar 42 de
ellos a las secuencias peptídicas. Las secuencias peptídicas correspondientes a cada pico se
enumeran en la Tabla 1, más algunas características fisicoquímicas relevantes.

Un 68.18% de las secuencias peptídicas correspondía a fragmentos de b-Ig, 18.18%

derivado de a-la, 11.36% eran de BSA y 2.27% pertenecían a LF. Con el fin de averiguar el
grado en que cada proteína se hidrolizó, las muestras de WPH en el tiempo cero (antes de
la adición de la enzima) y después de 360 min se analizaron mediante RP-HPLC (no se
muestran los cromatogramas). picos b-lg y a-la fueron integrados. Los picos de BSA y LF no
se integraron debido a su área extremadamente pequeña y porque son proteínas
minoritarias en un WPC. En el transcurso de la hidrólisis, el pico b-lg casi desapareció,
mientras que el correspondiente a a-la mostró una reducción del área del 14%. En
consecuencia, no solo los péptidos derivados de b-Ig eran más frecuentes porque era la
proteína en mayor concentración en el WPC, sino también porque estaba casi
completamente hidrolizada por la tripsina. a-la, por el contrario, era mucho más resistente
a la acción enzimática. La literatura existente sobre la tripsinólisis de las proteínas del
suero de leche es controvertida. Mota et al. (2006) y Ferreira et al. (2007) hidrolizaron
WPC con tripsina y ambos lograron una hidrólisis completa y rápida de a-la, en contraste
con la mucho más lenta de b-lg, a pesar del hecho de que a-la se ha descrito como
notablemente resistente a la acción de la tripsina (Cheison et al., 2012; Schmidt y Poll,
1991). Por el contrario, otros autores han informado que a-la en el suero de leche solo es
hidrolizado por tripsina cuando b-lg está casi totalmente degradado (Konrad y
Kleinschmidt, 2008). Este trabajo actual apoya el último estudio. La causa del bajo
rendimiento en péptidos derivados de BSA es su baja concentración en el WPC (8%), ya
que no se encontró ninguna mención de una resistencia especial de BSA contra la tripsina
en la literatura.

De los 42 péptidos identificados, 15 fueron ácidos (pI <5), 13 fueron básicos (pI> 7) y 14
fueron neutros (5 <pI <7) (véase la Tabla 1). Entre los péptidos identificados, los que se
informaron anteriormente como bioactivos en la bibliografía se presentan en la Tabla 2.
Representaban el 16,7% de todos los péptidos identificados en la WPH, por lo que la
necesidad de un proceso de separación para enriquecer el contenido de péptido bioactivo
resultó evidente . Hasta donde sabemos, el resto de las secuencias aún no se han evaluado
para determinar su bioactividad. Con la excepción de VAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLR,
que era ácido, el resto de los péptidos bioactivos eran básicos o neutros. Aunque el
intermedio DH, un síntoma de digestión excesiva se encontró para un péptido bioactivo
(ALPMHIR), que fue digerido adicionalmente por tripsina o fragmentado, como lo
demuestran las porciones también encontradas (ALPM, HIR, PMHIR). Sin embargo, la
existencia de péptidos con divisiones omitidas, tales como IAEKKADAVTLDGGM, también
significaba hidrólisis incompleta. Esta situación resalta la dificultad de encontrar un DH
óptimo para el mayor rendimiento en péptidos con bioactividad. Sin embargo, algunos de
los péptidos que contenían divisiones omitidas eran precursores de péptidos bioactivos.
Por ejemplo, TKIPAVFK de IPAVFK y IIAEKTKIP de IIAEK. Por lo tanto, si se optimizan
cuidadosamente las condiciones de hidrólisis, estos péptidos podrían convertirse en los
bioactivos, mejorando el rendimiento del péptido bioactivo. Puede ser interesante realizar
más investigaciones sobre la optimización de DH.

Los péptidos derivados de b-Ig que poseían bioactividad (véase la Tabla 2) fueron los
clásicos que se pueden encontrar en un hidrolizado tríptico b-1g. Además, algunos otros
péptidos identificados sin bioactividad confirmada también fueron coincidentes con los
encontrados en otros trabajos. Como ejemplo, Lapointe et al. (2005a) también
identificaron los péptidos HIR, FDK, LIVTQMK, TKIPAVF, LSFNPTQLEEQCHI o
SLAMAASDISLLDAQSAPLR. Con respecto a los péptidos derivados de a-la, el péptido
ILDKVGINYWLAHKALCSEKLDQWLCEK correspondía a un gran fragmento del lado C-
terminal de la proteína. Este fragmento contiene péptidos que normalmente se
encuentran en un hidrolizado tríptico a-la, como WLAHK, ALCSEK o KILDK (Tulipano et
al.,2015). Como la hidrólisis solo se realizó en los pasos iniciales (ver 3.2), aún parecen
estar unidos entre sí. Por lo tanto, este fragmento se corta primero mediante la enzima, y
luego se ataca más fácilmente en etapas de hidrólisis posteriores para producir los
péptidos finales mencionados anteriormente. ELK y DLK son productos comunes de la
hidrólisis de tripsina ya que terminan en el aminoácido lisina (K). El resto de los péptidos
son el resultado de la escisión inespecífica, ya que no terminan en K o arginina (R). Aunque
estos péptidos no se encontraron en otros trabajos, Demers-Mathieu et al. (2013) también
informaron péptidos de a tripsina tripsina que no fueron el resultado de una escisión
específica.

3.3. Membrane fractionation of the WPH

Figs. 3 and 4 illustrate the peptides found in the WPH that were able (or not) to pass to the
PES5 or PES1 permeates respectively. The dotted bars reflect the Trtheo calculated with
Eq. (3) (See 2.5.3), whereas the solid bars correspond to the Trobs values at each pH value,
calculated with Eq. (2) (See 2.5.3). It was possible to calculate the peptides Trobs because,
due to the low number of peptides transmitted, the peaks resolution in permeates
chromatograms was good, and only one or maximum two peptide masses were present
with enough signal in each peak (chromatograms not shown). An absent solid bar denotes
zero Tr, which signifies that the peptide was not detected in the corresponding permeate
or the signal was too low. Each peptide sequence is written on the X-axis, and each peptide
MW is represented over the Tr bars. The peptides are grouped by their pI values, and each
group is arranged by MW in ascending order.

Both membranes are made of the same material and are known to have the same charge,
at least on the pH interval from 3 to 10 (Susanto and Ulbricht, 2005). The negative zeta
potential (z) value becomes lower when lowering the pH, until pH 4, when the membrane
charge becomes zero.

Unhydrolysed protein was not detected in permeate streams due to its high molecular
weight compared with the membrane NMWCO. If comparing Figs. 3 and 4, it is interesting
to note that, even though the membranes markedly different NMWCO, the peptides
transmitted across them were almost the same. The three peptides that were not
coincident in both permeates had the amino acid sequences ALPMHIR, TKIPAVFK and
SLAMAASDISLLDAQSAPLR. Obviously, the last was simply too big for PES1 membrane pores
(around 2 kDa); however, for the former, the reasons are not so clear and will be further
discussed. Two reasons justify the fact that both membranes showed a very similar sieve
effect. On the one hand, manufacturers are known to sometimes report inaccurate
membrane NMWCO (Butylina et al., 2006), and thus real pore sizes could have been more
similar than reported. On the other hand, a polarized layer was formed over the
membranes surface, as evidenced by the observed flux reduction over time (results not
shown) during the filtration experiments on both membranes at the three pH values used.
This layer performed over both membranes an additional and similar sieve effect (Butylina
et al., 2006). Although almost the same peptides crossed both membranes, the Trobs
values were lower for the PES1 membrane, because lower were the fluxes (2.0 L/hm2 for
the PES1 membrane and 10.6 L/hm2 for the PES5 membrane, on average). The average
Trobs values for the PES5 membrane were between 4.37% and 90.84% for basic peptides
and between 5.01% and 85.58% for neutral ones; and for the PES1 membrane Trobs were
between 8.62% and 43.15% and 5.97% and 39.52% respectively.

If only considering size, every single peptide found in the WPH had a sufficiently low MW
to go through the PES5 membrane pores. However, just 14 peptides were detected in the
permeate stream (see Figs. 3 and 4). In contrast, merely 21 of the 43 peptides present in
the WPH were theoretically able to cross the PES1 membrane because of their MW.
However, 11 were found in the permeates. Also, there was a MW limit by which the
peptides bigger than a certain number of Da never crossed the membrane. This limit was
the same for both membranes, and it took the value of 1246.40 Da, if not considering
SLAMAASDISLLDAQSAPLR. On the other hand, there were peptides that were not detected
in any permeate, even though they were smaller than the membrane pores. The fact that
not every peptide theoretically able crosses a membrane has already been found in the
literature Groleau et al. (2004).

Another interesting result in this current work was that two peptides with bigger MW than
the NMWCO of the PES1 membrane (DKPLLEKSH and KIWCKDDQNP) appeared in the
permeates, although the Trobs values were relatively low (5.97 and 11.08% respectively
when best transmitted). There are two reasons to explain this fact. On the one hand, those
peptides MW was only slightly higher than the NMWCO (1066.22 Da for DKPLLEKSH and
1246.4 Da for KIWCKDDQNP). On the other hand, peptides in solution usually fold into
vaguely globular shapes, but not necessarily spherical. They can be closer to an ellipsoid or
even a cigar shape (Cheryan, 1998). Consequently, their MW is not exactly representative
of their real size or shape.

Other interesting result is that peptides Trobs was different (higher or lower) than the
Trthe, and that it varied with pH. The variation was the same for both membranes, with
the exception of the already mentioned peptides (see Section 3.3) that were not
transmitted through the PES1 membrane, and the peptide LIVTQTMK. So size was not the
only parameter determining separation but also pH, and therefore, peptide charge. This
result is coincident with several works (Fernandez et al., 2014; Groleau et al., 2004;
Lapointe et al., 2003; Martin-Orue et al., 1998). Consequently, not only the peptides
transmitted were almost the same in both membranes but also they behaved in the same
way with pH variations.
Considering peptides group, it can be seen in Figs. 3 and 4 that each group behaved
differently with pH. The acidic peptides were always rejected, with the exception of
SLAMAASDISLLDAQSAPLR in the PES5 membrane, which had the same Trobs for the three
pH values, but all very low. The neutral peptides Trobs were pH6>pH8>pH2. The basic
peptides Trobs were pH8>pH6>pH2, with the exception of TKIPAVFK, and LIVTQTMK in the
PES1 membrane. The peptide TKIPAVFK has already been reported to behave differently
than others of the same group, being better transmitted at pH6 than at pH8 (Fernandez et
al., 2013 ). The peptide LIVTQTMK is the only one that, appearing in both permeates,
behaves differently with pH, and the reason remains uncertain. Further filtration assays
may enlighten its behaviour.

The different Trobs with pH depending on the peptide group are explained by a
combination of the Donnan theory and the principle of electroneutrality. The convective
flow towards the membrane during filtration generates an excess of charged species near
the membrane surface. As already stated (See 3.3), membrane charge at pH8 and 6 is
negative. Negatively charged peptides undergo an electromigrative flow away from the
membrane due to the electrostatic repulsive forces between them and the membrane
surface. At pH8 and 6, all acidic peptides were negatively charged, and were thus repelled.
This explains their almost null Trobs, moreover taking into account that they were far from
their pI and thus their charge values were relatively high (2 at pH6 and 3 at pH8 on
average) (see Table 1). Same trend to reject acidic peptides at basic pH values has been
observed for negatively charged membranes by several authors (Fernandez et al., 2013,
2014; Lapointe et al., 2005b; Pouliot et al., 2000; Pouliot et al., 1999). In the current work,
at pH8 and 6, basic and neutral peptides were both near their pI, and as a consequence,
they had a net charge near zero. This caused their higher transmissions compared to those
of the acidic peptides, higher even than the expected because of their size, since it is a well
known fact that peptides reach maximum Tr values when the pH of the medium is close to
their pI (Burns and Zydney, 1999; Huisman et al., 2000). Although near zero, neutral
peptides had a slight negative charge at pH8 (0.7 on average) and zero net charge at pH6.
This is why they were more transmitted at pH6 than at pH8. Basic peptides had a net
charge near zero at pH8 (0.8 on average) and slightly positive at pH6 (1.5). The fact that
these peptides were positively charged at pH6 when the membranes had negative charge
did not favour Tr as expected, but lowered it. In fact, basic peptides were more transmitted
when their net charge was near zero, this is, pH8. Fernandez et al. (2013) also found this
behaviour when filtering a b-lg hydrolysate through a 5 kDa PES membrane at these pH
values, and they also explained their results with the aid of the Donnan theory. Since the
counterions of the positively charged peptides are rejected away from the membrane by
electrostatic forces, the positively charged peptides also have to be repelled in order to
maintain electroneutrality, both in the membrane boundaries and in the bulk solution.
 At pH2, the Trobs values for both membranes were in general low compared to those at
the pH values around peptides pI, and even lower than the expected theoretical values for
the PES5 membrane. Charge effects also explain the general behaviour of peptides
through the membranes at pH2. At this pH value, the membranes charge was around zero
or even positive (Burns and Zydney, 1999), and the polarized layer charge also positive.
Additionally, all the peptides were positively charged independently of their group (see
Table 1). Moreover, average charges at pH2 were the same for the three groups. Therefore,
electrostatic repulsion between them and the membrane surface was responsible for the
general low Tr values. Only the peptides that were transmitted at other pH values were
transmitted at pH2. This suggests that there is something apart from the charge and the
size that determines whether a peptide is transmitted or not. Charge effects can explain
the different Tr between groups and Tr variations at different pH values. However, only
certain peptides among others of the same size and charge were transmitted across both
membranes. The peptide QIKK has a MW between ALK and PMHIR, both transmitted (see
Figs. 3 and 4).

However, QIKK was rejected by both membranes at every pH value. This peptide has two
positively charged residues on one side. Among the transmitted peptides, there was none
with that configuration. So, even though its net charge was similar to that of others
transmitted, the charge distribution was different. The peptide APLRVYV has a MW
between IPAVFK and ALPMHIR, also both transmitted. It was noticed that all the peptides
transmitted had one polar amino acid on at least one side. However, APLRVYV has apolar
peptides on both sides. So rather the distribution than the whole peptide polarity
influenced Tr. Distribution also explains the Tr of SLAMAASDISLLDAQSAPLR, the only
transmitted peptide of the acidic group, because it is the only one with MW below 1 kDa
that has a positive amino acid on one side.

The reason why this peptide was equally transmitted at the three pH values used could be
its extremely high hydrophobicity (see Table 1). The hydrophobic interactions that
adsorbed it to the membrane or the polarized layer could have been stronger than the
electrostatic ones. The configuration positive peptide on one side and uncharged peptide
on the other side favoured the Tr, as 12 of the 14 transmitted peptides in the PES5
membrane (86%) and 8 of the 11 transmitted peptides in the PES1 membrane (73%) did
have it. The rejection of DLK, ELK and ALPM is explained also attending to their
configuration. DLK and ELK have a strong dipole character, different from the peptides that
permeated. The case of ALPM is similar to that of APLRVYV. The possible influence of the
charge distribution on the Tr was previously pointed out by Martin-Orue et al. (1998) and
Pouliot et al. (1999), who demonstrated that two peptides differing in just one amino acid
were differently transmitted, yet these studies were performed with simple peptide
mixtures.

3.3. Fraccionamiento de membranas de la WPH

Figs. 3 y 4 ilustran los péptidos encontrados en la WPH que pudieron (o no)

pasar a PES5 o PES1 impregnado respectivamente. Las barras de puntos
reflejan el Trtheo calculado con Eq. (3) (Véase 2.5.3), mientras que las barras
sólidas corresponden a los valores de Trobs en cada valor de pH, calculado
con Eq. (2) (Ver 2.5.3). Fue posible calcular los péptidos Trobs porque, debido
al bajo número de péptidos transmitidos, la resolución de los picos en los
cromatogramas saturados fue buena, y solo estaban presentes una o dos
masas peptídicas con señal suficiente en cada pico (no se muestran los
cromatogramas). Una barra sólida ausente denota cero Tr, lo que significa que
el péptido no se detectó en el permeado correspondiente o que la señal era
demasiado baja. Cada secuencia peptídica está escrita en el eje X, y cada
péptido MW está representado sobre las barras Tr. Los péptidos se agrupan
por sus valores de pI, y cada grupo se organiza por MW en orden ascendente.

Ambas membranas están hechas del mismo material y se sabe que tienen la
misma carga, al menos en el intervalo de pH de 3 a 10 (Susanto y Ulbricht,
2005). El valor negativo del potencial zeta (z) disminuye al bajar el pH, hasta
pH 4, cuando la carga de la membrana se vuelve cero.

La proteína no hidrolizada no se detectó en las corrientes de permeado

debido a su alto peso molecular en comparación con la membrana NMWCO.
Si se comparan las Figs. 3 y 4, es interesante observar que, a pesar de que las
membranas son muy diferentes NMWCO, los péptidos transmitidos a través
de ellos eran casi lo mismo. Los tres péptidos que no fueron coincidentes en
ambos permeados tenían las secuencias de aminoácidos ALPMHIR, TKIPAVFK
y SLAMAASDISLLDAQSAPLR. Obviamente, el último era simplemente
demasiado grande para los poros de la membrana PES1 (alrededor de 2 kDa);
sin embargo, para el primero, las razones no son tan claras y se seguirán
discutiendo. Dos razones justifican el hecho de que ambas membranas
mostraron un efecto de tamiz muy similar. Por un lado, se sabe que los
fabricantes a veces informan una membrana NMWCO inexacta (Butylina et
al., 2006), y por lo tanto, los tamaños reales de los poros podrían haber sido
más similares de lo que se informó. Por otro lado, se formó una capa
polarizada sobre la superficie de las membranas, como se evidencia por la
reducción de flujo observada a lo largo del tiempo (resultados no mostrados)
durante los experimentos de filtración en ambas membranas a los tres
valores de pH utilizados. Esta capa realizó sobre ambas membranas un efecto
tamiz adicional y similar (Butylina et al., 2006). Aunque casi los mismos
péptidos cruzaron ambas membranas, los valores de Trobs fueron más bajos
para la membrana PES1, porque menores fueron los flujos (2.0 L / hm2 para
la membrana PES1 y 10.6 L / hm2 para la membrana PES5, en promedio). Los
valores promedio de Trobs para la membrana PES5 estuvieron entre 4.37% y
90.84% para los péptidos básicos y entre 5.01% y 85.58% para los neutros; y
para la membrana PES1, los tropos se encontraban entre 8.62% y 43.15% y
5.97% y 39.52% respectivamente.

Si solo se considera el tamaño, cada péptido encontrado en la WPH tiene un

MW lo suficientemente bajo como para atravesar los poros de la membrana
PES5. Sin embargo, solo se detectaron 14 péptidos en la corriente de
permeado (véanse las figuras 3 y 4). En contraste, solo 21 de los 43 péptidos
presentes en el WPH teóricamente fueron capaces de cruzar la membrana
PES1 debido a su MW. Sin embargo, 11 fueron encontrados en los
permeados. Además, había un límite de MW por el cual los péptidos más
grandes que un cierto número de Da nunca cruzaban la membrana. Este
límite fue el mismo para ambas membranas, y tomó el valor de 1246.40 Da, si
no está considerando SLAMAASDISLLDAQSAPLR. Por otro lado, había
péptidos que no se detectaron en ningún permeado, a pesar de que eran más
pequeños que los poros de la membrana. El hecho de que no todos los
péptidos teóricamente capaces atraviesan una membrana ya se ha
encontrado en la literatura de Groleau et al. (2004)

Otro resultado interesante en este trabajo actual fue que dos péptidos con
mayor MW que el NMWCO de la membrana PES1 (DKPLLEKSH y
KIWCKDDQNP) aparecieron en los permeados, aunque los valores de Trobs
fueron relativamente bajos (5,97 y 11,08% respectivamente cuando se
transmitieron mejor). Hay dos razones para explicar este hecho. Por un lado,
esos péptidos MW solo eran ligeramente más altos que el NMWCO (1066.22
Da para DKPLLEKSH y 1246.4 Da para KIWCKDDQNP). Por otro lado, los
péptidos en solución generalmente se pliegan en formas vagamente
globulares, pero no necesariamente esféricas. Pueden estar más cerca de una
forma de elipsoide o incluso de un cigarro (Cheryan, 1998). En consecuencia,
su MW no es exactamente representativo de su tamaño o forma real.

Otro resultado interesante es que los péptidos Trobs eran diferentes (más
altos o más bajos) que los Trthe, y que variaban con el pH. La variación fue
la misma para ambas membranas, con la excepción de los péptidos ya
mencionados (ver Sección 3.3) que no se transmitieron a través de la
membrana PES1, y el péptido LIVTQTMK. De modo que el tamaño no fue el
único parámetro que determinó la separación, sino también el pH y, por lo
tanto, la carga de péptido. Este resultado es coincidente con varios trabajos
(Fernandez et al., 2014; Groleau et al., 2004; Lapointe et al., 2003; Martin-
Orue et al., 1998). En consecuencia, no solo los péptidos transmitidos
fueron casi iguales en ambas membranas sino que también se comportaron
de la misma manera con las variaciones de pH.

Considerando el grupo de péptidos, se puede ver en las Figs. 3 y 4 que cada

grupo se comportó de manera diferente con el pH. Los péptidos ácidos
siempre fueron rechazados, con la excepción de SLAMAASDISLLDAQSAPLR
en la membrana PES5, que tenía los mismos Trobs para los tres valores de
pH, pero todos muy bajos. Los péptidos neutros Trobs fueron pH6> pH8>
pH2. Los péptidos básicos Trobs fueron pH8> pH6> pH2, con la excepción de
TKIPAVFK, y LIVTQTMK en la membrana PES1. Ya se ha informado que el
péptido TKIPAVFK se comporta de manera diferente que otros del mismo
grupo, y se transmite mejor a pH 6 que a pH 8 (Fernandez et al., 2013). El
péptido LIVTQTMK es el único que, al aparecer en ambos permeados, se
comporta de manera diferente con el pH, y la razón sigue siendo incierta.
Otros análisis de filtración pueden aclarar su comportamiento.
Los diferentes tropos con pH que dependen del grupo de péptidos se explican
mediante una combinación de la teoría de Donnan y el principio de
electroneutralidad. El flujo convectivo hacia la membrana durante la filtración
genera un exceso de especies cargadas cerca de la superficie de la
membrana. Como ya se indicó (ver 3.3), la carga de la membrana a pH8 y 6 es
negativa. Los péptidos con carga negativa se someten a un flujo
electromigratorio de la membrana debido a las fuerzas de repulsión
electrostáticas entre ellos y la superficie de la membrana. A pH 8 y 6, todos
los péptidos ácidos estaban cargados negativamente y, por lo tanto, fueron
repelidos. Esto explica sus Trobs casi nulos, además teniendo en cuenta que
estaban lejos de su pI y por lo tanto sus valores de carga eran relativamente
altos (2 a pH6 y 3 a pH8 en promedio) (ver Tabla 1). Varios autores han
observado la misma tendencia a rechazar péptidos ácidos a valores de pH
básicos para membranas con carga negativa (Fernandez et al., 2013, 2014;
Lapointe et al., 2005b; Pouliot et al., 2000; Pouliot et al., 1999). ) En el trabajo
actual, a pH 8 y 6, los péptidos básicos y neutros estaban cerca de su pI y,
como consecuencia, tenían una carga neta cercana a cero. Esto causó sus
transmisiones más altas en comparación con las de los péptidos ácidos, más
altas que las esperadas debido a su tamaño, ya que es un hecho bien
conocido que los péptidos alcanzan valores Tr máximos cuando el pH del
medio está cerca de su pI (quemaduras y Zydney, 1999; Huisman et al., 2000).
Aunque cerca de cero, los péptidos neutros tenían una ligera carga negativa a
pH 8 (0,7 en promedio) y carga neta cero a pH 6. Esta es la razón por la cual se
transmitieron más a pH 6 que a pH 8. Los péptidos básicos tenían una carga
neta cercana a cero a pH 8 (0,8 en promedio) y ligeramente positivos a pH 6
(1,5). El hecho de que estos péptidos estuvieran cargados positivamente a pH
6 cuando las membranas tenían carga negativa no favoreció Tr como se
esperaba, pero lo redujo. De hecho, los péptidos básicos se transmitieron
más cuando su carga neta era cercana a cero, esto es, pH8. Fernandez et al.
(2013) también encontraron este comportamiento al filtrar un hidrolizado de
β-Ig a través de una membrana de PSA de 5 kDa a estos valores de pH, y
también explicaron sus resultados con la ayuda de la teoría de Donnan. Dado
que los contraiones de los péptidos con carga positiva son rechazados fuera
de la membrana por fuerzas electrostáticas, los péptidos cargados
positivamente también tienen que ser repelidos para mantener la
electroneutralidad, tanto en los límites de la membrana como en la solución a
granel.

A pH2, los valores de Trobs para ambas membranas fueron en general bajos
en comparación con los valores de pH alrededor de los péptidos pI, e incluso
menores que los valores teóricos esperados para la membrana PES5. Los
efectos de carga también explican el comportamiento general de los péptidos
a través de las membranas a pH2. A este valor de pH, la carga de las
membranas era alrededor de cero o incluso positiva (Burns y Zydney, 1999), y
la carga de la capa polarizada también era positiva. Además, todos los
péptidos se cargaron positivamente independientemente de su grupo (véase
la Tabla 1). Además, las cargas promedio a pH2 fueron las mismas para los
tres grupos. Por lo tanto, la repulsión electrostática entre ellos y la superficie
de la membrana fue responsable de los bajos valores Tr generales. Solo los
péptidos que se transmitieron a otros valores de pH se transmitieron a pH2.
Esto sugiere que hay algo aparte de la carga y el tamaño que determina si un
péptido se transmite o no. Los efectos de carga pueden explicar los diferentes
Tr entre grupos y las variaciones Tr a diferentes valores de pH. Sin embargo,
solo ciertos péptidos, entre otros del mismo tamaño y carga, se transmitieron
a través de ambas membranas. El péptido QIKK tiene un MW entre ALK y
PMHIR, ambos transmitidos (véanse las Figuras 3 y 4).

Sin embargo, QIKK fue rechazado por ambas membranas en cada valor de pH.
Este péptido tiene dos residuos cargados positivamente en un lado. Entre los
péptidos transmitidos, no había ninguno con esa configuración. Entonces, a
pesar de que su carga neta era similar a la de otros transmitidos, la
distribución de carga era diferente. El péptido APLRVYV tiene un MW entre
IPAVFK y ALPMHIR, también ambos transmitidos. Se observó que todos los
péptidos transmitidos tenían un aminoácido polar en al menos un lado. Sin
embargo, APLRVYV tiene péptidos apolares en ambos lados. Entonces, más
bien, la distribución que la polaridad peptídica total influyó en Tr. La
distribución también explica el Tr de SLAMAASDISLLDAQSAPLR, el único
péptido transmitido del grupo ácido, porque es el único con un MW por
debajo de 1 kDa que tiene un aminoácido positivo en un lado.

La razón por la cual este elemento se transmitió por igual a los tres valores de
pH podría ser su hidrofobicidad extremadamente alta (véase la Tabla 1). Las
interacciones hidrofóbicas que lo adsorbieron a la membrana o a la capa
polarizada podrían haber sido más fuertes que las electrostáticas. El péptido
de positivo es el otro, pero que 12 de los 14 péptidos transmitidos en la
membrana PES5 (86%) y 8 de los 11 péptidos transmitidos en la membrana
PES1 (73 %) sí tenido eso. El rechazo de DLK, ELK y ALPM se explica también
atendiendo a su, DLK y ELK tienen un fuerte carácter dipolar, diferente de los
péptidos que impregnan. El caso de ALPM es similar al de APLRVYV. La
posible influencia de la distribución de carga en el Trése señalada
previamente por Martin-Orue et al. (1998) y Pouliot et al. (1999), que
demostraron que los dos péptidos que difieren en un solo aminoácido se
transmitieron de forma diferente, sin embargo, estos estudios se realizaron
con mezclas de simples péptidos.
Tr ( ) =[(1−( λ · ( λ−2 ) ) )· exp ⁡(−0.7146 λ2 )] x 100(3)
2

0.4
MW
λ= ( MWCO )