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Práctica 4 - Cinética enzimática de la fosfatasa alcalina

Bioquímica Experimental (Universidad Nacional Autónoma de México)

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Universidad Nacional Autónoma de México.

Facultad de Química. Bioquímica Experimental. Depto. De Bioquímica.
Titulares: Dr. Ávila Chávez Euclides / Dra. Mendoza Rodríguez Carmen Adriana.

«Cinética enzimática de la fosfatasa alcalina»

Por: Carrizosa Muñoz Cecilia1 / Chavira Tapia Juan Miguel2 / Hernández Benítez Luis Joshua3 / Torres
Santander Fernando.4

Resumen. Resultados y discusión: De acuerdo a los ensayos

Introducción: Dado que la principal actividad de una
enzima es catalizar una reacción, se debe conocer con
precisión el qué y cómo determinados factores externos
influyen en la enzima para que pueda realizar dicha
acción de manera óptima. Los factores evaluados en el
siguiente estudio son: temperatura, pH, concentración
de sustrato y efecto de un inhibidor, además de un
previo análisis cinético del progreso de la reacción
enzimática estudiada. Se utiliza como enzima de
estudio a la fosfatasa alcalina, fosfomonoesterasa que
sirve como indicador en los procesos de pasteurización
a nivel industrial.
Objetivos: Determinar el efecto del pH, temperatura,
la concentración del sustrato y la presencia de
inhibidores sobre la enzima fosfatasa alcalina, asi como
determinar sus parámetros cinéticos KM y vmax.
Material y método: Se utiliza a la enzima fosfatasa
alcalina la cual posee como sustrato al p-
nitrofenilfosfato, para producir p-nitrofenol, el cual se
cuantificará en los ensayos de temperatura y efecto de
la concentración tanto de sustrato como inhibidor por
espectrofotometría visible.
realizados, el tiempo que se consideró trabajar la enzima
fosfatasa alcalina fue de 5 minutos, ya que en este
periodo la generación del producto sigue un
comportamiento lineal. Bajo este término, la enzima se
incubó por 5 minutos en todo estudio realizado, por lo
que el pH óptimo de trabajo de la enzima es de 10,
siendo su KM=1.04x10-4 μmol/μL cuando no hay
inhibidor y KM=2.71x10-3 μmol/μL cuando se evalúa la
actividad enzimática en presencia de un inhibidor,
teniendo en cuenta el aumento en Km y la similitud del
inhibidor con el sustrato, se puede hablar de una
inhibición competitiva mixta debido a los cambios en la
velocidad máxima obtenidos.
Conclusiones: El estudio de los factores que afectan a
la actividad enzimática de una enzima, además de la
determinación de sus parámetros cinéticos permiten que
en la industria o en la investigación se pueda aprovechar
la capacidad catalítica de en este caso la fosfatasa
alcalina.
INTRODUCCIÓN.
La fosfatasa alcalina (FA, ALP) (Ortofosfórico
monoéster fosfohidrolasa EC 3.1.3.1.) es una
fosfomonoesterasa ligada a la membrana celular,

Contacto.
Equipo 5:
1
crmcecilia@gmail.com
2
mivader.25@gmail.com
3
lujo_hebe@outlook.com
4
fernando061095@hotmail.com

1
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constituida por un grupo de isoenzimas que catalizan la
liberación de fosfato de ésteres monofosfóricos a pH
alcalino. Las fosfomonoesterasas que no tienen sustrato
específico son clasificadas como fosfatasa alcalina o ácida
según el pH óptimo al que desarrollan su actividad.
Mientras que la fosfatasa ácida funciona mejor a pH
cercano a 5.00, la fosfatasa alcalina tiene un pH óptimo
próximo a 9.00. La FA, involucrada en el transporte de
metabolitos a través de las membranas celulares, se
encuentra en casi todos los tejidos del cuerpo, pero es
mayor su presencia en el hígado, las vías biliares y los
huesos. En el adulto, la fuente principal de FA es el hígado
(fracción termoestable) mientras que el resto proviene casi
en su totalidad del hueso (fracción termolábil). Las
fosfatasas alcalinas de hueso, hígado y riñón comparten una
estructura proteica común, codificada por el mismo gen y
difieren en su contenido en hidratos de carbono. La vida
media de la isoenzima hepática es 3 días. La FA sérica
normal está formada por varias isoenzimas diferentes
procedentes de hígado, hueso placenta y menos a menudo,
de intestino delgado, las cuales pueden ser cuantificadas
por separado si es necesario para determinar la fuente de
origen de una patología. Se realiza en el contexto de otras
pruebas hepáticas GOT: transaminasa glutámico-
oxalacética, GPT: transaminasa glutámico-pirúvica,
bilirrubina, gamma-GT: gamma-Glutamiltranspeptidasa
para evaluar problemas o alteraciones del hígado y en otros
casos para diagnóstico y seguimiento de otras patologías.
Es muy sensible, sobre todo, en problemas de obstrucción
de las vías biliares. Es la enzima más sensible a los
problemas hepáticos producidos por tumores metastásicos.
Suele asociarse a la elevación de la gamma-GT, excepto
RESULTADOS.
que en los problemas óseos solo se eleva la fosfatasa
alcalina. La fosfatasa alcalina es varias veces más alta en
niños y adolescentes, alcanzando las actividades del adulto
aproximadamente a los 25 años. Los valores son
ligeramente mayores en hombres que en mujeres hasta los
últimos años de vida. En los hombres adultos, los límites
superiores del intervalo de referencia no cambian con la
edad, mientras que en las mujeres los límites superiores del
intervalo de referencia aumentan con la menopausia.
HIPÓTESIS.
La cinética enzimática de la fosfatasa alcalina se verá
afectada por distintos factores como el pH, la temperatura,
la concentración del sustrato y la presencia de inhibidores.
OBJETIVOS.
Analizar las respuestas que se observan en la velocidad
de la reacción enzimática en función de diferentes factores
como el progreso de la reacción, el pH, la temperatura, la
concentración de sustrato e inhibidores. Así mismo
establecer las condiciones de ensayo para determinar la
actividad enzimática.
MATERIAL Y MÉTODOS.
La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo
siguiendo las instrucciones del protocolo elaborado por la
M. en C. Luz del Carmen Castellanos Román el cual se
encuentra disponible en la página del departamento de
audiovisuales (http://depa.fquim.unam.mx) de la Facultad
de Química de la UNAM.

0.6

0.5

0.4
A 415nm

y = 0.0099x - 0.0009
0.3 R² = 0.9973

0.2

0.1
Figura 1. Curva de calibración de p-
nitrofenol para la determinación
0 posterior de la actividad de la
0 10 20 30 40 50 60 fosfatasa alcalina en diferentes
p-nitrofenol (nmol) ensayos.

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40

35

30
p-nitrofenol (nmol)

25

20
y = 1.2439x - 0.3492
15
R² = 0.9991
10

0
Figura 2. Progreso de la reacción
0 5 10 15 20 25 30
enzimática para la enzima
Tiempo (min) fosfatasa alcalina.

0.16

0.14

0.12
p-nitrofenol (nmol)

0.1

0.08

0.06

0.04 Figura 3. Efecto del pH sobre la

reacción enzimática llevada a
0.02 cabo por la fosfatasa alcalina
para la producción de p-
0 nitrofenol. Se observa un máximo
6 7 8 9 10 11 12 a pH 10, indicando ser el pH
óptimo de trabajo de la enzima.
pH

0.03

0.025

0.02

0.015
A 415 nm

0.01

0.005

0 Figura 4. Efecto de la
0 10 20 30 40 50 60 70 80 temperatura sobre la reacción
-0.005 enzimática llevada a cabo por la
fosfatasa alcalina
-0.01 Temperatura (°C)

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1/T (K-1)
0
0.003 0.00305 0.0031 0.00315 0.0032 0.00325 0.0033 0.00335 0.0034
-0.2
-0.4
Log Velocidad

-0.6
-0.8
y = -10156x + 32.653
-1 R² = 0.8679

-1.2
-1.4
Figura 5. Relación de
-1.6 Arrhenius para la
obtención de la energía de
-1.8 activación para la fosfatasa
Desnaturalización enzimática Tramo ascendente
alcalina.

0.0025

0.002

0.0015

0.001
V [μmol/min]

0.0005

0
0 0.0001 0.0002 0.0003 0.0004 0.0005 0.0006 Figura 6. Efecto de la
-0.0005 concentración de sustrato
e inhibidor en la actividad
-0.001
enzimática de fosfatasa
-0.0015 alcalina. Nótese que en
presencia de un inhibidor,
-0.002 la actividad de la enzima
[p-nitrofenilfosfato] [μmol/μL] disminuye.
Efecto de un inhibidor Efecto de la concentración de sustrato

1600
1400
1/v [min/μmol]

1200
1000
800
600 Figura 7. Gráfica de
Lineweaver-Burk para la
400 determinación de
200 parámetros cinéticos KM y
Vmax, con lo cual permite
0 un análisis sobre el tipo de
-10000 -5000 0 5000 10000 inhibición que
1/[p-nitrofenilfosfato] [μL/μmol] experimenta la fosfatasa
alcalina.
Sin inhibidor Con inhibidor

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Tomando en cuenta las ecuaciones de las rectas en comience la reacción en las condiciones impuestas
la Figura 7, se obtienen los siguientes datos: (condiciones óptimas).
Ensayo
KM[μmol/μL] Vmax[μmol/min]
Parámetro
Sin inhibidor 1.04x10-4 0.0025
Con inhibidor 2.71x10-3 0.0226

DISCUSIÓN.
Los ensayos enzimáticos miden la velocidad con la que
una enzima trabaja, y se determina el descenso de la
concentración de sustrato o la aparición del producto en
cuestión. En ocasiones, los ensayos enzimáticos utilizan
sustratos coloridos o productos coloridos para que así, las
concentraciones de ambos puedan ser medidas mediante el Ilustración 1. Reacción realizada en el desarrollo experimental.
uso de un espectrofotómetro. Los tipos de ensayos Conversión del p-nitrofenilfosfato a p-nitrofenol por la FA.
enzimáticos utilizados en esta práctica son del tipo
discontinuo, en los cuáles, la reacción es detenida después
de un periodo fijo de tiempo previamente determinado. - Progreso de la reacción enzimática.
Además, para poder tener este tiempo fijo, es necesario El progreso de la reacción enzimática es el parámetro
detener la reacción catalizada por la enzima, para ello, se que se utiliza para observar la cantidad de producto que una
puede contar con la adición de un agente desnaturalizante, enzima va generando a través del tiempo o en contraste
como el calor o algún cambio rápido de pH, que desactivará observar la desaparición del sustrato.
a la enzima por un cambio en su estructura química. Por
ello, en esta práctica se adicionó NaOH como agente Para nuestro ensayo en la Figura 2 es posible observar
desnaturalizante y se detuvo la reacción a un tiempo fijo (5 como al aumentar el tiempo la concentración de producto
minutos) para medir la actividad enzimática. (p-nitrofenol) también aumenta, por lo que la relación es
directamente proporcional. Esta relación no se cumple por
De igual manera, para evaluar las distintas condiciones un tiempo indeterminado, sólo ocurre en una parte del
que interfieren en la actividad de la enzima alcalina progreso de la reacción enzimática, a lo que se le llama fase
fosfatasa, se utilizó un sustrato no natural de la enzima, pero de velocidad inicial, esta velocidad inicial ocurre dentro de
que posee propiedades que lo hacen particularmente útil los primeros minutos de la reacción, generalmente esta
para este ensayo. Una de estas condiciones favorables para relación se mantiene mientras el consumo del sustrato no
el uso de la Fosfatasa Alcalina es la utilización de p- vaya más allá del 5 % de la concentración inicial. (Nelson,
nitrofenilfosfato ya que este es un reactivo incoloro, pero al 2004).
ser utilizado por la enzima se convierte en p-nitrofenol, un
reactivo de color amarillo. Aquellos sustratos que cambian El progreso de la reacción enzimática es
de color cuando son utilizados por una enzima son llamados extremadamente útil para determinar el tiempo en el cual la
“sustratos cromogénicos”. reacción enzimática tiene esta relación lineal, para el caso
de la Figura 2 (progreso de la reacción enzimática) notamos
Se observó que la absorbancia incrementa que la linealidad se mantiene por lo que para no salir de la
proporcionalmente al aumento de la producción del p- fase de la velocidad inicial que es donde debemos
nitrofenol. Pero para la cuantificación del p-nitrofenol fue enfocarnos en todos los estudios cinéticos se localizó en los
necesaria la elaboración de una curva de calibración. El primeros cinco minutos de reacción.
orden de adición de reactivos es de suma importancia en
todos los experimentos, donde se establece el medio donde Una vez que la reacción enzimática deja de seguir la
se llevará a cabo la reacción. La preincubación sirve para linealidad se produce una meseta, la cual se debe al
establecer la temperatura óptima del medio de reacción (se decremento de la concentración del sustrato,
utilizó a 37°C) para después colocar la enzima y que desnaturalización de la enzima e incluso su inhibición.
(Lehninger, 2005).

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- Efecto del pH enzimática de la fosfatasa alcalina a distintas temperaturas.

Como se puede observar en la Figura 3 los resultados
Los cambios de pH del medio donde se encuentra la concuerdan con lo reportando en la literatura ya que se
enzima pueden alterar o inhibir a la enzima para que observa la máxima tasa de actividad enzimática a 37°C lo
catalice una reacción. El cambio de pH afecta a las fuerzas cual nos indica que esta temperatura es aquella en donde la
repulsivas y atractivas, tanto polares como no polares, enzima trabaja de manera óptima.
alterando de esta manera la estructura de la enzima así
como el del sitio activo de ésta, impidiendo que el sustrato En relación a temperaturas menores a la óptima se
puede observar que la actividad enzimática si bien no es
se asocie a este. De acuerdo a Mobley & Cols. (1984), el
nula es mucho menor, esto se debe a que la enzima a bajas
pH óptimo de la fosfatasa alcalina es de 9.0.
temperaturas se inactiva por lo que se observa que la tasa
La enzima es muy estable en un rango de pH de 7.5 a de actividad enzimática disminuye de manera paulatina;
9.5, encontrándose el pH óptimo de la enzima en valores de por el contrario cuando la enzima se lleva a temperaturas
pH de 8-10. altas, es posible notar que la tasa de actividad disminuye de
manera más abrupta, esto se debe a que la enzima se
Los resultados obtenidos en este experimento nos desnaturaliza y pierde totalmente la capacidad de catalizar
indican un pH óptimo de la enzima, donde se observó un la reacción para la que está diseñada.
pico de actividad a un valor aproximado de pH=10. Esto Cuando hablamos de temperatura es imprescindible
nos indica que posiblemente el pH óptimo se pudo haber mencionar el término energía, en esencia la función de una
visto alterado principalmente por las altas concentraciones enzima es disminuir la energía de activación de una
de sustrato utilizadas, pero esenciales para la técnica. reacción para que esta pueda suceder más rápido, la energía
de activación enzimática depende de la temperatura a la
Se observó una especie de campana, lo que nos indica cual la reacción se lleva a cabo. De acuerdo con la Figura 5
que hay un pH específico donde la actividad de la enzima y utilizando la relación de Arrhenius se obtiene que la
es máxima, donde observamos la mayor absorbancia por energía de activación para la fosfatasa alcalina es de 1.22
mayor producción de sustrato en producto. La parte con kJ/mol este valor no es muy distante del reportado por
pendiente positiva y negativa nos indican que a esos valores Abubakar, 2013 que es de 1.44 kJ/mol las diferencias en el
de pH la enzima si posee actividad, pero no es tan eficiente valor se pueden deber a muchos factores como lo es el
o la transformación que realiza no es la máxima que la control exacto de las temperaturas durante todo el
enzima puede ofrecer. experimento, el tiempo real que la reacción se llevó a cabo,
entre algunos otros. Sin embargo los valores no son
- Efecto de la temperatura significativamente muy diferentes por lo que la energía de
activación es aceptable, cabe recalcar que este valor además
Todas las enzimas tienen un rango de temperatura de de las condiciones de experimentación también depende del
actividad óptima. Fuera de este rango, se puede decir que la estado de la enzima al momento del experimento.
enzima es inactiva o que está totalmente “inhibida”. Esto
ocurre porque, al aumentar la temperatura, se va aportando
una mayor cantidad de energía suficiente para romper - Efecto de la [Sustrato] y de [Inhibidor]
algunas de las interacciones de atracción intramoleculares Se ha demostrado experimentalmente que si la
entre grupos polares, así como a las fuerzas hidrofóbicas concentración de la enzima es mantenida constante, y la
entre grupos no polares con la estructura de la proteína. concentración del sustrato es incrementada gradualmente,
Cuando estas fuerzas se alteran, causa un cambio en las la velocidad de la reacción incrementará hasta que se
estructuras terciarias y secundarias de la estructura de la alcance un máximo (Figura 6). Después de este punto, los
proteína, y de esta manera alterar la conformación del sitio incrementos en la concentración del sustrato no
activo, provocando que este sea incapaz de llevar a cabo la incrementarán la velocidad, dado que la relación de
reacción que debía catalizar. concentración enzima-sustrato es 1:1, por lo cual la enzima
De acuerdo a Mobley & Cols. (1984), la temperatura sigue una cinética de saturación descrita por la conocida
óptima de la actividad de la Fosfatasa Alcalina es de 37°C ecuación de michaelis-menten:
lo cual se pudo comprobar mediante el ensayo de 𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆]
temperatura, ya que en éste se evaluó la actividad 𝑉0 =
𝐾𝑀 + [𝑆]

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Dicha ecuación maneja dos parámetros importantes en completo a la enzima antes de catalizar la reacción o bien
el estudio de cualquier enzima, KM y Vmax. debido a que se necesita de agua para llevar a cabo la
reacción de hidrólisis, al diminuir este reactivo la enzima
Al saber que KM, es un factor que indica la afinidad de no pudo catalizar la reacción.
la enzima por su sustrato (entre más pequeño sea su valor,
hay más afinidad de la enzima por su sustrato), tenemos que Para calcular KM (intrínseco de fosfatasa alcalina) y
se ve afectado en presencia de un inhibidor, la función del Vmax se toma en cuenta una forma alterna de la ecuación de
molibdato de sodio (ion que puede formar campos Michaelis-Menten, una gráfica de dobles recíprocos
expandidos de coordinación) como inhibidor implica una “Lineweaver-Burk” como la que se muestra en la Figura 7.
saturación de la enzima lo cual ocasiona que la fosfatasa Dichas gráficas se trazaron tomando en cuenta los tubos 1
alcalina no esté llevando a cabo su reacción normal al 4 del ambos ensayos por trazar una tendencia
catalítica; por lo tanto KM aumenta como se observa aparentemente proporcional entre la concentración de p-
claramente en la Figura 6. Nótese que las velocidades nitrofenilfosfato y la velocidad de reacción; una vez
iniciales no se ven afectadas en gran medida, en el rango de realizado los cálculos se obtuvieron que a pesar de
concentraciones de 1.6x10-4 a 3x10-4 de p-nitrofenilfosfato, aumentar el valor de KM, es decir, la afinidad de la fosfatasa
los valores de Vmax. permanecen casi iguales en ambos alcalina por el p-nitrofenilfosfato se redujo por la presencia
ensayos, por tanto podemos concluir que el modo de de un inhibidor que ocupa el sitio activo de la enzima, con
inhibición del molibdato de sodio sobre la fosfatasa alcalina lo cual no se lleva a cabo la catálisis, las velocidades
es de tipo competitivo. también cambiaron, esto no asegura una inhibición
totalmente competitiva o bien, pudo suceder que el tiempo
Los inhibidores competitivos son moléculas que tienen de incubación fue demasiado largo como para no solamente
una similitud estructural y química con el sustrato de la cuantificar la producción del p-nitrofenol.
enzima, por lo que se pueden unir al sitio activo. Sin
embargo, debido a que el inhibidor no es idéntico al CONCLUSIONES.
sustrato, la enzima no es capaz de convertirlo en producto
con lo que simplemente bloquea el sitio activo, en este caso De acuerdo con el progreso de la reacción enzimática
no es posible que tanto el inhibidor como el sustrato se para la fosfatasa alcalina se obtuvo que el tiempo
encuentren al mismo tiempo dentro de éste. Si se adiciona correspondiente a la velocidad inicial es de cinco minutos
más sustrato (y el inhibidor no se une de manera irreversible ya que posterior a este no se observaron cambios
a la enzima) se reduce la inhibición. significativos lo que asegura la linealidad de la reacción en
este intervalo.
La temperatura óptima para el funcionamiento de la
enzima trabajada esta alrededor de 37°C ya que en esta
temperatura se registró la mayor concentración de producto
por intervalo de tiempo.
El pH óptimo de la FA experimentalmente resultó de
10.
La inhibición del molibdato de sodio afecta la constante
de Michaelis-Menten “KM” al aumentar su valor, indicando
su pérdida de afinidad por el p-nitrofenol. Además, la
cinética de reacción es de saturación al observarse que a
Ilustración 2. Similitud entre p-nitrofenilfosfato y el inhibidor medida que la cantidad de sustrato a catalizar aumenta, se
molibdato de sodio. produce más p-nitrofenol; sin embargo no quiere decir que
esta relación sea netamente proporcional, sino que alcanza
Cabe señalar que la disminución de las velocidades en un límite de saturación la enzima, en la cual ya no puede
la Figura 6-Curva “efecto de un inhibidor”, no es un catalizar más cantidad de sustrato.
comportamiento normal para un inhibidor competitivo, esta
disminución en Vmax puede deberse a alguna alteración
independiente de la concentración de sustrato, ya sea algún
cambio repentino en el pH del medio que desactivara por

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