ANTIGENOS

El principio básico de cualquier técnica inmunoquímica es el de que un anticuerpo específico se

unirá con un antígeno específico para dar un complejo anticuerpo-antígeno exclusivo.

La definición clásica de antígeno es cualquier sustancia foránea que otorga una respuesta
inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que son capaces de
combinar con los anticuerpos específicos formados. Los antígenos son generalmente de alto
peso molecular y comúnmente son proteínas o polisacáridos. Polipéptidos, lípidos, ácidos
nucleicos y otras moléculas pueden también funcionar como antígenos. La respuesta inmune
puede también ser generada contra sustancias pequeñas, llamadas haptenos, si estos estan
acoplados a una proteína acarreadora, como la albúmina de suero bovino (BSA) u otras matrices
sintéticas. Una variedad de moléculas como drogas, azucares simples, aminoácidos, pequeños
péptidos, fosfolípidos o triglicéridos pueden funcionar como haptenos. Así, dándole suficiente
tiempo, cualquier sustancia foránea será identificada por el sistema inmune y evocará la
producción de un anticuerpo específico. Sin embargo, esta respuesta inmune específica es
altamente variable y depende mucho en parte del tamaño, estructura y composición de los
antígenos. Los antígenos que elicitan una fuerte respuesta inmune se dice que son altamente
inmunogénicos

Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que contactan con el antígeno se
denominan parátopos y la región de un antígeno que puede específicamente unirse a un
anticuerpo es llamado epítope. Un epítope no tiene una propiedad intrínseca de alguna
estructura particular. Estos son usualmente uno a seis monosacáridos o 5-8 residuos de

aminoácidos sobre la superficie del antígeno. Debido a que la molécula de antígeno existe en el
espacio, el epítope reconocido por un anticuerpo puede depender de la presencia de una
específica conformación tridimensional del antígeno (por ejemplo, un sitio único formado por la
interacción de dos loops o subunidades de una proteína nativa) o el epítope puede corresponder
a una región de una secuencia primaria simple, así, los epítopes son descritos como
conformacionales y lineares, respectivamente. El rango de posibles sitios de unión es enorme,
ya que cada sitio de unión tiene sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces
covalentes, iónicos e interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas.

Para que exista una eficiente interacción entre el antígeno y el anticuerpo, el epítope debe estar
fácilmente disponible para la unión. Si la molécula blanca es desnaturalizada, por ejemplo, por
la fijación, cambios de pH o durante la preparación para el gel de electrofóresis, el epítope puede
ser alterado y esto puede afectar su habilidad para interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo,
algunos anticuerpos son inefectivos en un Western blot pero muy bueno en
inmunohistoquímica debido a que en el proceso, un complejo sitio antigénico puede ser
mantenido en el tejido, mientras que en el otro procedimiento la preparación de la muestra
altera la conformación de la proteína lo suficiente para destruir el sitio antigénico y así elimina
el sitio de unión con el anticuerpo.

Determinantes antigénicos

Es la subunidad o entidad química mínima de una macromoléculas o partícula capaz de provocar

la formación de un anticuerpo especifico. Tanto los antígenos solubles pueden tener muchos
determinantes antigénicos. Son pequeñas porciones de cualquier molécula que, por su tamaño
pueden interaccionar con los receptores (BCR) de los linfocitos T o B y estimularlos par que
respondan específicamente contra los mismos determinantes que los estimularon. La respuesta
inmunitaria no está dirigida contra las moléculas antigénicas en general, sino contra los
determinantes que, en particular, estimulan los linfocitos. El reconocimiento depende de las
características de los determinantes antigénicos.

Los determinantes antigénicos se encuentran en las proteínas, los polisacáridos, los lípidos, los
ácidos nucleicos y, en general, en cualquier antígeno que puede estimular específicamente la
respuesta del sistema inmunitario. Representan segmentos pequeños (4-5 aminoácidos o 5-6
monosacáridos) de la molécula antigénica.

Cada determinante antigénico posee una región llamada epitope, que es la que interacciona con
el receptor de los linfocitos. La parte del receptor de los linfocitos que se une a los determinantes
se llama paratope. Cuando el antígeno es digerido enzimáticamente y sus determinantes son
expuestos sobre la superficie de las células presentadoras, en esos oligopeptidos se pueden
distinguir otra región conocida como agretope que es la que interacciona con las moléculas de
histocompatibilidad de la célula que presenta el determinante sobre la superficie de su
membrana. La región que la molécula de histocompatibilidad que hace contacto con el agretop
ha sido llamada desetope.

HAPTENOS

La mayoría de los antígenos tiene un peso molecular de 100 o mayor. Una sustancia extraña que
tenga un peso molecular menor no será antigénica a menos que este unida a una molécula
transportadora. Estos compuestos de peso molecular bajo se denominan haptenos. Una vez que
se haya formado un anticuerpo contra el hapteno este reaccionara con el anticuerpo de manera
independiente de la molécula transportadora. La penicilina es un buen ejemplo de hapteno. No
es antigénica por sí misma, pero algunas personas desarrollan una reacción alérgica contra ella.
En estas personas la combinación de la penicilina con proteínas séricas produce moléculas que
inician una respuesta inmunitaria.

Anticuerpo

Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinación especifica
con el antígeno que ha causado su producción en un animal susceptible. Ellos son producidos
en respuesta a la invasión de moléculas foráneas en el cuerpo. Los anticuerpos existen como
una o más unidades en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. Cada Y
contiene dos copias idénticas de una cadena pesada (HC, heavy chain), y dos copias idénticas
entre sí de una cadena ligera (LC, light chain), llamadas así por sus pesos moleculares relativos
que son de aproximadamente 50kDa la cadena pesada y de cerca de 25kDa la cadena ligera.
Estas cadenas se mantienen unidas mediante enlaces disulfuros intercatenarios. Estas cadenas
pueden separarse por reducción de los enlaces S-S y acidificación.
REACCIÓN ANTÍGENO- ANTICUERPO

Las inmunoglobulinas constan de cuatro polipéptidos, dos cadenas pesadas y dos cadenas
ligeras. La unidad funcional capaz de unir a un antígeno está determinada por el heterodímero
formado por una cadena pesada y una ligera. Además, tanto la cadena ligera como la pesada,
están divididas en un dominio constante (C) y otro variable (V). el dominio Ces el encargado de
las funciones comunes de todos los anticuerpos, como son las uniones del complemento;
mientras que el dominio V de la cadena ligera y la pesada interaccionan entre sí para formar el
sitio de unión al antígeno. En este apartado vamos a analizar las características estructurales de
los dominios V, así como del sitio de unión del antígeno.
DOMINIOS VARIABLES

En los dominios variables (V) de las distintas Igs existen diferencias en la secuencia de
aminoácidos. Esta variabilidad es especialmente marcada en diferentes zonas llamadas regiones
hipervariables. Estas zonas hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la
complementariedad(CDR), determinan la mayoría de los contactos moleculares con el antígeno.
Cada dominio V, tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, dispone de tres CDRs. Los
dominios CDR1 y CDR2 son ligeramente diferentes entre las distintas inmunoglobulinas; por el
contrario, los dominios CDR3 presentan diferencias entre ellos. El dominio CDR3 de la cadena
pesada tiene una estructura particularmente compleja. Estudios de la secuencia de aminoácidos
de CDR3 indican que están formados por la porción carboxi-terminal del dominio V seguido por
un segmento de escasa diversidad (D) de alrededor de 3 aminoácidos, y una región de unión (J)
de entre 13 y 15 residuos. La cadena ligera presenta una organización similar en su dominio
CDR3, pero carece de la región D. todos los CDRs están involucrados en la unión antígeno.

UNION AL ANTIGENO

El principio de todas las reacciones de los anticuerpos se basa en la especifica combinación de

determinantes del antígeno con la región variable. El sitio de unión del antígeno de un
anticuerpo está formado por la asociación de una cadena ligera y una cadena pesada mide
entorno a 2 x 3 nm, y es capaz de unir un epítopo de un tamaño aproximado de entre 10- 15
aminoácidos. El reconocimiento de un antígeno está determinado por el plegamiento de las
cadenas pesada y ligera de la Ig. Este plegamiento en las regiones V posibilita la existencia de
seis CDRs (CDR1,2 y 3 tanto de la cadena ligera como de la pesada) en la zona terminal de la
inmunoglobulina. El resultado es un único y especifico sitio de unión del antígeno.
ENLACE ANTÍGENO ANTICUERPO

Naturaleza de los enlaces antígeno – anticuerpo

Los enlaces son muy específicos si bien relativamente débiles. Las uniones covalentes no juegan
papel alguno de las interacciones antígeno anticuerpo, solo participan enlaces no covalentes de
baja energía. De los tipos de uniones más débiles, de los principales participan en el enlace
antígeno anticuerpo: fuerzas electrostáticas, por una parte, y fuerzas de dispersión del tipo van
der Waals London, por la otra. También están implicados los enlaces de hidrogeno, pero es poco
probable que por lo regular jueguen un papel importante en las interacciones antígeno
anticuerpo. La hipótesis de la cerradura de Paul Ehrlinch, aun parece a la luz de los
conocimientos actuales acerca de las interacciones antígeno anticuerpo.
ESPECIFICIDAD Y AFINIDAD DE LAS INTERACCIONES DE ANTÍGENO ANTICUERPO

Capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno (a su epítopo) que lo estimuló. La unión dada
por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias
mínimas a pesar de su similitud.

Cuando un anticuerpo se encuentra con un antígeno para el cual es específico se forma con
rapidez un complejo antígeno- anticuerpo. Un anticuerpo se une a un antígeno, como por
ejemplo una bacteria, en una porción específica denominada epítopo, o determinante
antigénico.

La fuerza de la unión entre un antígeno y un anticuerpo se denomina afinidad. En general cuanto

mayor sea la correspondencia física entre el antígeno y el anticuerpo mayor será su afinidad. Los
anticuerpos tienden a reconocer la forma del epítopo del antígeno. Asimismo, exhiben una
capacidad notable de especificidad. Pueden distinguir entre diferencias sutiles en la secuencia
de aminoácidos de una proteína e incluso entre dos isómeros.En consecuencia, los anticuerpos
pueden utilizarse, por ejemplo, para diferenciar entre los virus de la varicela y del sarampión y
entre bacterias de especies diferentes.

La unión de un anticuerpo con un antígeno protege al huésped por medio de la marcación de

las células y moléculas extrañas para que los fagocitos y el complemento las destruyan. La
molécula de anticuerpo por sí misma no daña al antígeno. Los microorganismos extraños y las
toxinas son convertidos en elementos inocuos por unos pocos mecanismos.

Interacciones antígeno anticuerpo in vivo

La importancia real de la reacción entre anticuerpos y antígenos en vivo, es por supuesto la

defensa del organismo contra la invasión por agentes extraños.

Aglutinación de bacterias

Los anticuerpos dirigidos a los antígenos bacterianos recubren a estos microorganismos y,

frecuentemente, al ligarse a ellos los organizan en grumos. No hay un indicio poderoso se que
la aglutinación tenga un efecto destructor sobre estos microorganismos, pero la formación de
grandes grumos de bacterias es ventajosa para el huésped por cuanto permite deshacerse de
diversas bacterias por ingestión fagocitica.

Inmovilización de bacterias y otros parásitos

Las bacterias móviles, tanto si lo son por el movimiento de su propio cuerpo, como las
esporiquetas, o por el flagelo, se inmovilizan al ligarse con partes de su superestructura de sus
flagelos.

Inactivación de virus

• Los anticuerpos IgG, IgM e IgA pueden unirse a ciertos virus durante su fase extracelular
e inactivarlos.

• Esta inactivación de virus mediada por anticuerpos se denomina neutralización viral.

• La fijación al virus del factor C4b de la vía clásica del complemento ayuda al proceso de
neutralización.

• La neutralización viral impide una infección viral porque no permite al virus unirse a la
célula diana.
Neutralización de toxinas

• Producción de anticuerpos específicos que inactivan las toxinas que produce una
bacteria. Este proceso se denomina neutralización de toxinas.

• Una vez neutralizado, el complejo toxina – anticuerpo no es capaz de unirse a los

receptores para la toxina de la célula diana, ni de penetrar en la célula, y puede ser
ingerido por los macrófagos.

• Por ejemplo, la toxina difterica inhibe la síntesis proteica después de unirse a la

superficie celular por el fragmento B y el posterior paso del fragmento A activo al citosol
de la célula diana. Por lo tanto, el anticuerpo bloque el efecto toxico inhibiendo la
entrada del fragmento A o la unión del fragmento B a su receptor.

Reconocimiento de superficie por fagocitosis

Los anticuerpos dirigidos a los sitios antigénicos en la superficie de bacterias, virus u otras
partículas o moléculas extrañas, dotan a estas superficies de una cubierta más hidrofóbica, la
cual hace que la célula fagocíticas ingiera a las partículas.

Acciones mediadas por el complemento

Ciertos tipos de anticuerpos fijan el complemento, lo cual da lugar a las siguientes reacciones
biológicas:

 La hemolisis después de la interacción de los eritrocitos con anticuerpo específicos y

complemento.
 La lisis de bacterias (principalmente gran negativa) después de su interacción con
anticuerpos especifico y complemento.
 Quimiotaxis; es decir, la migración de las células fagociticas hacia los microorganismos
invasores, es un mecanismo de defensa importante. El recubrimiento de los
microorganismos con el anticuerpo y la fijación del complemento aumentan su
capacidad quimiotáctica.
 Otras reacciones mediadas por el complemento son la formación anafilatoxinas después
de las reacciones antígeno anticuerpo y la inmunoadherencia, un mecanismo mediado
por el complemento para la fijación de los complejos antígenos a los eritrocitos.
Las reacciones antígeno-anticuerpo se estudian frecuentemente in vitro, es decir, usando
preparaciones de antígenos y antisueros. El estudio de las reacciones antígeno-anticuerpo in
vitro se denomina serología.

Temperatura

acelera la reacción debido a un incremento de la difusión y el movimiento de las moléculas. Se

considera que esto es válido hasta los 56°C, ya que a mayor temperatura comienza a haber
desnaturalización. Los anticuerpos de la clase IgM son más reactivos a bajas temperaturas (4-27
°C), mientras que los de la clase IgG lo son a 37 °C. Por este motivo, las técnicas de detección de
anticuerpos abarcan gamas de temperaturas de 22-37 °C ó 30-37 °C. Aquellos anticuerpos que
reaccionan in vitro a temperaturas por debajo de 37 °C, no se consideran clínicamente
significativos. Algunos anticuerpos de la clase IgM pueden activar el complemento a
temperaturas por debajo de 30 °C. Los anticuerpos clínicamente significativos son aquellos que
tienen actividad in vivo que se manifiesta in vitro al reaccionar a 37 °C.

Ph

De este factor depende el estado iónico de grupos importantes que participan en la interacción,
como son los radicales aminos (-NH3) y carboxilo (-COO). Aunque la reacción Ag-Ac la podemos
observar en un intervalo amplio de pH, se considera que el óptimo está entre 6.8 a 8.6, en la
práctica las técnicas de rutina deben trabajarse a un pH alrededor de 7,0.

Concentración antígeno anticuerpo

la velocidad de formación del complejo antígeno-anticuerpo varía con el número de moléculas

de anticuerpo presentes en el medio y con el número de sitios antigénicos presentes en cada
antígeno. La concentración de Ag y Ac deben ser equivalentes para que la reacción pueda
llevarse a cabo hasta la segunda etapa.

Si hay exceso de uno de ellos se presenta el EFECTO O FENÓMENO DE ZONA, donde el antígeno
y el anticuerpo no están en concentraciones equivalentes, por lo tanto no se puede llegar a la
agregación de los complejos primarios. El efecto de la concentración puede ser observado si se
hacen reaccionar cantidades variables del Ag con una concentración constante de Ac y
graficando el producto formado, se aprecia que en la zona de equivalencia todos los epitopos
están ocupados con todos los paratopos disponibles.

Fuerza ionica

Corresponde a la concentración de iones presentes en el medio de reacción (electrolitos) los

cuales son necesarios. En una solución salina normal los iones Na+ y Cl- se agrupan alrededor de
las moléculas de antígeno y anticuerpo, y neutralizan parcialmente sus cargas opuestas. Este
recubrimiento dificulta la unión del anticuerpo con el antígeno y se reduce al disminuir la fuerza
iónica del medio donde tiene lugar la reacción, por lo general cuando la concentración salina del
medio de reacción disminuye, la velocidad de captación del anticuerpo aumenta. Se requieren
bajas (intervalo óptimo 0.01-0.1), a altas los grupos iónicos son neutralizados y por tanto se
reduce la afinidad.
Tiempo de incubación

los anticuerpos de los diversos grupos sanguíneos tienen diferentes tiempos para alcanzar el
equilibrio, en esto interviene de manera significativa la clase de inmunoglobulina y la forma en
que se une con su antígeno específico. Estudios con eritrocitos suspendidos en suero o solución
salina han demostrado que del 100 % de anticuerpos RhD que se fijan, aproximadamente el 25
% lo hace en los primeros 15 minutos y el 75 % restante lo hace durante la primera hora. La
adición de varios agentes potenciadores, por ejemplo, disminución de la fuerza iónica, puede
aumentar la cantidad de anticuerpos fijados durante los primeros 15 minutos, y con esto
disminuir el tiempo de incubación necesario para alcanzar el equilibrio.

Técnicas simples: de precipitación, Aglutinación, - Fijación de Complemento, etc.

Técnicas con conjugados: Inmunofluorescencia (I-F)- Radioinmunoensayo (R.I.A)-

Inmunoenzimoensayo (ELISA)

PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS

El enzimoinmunoensayo (ELISA, del inglés enzyme-linked immunosorbent assay) o

enzimoinmunoanálisis (E1A) se ha convertido en una de las pruebas serológicas más empleadas
para detección de anticuerpo o de antígeno. Esta prueba implica conjugar diversas enzimas
«marcadoras» a antígenos o anticuerpos. Se emplean dos métodos básicos: la prueba de doble
anticuerpo en sándwich y la inmunoadsorción indirecta.

La prueba de doble anticuerpo en sandwich se emplea para la detección de antígenos. En esta

prueba, se coloca anticuerpo específico en los pocillos de una placa de microtitulación (o puede
ser unido a una membrana). El anticuerpo se adsorbe a las paredes, sensibilizando la placa.
Después se añade a cada pocillo un antígeno de prueba. Si el antígeno reacciona con el
anticuerpo, el antígeno es retenido al lavar el pocillo para eliminar el antígeno libre. Después se
añade a cada pocillo un conjugado de anticuerpo-enzima específico del antígeno. El complejo
final está formado por un anticuerpo-enzima externo, un antígeno en medio, y un anticuerpo
interno —es decir, un sándwich en capas (Ac-Ag-Ac)—. Después se añade un sustrato que la
enzima convertirá en un producto de color, y cualquier producto resultante se cuantifica
mediante el estudio de la densidad óptica de la placa. Si el antígeno ha reaccionado con los
anticuerpos adsorbidos en el primer paso, la prueba de ELISA es positiva. Si el antígeno no es
reconocido por el anticuerpo adsorbido, la prueba de ELISA es negativa porque el antígeno no
ligado es eliminado con el lavado, y no se liga anticuerpo-enzima. Esta prueba se emplea en la
actualidad para la detección de infecciones por Helicobacter pylori y de los agentes causales de
la sífilis, brucelosis, salmonelosis y cólera. Muchos otros antígenos pueden detectarse también
con el método de sándwich. Por ejemplo, existen kits de ELISA en el mercado que pueden
estudiar más de 90 alérgenos alimentarios diferentes.

La prueba de inmunoadsorción indirecta detecta anticuerpos y no antígenos. En esta prueba, se

incuba antígeno en un búfer sensibilizante apropiado en los pocillos de una placa de
microtitulación y se absorbe a las paredes de los pocillos. El antígeno libre se elimina por lavado.
Se añade antisuero de prueba, y si existe anticuerpo específico, se une al antígeno. El anticuerpo
no unido se elimina mediante lavados. Alternativamente, la muestra de prueba se puede incubar
con una suspensión de cuentas de látex que tienen unido a su superficie el antígeno deseado.

Después de permitir la formación del complejo anticuerpoantígeno, las cuentas son atrapadas
en un filtro y el anticuerpo no ligado se elimina por lavado. Después se añade un anti-anticuerpo
unido covalentemente a una enzima, como la peroxidasa de rábano picante. El complejo
anticuerpo- enzima (el conjugado) se une al anticuerpo de prueba, y una vez lavado el conjugado
no ligado, el ligando unido se visualiza tras la adición de un cromógeno. Un cromógeno es un
sustrato incoloro sobre el que actúa la porción enzimática del ligando para producir un producto
coloreado.

La cantidad de anticuerpo de prueba se cuantifica de la misma manera que el antígeno en el

método de doble anticuerpo en sándwich. El ensayo de inmunoadsorción indirecta se emplea
en la actualidad para detectar anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (el
agente causal del SIDA) y el virus de la rubéola (sarampión alemán), y para detectar ciertas
drogas en el suero. Por ejemplo, se emplean cuentas de látex revestidas de antígeno en la
prueba SUDS HIV-1 para detectar anticuerpos contra el VIH en el suero en unos 10 minutos.
Neutralización

Las pruebas de neutralización son reacciones antígeno-anticuerpo que determinan si la actividad

de una toxina o un virus ha sido neutralizada por un anticuerpo. En estas pruebas se emplean
animales de experimentación o células de cultivo de tejidos como «sistemas indicadores». La
toxina o virus a estudiar debe poseer efectos conocidos y conspicuos sobre el sistema indicador.
El efecto en el animal puede ser la muerte, parálisis o lesiones cutáneas. Por ejemplo, cuando
se sospecha que la exotoxina de Clostridium botulinum está causando intoxicación alimentaria
en una persona se recoge una muestra del alimento sospechoso o de suero, heces o vómito del
paciente enfermo. Se emplean dos grupos de ratones indicadores. El grupo control recibe
antitoxina botulínica y el grupo experimental no. Se inyectan filtrados de las muestras de origen
en los dos grupos de ratones. Si la toxina está presente, todos los ratones, a excepción de los
que reciben la antitoxina, morirán, por lo que la prueba será positiva para botulismo alimentario.

Las pruebas de neutralización viral se emplean a menudo para detectar infecciones virales. El
suero sanguíneo sospechoso que contiene anticuerpos frente a ese virus se introduce en células
de cultivo de tejidos o en huevos embrionados que serán posteriormente infectados con el
mismo virus.

Inmunodifusión

La inmunodifusión alude a una reacción de precipitación que tiene lugar entre un anticuerpo y
un antígeno en un medio de gel de agar. Se emplean habitualmente dos técnicas: la
inmunodifusión radial simple y la doble difusión en agar.

La inmunodifusión radial simple (IDR) o técnica de Mancini cuantifica antígenos. Se añaden al

agar los anticuerpos monoespecíficos, después la mezcla se vierte en placas y se permite que
gelifique. Se excavan pocillos en el agar y se añaden cantidades conocidas de antígeno estándar.

El antígeno desconocido de prueba se añade a un pocillo diferente (Figura 33.15a). Se deja la

placa durante 24 horas o hasta que se alcance el equilibrio, durante cuyo tiempo el antígeno
difunde fuera de los pocillos para formar complejos insolubles. El tamaño del anillo de
precipitación resultante que rodea a las diferentes diluciones de antígeno seleccionadas es
proporcional a la cantidad de antígeno que existe en el pocillo (cuanto más amplio es el arco,
mayor la concentración de antígeno). Esto es debido a que la concentración de antígeno cae a
medida que se aleja del pocillo. El antígeno forma el anillo de precipitina cuando su
concentración ha decrecido lo suficiente como para alcanzar la equivalencia y combinarse con
el anticuerpo para producir una red grande, insoluble. Este método se emplea frecuentemente
para cuantificar inmunoglobulinas séricas, proteínas del complemento y otras sustancias.

La doble difusión en agar (técnica de Ouchterlony) se basa en el principio de que la difusión

tanto del anticuerpo como del antígeno (de ahí doble difusión) por el agar puede formar
inmunocomplejos estables y fácilmente observables. Las soluciones difunden hacia fuera y,
cuando se encuentran el antígeno y el anticuerpo adecuados, se combinan y precipitan en la
zona de equivalencia, produciendo una línea (o líneas) indicadora. La línea de precipitación
visible permite comparar los antígenos buscando identidad (mismos determinantes
antigénicos), identidad parcial (reactividad cruzada), o ausencia de identidad
frente a determinado anticuerpo seleccionado. Por ejemplo, si se forma una línea en forma de
«V», demuestra que los anticuerpos se unen a los mismos determinantes antigénicos en cada
muestra de antígeno y son idénticos. Si un pocillo contiene un antígeno diferente que comparte
algunos determinantes, pero no todos, con el primero, se forma una línea
de precipitación en forma de «Y», demostrando la identidad parcial. En esta reacción el tronco
de la «Y», llamado espolón, se forma si el antígeno o los determinantes antigénicos ausentes en
el primer pocillo pero presentes en el segundo (antígeno a en la Figura 33.156) reaccionan con
los anticuerpos que difunden. Si se añaden a los pocillos dos antígenos sin relación, se forma
una línea recta de precipitación entre los dos pocillos, o se forman dos líneas separadas de
precipitación, que dan lugar a un patrón en «X», reacción de no identidad.

Radioinmunoensayo

El radiommunoensayo (RÍA) es una herramienta muy importante en la investigación biomédica

y en la práctica clínica (p. ej., en cardiología, banco de sangre, diagnóstico de alergias y
endocrinología). De hecho, Rosalyn Yalow ganó el Premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1977
por desarrollarlo. El RÍA emplea un antígeno purificado (de concentración conocida) que se
marca con un radioisótopo; este conjugado compite con el antígeno (tal vez presente en la
muestra experimental) por unirse a un anticuerpo específico.

La radioactividad asociada al anticuerpo se detecta después por medio de analizadores de

radioisótopos y autorradiografía (emulsiones fotográficas que muestran zonas de
radioactividad). Si existe mucho antígeno en la muestra experimental, competirá con el antígeno
marcado con radioisótopo por los lugares de unión al antígeno del anticuerpo, y se ligará poca
radiactividad. Una gran cantidad de radioactividad ligada indica que en la muestra experimental
existe poco antígeno presente.

Inmunoprecipitación

La técnica de inmunoprecipitación detecta antígenos solubles que reaccionan con anticuerpos

llamados precipitinas. La reacción de la precipitina se produce cuando se mezclan en
proporciones adecuadas anticuerpos divalentes y multivalentes y antígenos. Los anticuerpos
ligan el antígeno para formar una gran red o entramado antígeno-anticuerpo que abandona el
estado de solución cuando alcanza el tamaño suficiente. La reacción de inmunoprecipitación
sólo ocurre en la zona de equivalencia, en donde se encuentran antígeno y anticuerpo en una
proporción óptima, de tal forma que se forma un entrecruzamiento a modo de red. Si la reacción
de precipitación se produce en un tubo de ensayo se forma un anillo de precipitación en la zona
de equivalencia. Formación de inmunocomplejos.

Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es un proceso en el que unos colorantes llamados fluorocromos se

exponen a luz UV, violeta o luz azul, para provocar en ellos fluorescencia y que emitan luz visible.
Los colorantes como rodamina B o isotiocianato de fluoresceína (FITC) se pueden unir a
moléculas de anticuerpo sin modificar la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno
específico. Los fluorocromos se pueden unir también a antígenos. Existen dos clases principales
de pruebas con anticuerpos fluorescentes directa e indirecta.

La inmunofluorescencia directa implica fijar en un portaobjetos la muestra (célula o

microorganismo) que contiene el antígeno de interés. Después se añaden anticuerpos marcados
con fluoresceína y se incuban. Se lava el porta para retirar los anticuerpos no unidos y se examina
al microscopio de fluorescencia buscando una fluorescencia amarillo-verdosa. El patrón de
fluorescencia revela la localización del antígeno. La inmunofluorescencia directa se emplea para
identificar antígenos como los que se encuentran en la superficie de los estreptococos del grupo
A y para diagnosticar Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi, Shigella sonnei,
Listeria monocytogenes, Haemophilus influenzae tipo b y virus de la rabia. El microscopio de
fluorescencia. La inmunofluorescencia indirecta se emplea para detectar la presencia de
anticuerpos en el suero tras una infección o exposición de un individuo a microorganismos.
En esta técnica se fija un antígeno conocido a un portaobjetos. Después se añade el antisuero
de prueba, y si está presente el anticuerpo específico, reacciona con el antígeno para formar un
complejo. Cuando se añade anti-inmunoglobulina marcada con fluoresceína, reacciona con el
anticuerpo fijado. Después de la incubación y el lavado, se presencia de fluorescencia indica que
en el suero existe anticuerpo específico contra el antígeno de prueba. La inmunofluorescencia
indirecta se emplea para identificar la presencia de anticuerpos contra Treponema pallidum en
el diagnóstico de la sífilis (absorción de anticuerpo antitreponema, FTA-ABS; así como
anticuerpos producidos en respuesta a otros microorganismos.