TECNICA DE ANTICUERPOS

Reactivos de anticuerpos validados y de buena calidad, tanto policlonales como

monoclonal, son una parte esencial de la proteómica moderna

caja de herramientas, aunque desafortunadamente muchos investigadores han sido

mal quemado por reactivos de calidad inferior suministrados por algunos

fabricantes (Colwill y Graslund, 2011). Debe ser recordado,

sin embargo, esos anticuerpos son un caso de 'caballos para cursos',

y un anticuerpo que es excelente para inmunoprecipitación, para

ejemplo, puede no funcionar para inmunohistoquímica. Por suerte,

ahora hay esfuerzos para garantizar que los anticuerpos validados contra

un objetivo definido puede ser elegido para una aplicación específica.

Antibodypedia es un recurso gratuito de acceso abierto para datos y

comentario sobre los anticuerpos de los comerciales y académicos

proveedores (http://www.antibodypedia.com/). El noviembre

La versión 2012 cataloga más de 500,000 anticuerpos individuales,

que cubre el 88% de las proteínas codificadas por el genoma humano.

Anticuerpo también detalla casi 145,000 experimentos

realizado con estos anticuerpos, así como 32,000 enlaces a

publicaciones relacionadas con su uso. Comparación de lado a lado de

las propiedades clave de los anticuerpos a los objetivos específicos se pueden hacer.

En colaboración con el esfuerzo de HUPO, The Human Protein Atlas,

lanzado en 2005, se creó para permitir una exploración sistemática

del proteoma humano utilizando un enfoque basado en anticuerpos

(Uhlen et al., 2010). El objetivo era generar al menos una

anticuerpo a todos los aproximadamente 20.300 genes en el ser humano

genoma a finales de 2014. Versión 11.0, que fue lanzado

el 11-03-13, ahora cubre 15.156 genes con expresión de proteína

perfiles basados en 18707 anticuerpos. La clave de este enfoque es la

uso de etiquetas de firma de epítopo de proteína (prEST) (Agaton et al.,

2003; Larsson et al., 2006) como inmunógenos. las PREFERENCIAS contienen

fragmentos proteotípicos seleccionados, típicamente 25-150 residuos, de

la proteína diana Se producen en Escherichia coli como fusión

proteínas con una etiqueta His6-ABP N-terminal: la etiqueta His6 permite

purificación de proteínas en un solo paso en condiciones desnaturalizantes

mientras que la proteína de unión a la albúmina (ABP) ayuda a promover

una respuesta inmune y facilitar la cuantificación siguiente

purificación. Los anticuerpos policlonales se generan en conejos y

inmunopurificado contra la presión correspondiente. Esto es ahora

generalmente se reconoce que el paso limitante de la velocidad en el alto rendimiento

la purificación de anticuerpos es la generación del objetivo

antígeno (ya sea como proteína nativa, proteína recombinante o

péptido sintético): los pEST obvian esto y ofrecen un genérico

método para obtener rápidamente inmunógenos contra todas las proteínas

codificado por el genoma humano. Mientras que los anticuerpos policlonales

son más baratos de producir y reconocer múltiples epítopes que

puede ser ventajoso para algunas aplicaciones (por ejemplo, anticuerpos secundarios

en ELISA sándwich), sufren las desventajas de

suministro finito con cada lote que requiere nueva validación. Monoclonal

los anticuerpos, por el contrario, son un recurso renovable donde

todos los lotes son idénticos, generalmente tienen menor inespecífico

vinculante que policlonales, y tienen un único epítopo. Esto tiene

estimuló el desarrollo de métodos de alto rendimiento

capaz de satisfacer la demanda mundial de anticuerpos monoclonales

(Colwill y Graslund, 2011), incluido el uso de un robot

enfoque (Layton et al., 2013).

Las técnicas basadas en anticuerpos complementan los enfoques de MS

(inmuno-MS) en dos áreas principales: garantizar una orientación altamente específica

y enriquecimiento para mejorar la selectividad y la sensibilidad; y

apoyando estudios interactómicos específicos (ver abajo). Una llave

ejemplo del primer enfoque son los estándares de isótopos estables y

captura por anticuerpos anti-péptido (SISCAPA; Anderson et al.,

2004). En este enfoque, anticuerpos policlonales anti-péptido específicos,

generados en conejos, se inmovilizan en columnas de afinidad 100 nL

para enriquecer el péptido diana correspondiente presente en un digestivo tríptico,

junto con el correspondiente etiquetado marcado con isótopo estable

estándar interno. Después de la elución del antipéptido

soportes de anticuerpos, la espectrometría de masas se utiliza para cuantificar la

péptidos (tanto endógenos como marcados). El método fue mostrado

ser compatible con el análisis múltiplex directo de péptidos

que representa 47 proteínas de abundancia alta a media en humanos

suero que usa MRM (Anderson y Hunter, 2006). El método tiene

ahora se ha modificado para usar anticuerpos monoclonales de conejo y

extracción en fase sólida automatizadaMS / MS con un tiempo de ciclo de muestra

de aproximadamente 7 s (Razavi et al., 2012).