1.

- ENSAMBLAJE DE LA CÁMARA DE ELECTROFORÉSIS

El procedimiento para el ensamblaje de la cámara de electroforesis varía de

acuerdo al modelo del equipo, en consecuencia el investigador deberá seguir las
instrucciones que recomienda el fabricante.

Es importante señalar que la cámara de electroforesis ya ensamblada deberá

estar ubicada sobre una superficie totalmente plana y nivelada. Este paso es
importante en el momento en el que se vierte la solución del gel dentro de la
cámara, ya que se evita el derrame de la solución y la generación de matriz
desnivelada. Esta última podría generar la distorsión del perfil de las bandas de
las proteínas al final de la electroforesis.

2.- PREPARACIÓN DE LOS GELES DE POLIACRILAMIDA

En este caso es discontinuo porque está conformado por dos geles de

poliacrilamida de resolución y empacamiento que presentan diferente
concentración, composición y pH. Ambos geles se encuentran unidos pero
limitados por una fase de separación visible al trasluz. Debido a que en estado
líquido ambos geles pueden mezclarse fácilmente, deben ser preparados por
separado esperando la total polimerización del primero para continuar con la
polimerización del otro. El gel de empacamiento generalmente se localiza en la
parte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarán las
muestras. El gel de resolución por su parte forma el cuerpo del gel por donde
migrarán y se separarán las proteínas.

2.1.- PREPARACIÓN DEL GEL DE RESOLUCIÓN

2.1.1.- Fundamento teórico

El gel de resolución es la matriz de poliacrilamida donde las

moléculas de proteínas, van a migrar generando un perfil de bandas
o patrón electroforético. Dicho patrón varía de acuerdo al peso
molecular de cada una de las moléculas y a la concentración del gel
mismo.
2.2.2.- Procedimiento

Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las

soluciones.

Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida,

trazando una línea horizontal en el vidrio con un marcador
indeleble. Para saber la ubicación exacta de la línea, colocar el
peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco centímetros
(dependiendo del tamaño de la cámara) por debajo de los dientes
del peine .

Realizar la preparación del gel de resolución a una concentración

de acuerdo a las necesidades, POR EJEMPLO: mezclar

 un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)

 acrilamida y bisacrilamida
 un agente iniciador de la polimerización, como el persulfato
amónico (genera radicales libres)
 un agente catalizador de la polimerización, como el TEMED
(N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina)
 SDS

Aproximadamente 5 mL de solución deberán ser preparados en caso

de trabajar con geles pequeños de aproximadamente 8 - 10 cm de
ancho por 5 - 7 cm de largo y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La
concentración de poliacrilamida a usar dependerá de las
necesidades del operador.
 Una vez finalizada la preparación de la solución, añadir los
catalizadores APS y TEMED uno por uno, tratando de mezclar cada
reactivo de manera uniforme en todo el volumen

Agregar un volumen de la solución de poliacrilamida entre las placas

de vidrio hasta la línea trazada. Posteriormente, añadir una capa de
butanol-agua (aproximadamente 100 µL) sobre la solución de
poliacrilamida para evitar el ingreso de moléculas de oxígeno que
retarden la polimerización.

Dejar polimerizar a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos,

usando como control polimerización la solución de poliacrilamida
remanente.

Una vez formado el gel, descartar la capa de butanol y lavar la parte

superior del gel varias veces con agua destilada hasta eliminar
completamente los restos de acrilamida no polimerizada y butanol.

2.2.- PREPARACIÓN DEL GEL DE EMPACAMIENTO

2.2.1.- Fundamento teórico

El gel de empacamiento es la matriz de poliacrilamida que tiene

como característica retener a las proteínas manteniéndolas
uniformes antes que ellas migren hacia el gel de resolución. Este
proceso permite mejorar la resolución de las proteínas en la
electroforesis.

2.2.2.- Procedimiento

Asegurarse de usar guantes durante la manipulación de las

soluciones.

Mezclar los componentes del gel.

Una vez finalizada la preparación de la solución, agitar

moderadamente sin hacer burbujas a fin de asegurar que el
 TEMED y el APS se distribuyan uniformemente en todo el volumen
de la solución.

Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cámara y sobre el

gel de resolución ya polimerizado. Inmediatamente después, colocar
el peine entre ambos vidrios secando con papel toalla los restos de
poliacrilamida que lleguen a derramarse.

Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a

30 minutos usando como control de la polimerización la solución de
poliacrilamida que quedó remanente en el tubo.

Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar

todos los pocillos ya formados con chorro suave de agua destilada.

3.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

3.1.- Principio del procedimiento

La preparación de la proteína consiste en un proceso fisico-químico,

en el cual se rompen enlaces peptídicos y puentes disulfuro gracias
a la acción de detergentes iónicos, reactivos reductores y altas
temperaturas, los que en conjunto consiguen desnaturalizar la
proteína hasta su estructura primaria.

3.2.- Procedimiento

Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por

cuatro veces (4x) en proporción 3:1 (tres partes de la muestra y
una de buffer).

Asegurar la tapa de los tubos con lámina extensible de parafina y

someter la muestra a una temperatura de 100° C durante 5 minutos.
Para tal efecto colocar los viales en una gradilla para microtubos
dentro de un recipiente o vaso de precipitación con agua hirviendo.

Controlar la temperatura con un termómetro adecuado.

Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de

precipitación y centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm.
 Mantenerlos en una gradilla para microtubos dentro de un
recipiente con hielo hasta el proceso de electroforesis.

4.- ELECTROFORESIS

4.1.- Principio del procedimiento

En el proceso de la electroforesis se realizará la separación de las

proteínas a analizar, de acuerdo a su peso molecular. Dicha
distribución dependerá de la concentración del gel de resolución
con el que se esté trabajando.

4.2.- Procedimiento

Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la

degradación de las moléculas por la acción de las proteasas
presentes en la mano.

Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un

tanque conteniendo buffer de electroforesis o de resolución para
proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos electrodos: uno positivo y otro
negativo (frecuentemente representados por colores rojo y negro,
respectivamente) que serán conectados a una fuente poder .Al
momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los
pocillos del gel estén totalmente cubiertos por el buffer.

Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad

proceder a depositar cuidadosamente la muestra en los pocillos
evitando la contaminación del pocillo contiguo.
Considerar el uso de un marcador estándar de proteínas para la
medición del peso molecular de la muestra. Dicho marcador debe
ser sometido a los mismos tratamientos de la proteína, excepto
cuando se trate de un marcador previamente teñido en que el que
se obviará el uso del buffer de la muestra.

Una vez finalizada la colocación de las proteínas en cada pocillo del

gel, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables
correspondientes de los electrodos en la fuente de poder.

Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y

amperaje correspondientes.

Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado

como una línea azul por el colorante del buffer) haya llegado a los
límites de la parte inferior del gel.

Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo

empezando con desconectar los electrodos de la fuente de poder
ya apagada y removiendo el sistema que contiene el gel de
poliacrilamida.

Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se

vaya realizando la separación de los vidrios que contienen el gel.
Separar el gel de empacamiento del gel de resolución realizando un
corte transversal.

Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho

cuidado pues el gel es muy frágil y puede romperse con facilidad
especialmente cuando se seca o es de baja concentración. Para
desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con buffer de
electroforesis o agua destilada y usar uno de los espaciadores a
manera de espátula para levantarlo por una de las puntas. Coger el
gel cuidadosamente (usar guantes) y luego sumergirlo en un envase
conteniendo el colorante azul brillante de coomasie.

El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original

para su posterior uso, pudiendo ser reciclado hasta cinco veces,
después de los cuales se deberá preparar una nueva solución dado
que puede afectar el tiempo de corrida de la prueba.
 Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberán ser lavados con
abundante agua y detergentes especiales que puedan ser
fácilmente removidos. Posteriormente, enjuagarlos con agua
destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a
37°C.

5.- COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO

AZUL BRILLANTE DE COOMASIE

5.1.- Principio del procedimiento

El proceso de coloración se basa en la atracción electrostática del

enlace peptídico de las proteínas sobre grupos de ácido sulfónico
que son los que tiñen la proteína de color azul. Asimismo, las fuerzas
de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas participan en
este proceso de unión mecánica. Este paso permite la visualización
de proteínas en un rango de sensibilidad entre 0,5 µg y 2 µg.

5.2.- Procedimiento

Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar

algún tipo de contacto con los reactivos.
Sumergir el gel de poliacrilamida en un envase de vidrio o teflón,
conteniendo solución de trabajo de azul brillante de coomasie en un
volumen que permita cubrir completamente el gel. Dejar incubando
con un suave movimiento rotatorio por 15 a 20 minutos. Es
importante precisar que el tiempo de incubación dependerá del
grado de sensibilidad requerida en la prueba, de la concentración
del gel y de la sensibilidad del azul brillante de coomasie
propiamente dicho.

Evitar la coloración del gel por más de dos horas, debido a que el
colorante puede quedar retenido fuertemente en el gel generando
un fondo oscuro por sobretinción que impediría la visualización de
las proteínas.

Culminado el tiempo de incubación, depositar el colorante en su

frasco original.

Cubrir el gel teñido con solución de decoloración rápida e incubar por

30 minutos. Eliminar la solución decolorante rápida y añadir un
segundo volumen de la misma solución hasta apreciar las primeras
bandas. Acto seguido, eliminar la solución de decoloración rápida y
añadir la solución decolorante lenta. Dejar destiñendo a
movimiento constante por lo menos una hora, cambiando la solución
por una nueva cuantas veces sea necesario. Seguir destiñendo
hasta que las bandas de las proteínas puedan ser apreciadas
claramente.

Finalizada la remoción del azul de coomasie, descartar el

decolorante usado y lavar el gel. Para poder analizar los
resultados es recomendable secar el gel usando un equipo secador
a vacío o manualmente.

5.3.- Interpretación de resultados

Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida y teñidas con azul

brillante de coomasie se observan como bandas azules de
diferentes pesos moleculares.
El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons
(Equivalente a 1 000 Daltons) y puede ser determinado comparando
la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido
denominado marcador de peso molecular.

La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel,

por lo tanto, el operador deberá seleccionar el marcador de peso
molecular más adecuado.

Algunas proteínas suelen migrar anómalamente y muchas veces

aparecen con un mayor peso del esperado; ello se debe a que
algunas de ellas presentan modificaciones postraduccionales en su
estructura como residuos de glicosilación, fosforilación y
acetlización, las cuales podrían retardar la migración de las
muestras.

Las proteínas degradadas (desnaturalización de las proteínas por

causa de un agente químico catalizador, ejm: proteasas) suelen
dejar manchas difusas en todo el frente de corrida y a veces
suelen confundirse con proteínas de menor peso molecular.