Métodos espectrofotométricos UV-Vis

Consideraciones generales de la espectroscopia

Dentro de los métodos espectrométricos o espectrofotométricos de análisis para identificar

y cuantificar elementos presentes en distintos medios, entre ellas aguas destinadas a bebida
humana, se encuentra la espectrofotometría ultravioleta – visible (UV-Vis). A continuación
haremos una breve introducción sobre los conceptos generales de espectroscopia.

La espectroscopia describe la interacción entre la radiación, principalmente la

electromagnética, y la materia. Toda radiación electromagnética viene caracterizada por
una longitud de onda (λ), una frecuencia (ν) o una energía (E); la relación existente entre
ellas está dada por la ecuación de Planck:

E = hν = hc/λ (3.1) dónde:

E = energía transportada por cuanto de radiación o fotón [J fotón-1]

h = constante de Planck (6,6256 × 10-34 J s fotón-1)
c = velocidad de la luz (2,9979 × 108 m s-1)
λ = longitud de onda [m]
ν = frecuencia de la radiación [s-1]

En la Figura 3.1 se dan los valores de frecuencia y longitud de onda de las distintas
regiones del espectro electromagnético:

Figura 3.1. Valores de frecuencia y longitud de onda de las distintas regiones del espectro electromagnético.

La radiación electromagnética ocasiona distintos efectos sobre la materia, tal como se indica en la
Tabla 3.1:
Tabla 3.1. Efecto de la radiación electromagnética sobre la materia.

Radiación Efecto
Rayos X y cósmicos Ionizaciones de las moléculas
UV-visible Transiciones electrónicas entre los orbítales
atómicos y moleculares
Infrarrojo Deformación de los enlaces químicos
Microondas Rotaciones de los enlaces químicos
Radiofrecuencias Transiciones de espín electrónico o nuclear en
los átomos de la molécula.

Cuando la radiación incide sobre una sustancia, sólo un átomo o conjunto de átomos son capaces
de absorber la radiación; estos grupos se denominan cromóforos y serán distintos dentro de una
misma molécula para cada técnica espectroscópica.

Los efectos de la radiación sobre la materia pueden usarse para obtener información sobre la
estructura de la misma, y así surgen distintas técnicas espectroscópicas, tal como se indica en la
Tabla 3.2.

Tabla 3.2. Espectroscopias e información que puede obtenerse de cada una.

Técnica espectroscópica Información obtenida

Rayos X Estructura total de la molécula incluida la
estereoquímica
Ultravioleta-Visible Existencia de cromóforos y/o conjugación en la
molécula
Infrarrojo Grupos funcionales a partir de las absorciones
observadas
Espectrometría de masas Formula molecular y subestructuras a partir de
los iones observados.
Resonancia magnética nuclear Grupos funcionales, subestructuras,
conectividades, estereoquímica, etc.
Espectroscopia 3.2. Ultravioleta visible (UV-Vis)

Generalidades

La espectroscopia UV-Vis utiliza la radiación del espectro electromagnético, cuya longitud de onda
está comprendida entre los 100 y los 800 nm (energía comprendida entre las 286 y 36 kcal mol-1),
y su efecto sobre la materia es producir transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos y/o
moleculares de la sustancia. En algunos casos, los efectos y la detección pueden llegar al IR
cercano (800-900 nm). En la espectroscopia UV-Vis, una especie química (en general una molécula,
aunque puede tratarse de una especie monoatómica, un ion o un complejo) absorbe UV-Vis, y la
energía adquirida por el sistema causa la transición de un electrón de un estado basal o
fundamental (EF) a uno excitado (EE). La energía de la transición está relacionada con la longitud
de onda de la radiación a través de la ecuación de Planck (1).
Un gráfico o representación de la respuesta del sistema en función de la longitud de onda o
frecuencia se denomina espectro. En general, en los espectros UV-Vis, se observa una señal
debida a cada transición electrónica del EF al EE. Los átomos dan líneas agudas, mientras que las
moléculas poliatómicas dan señales en forma de bandas puesto que la absorción de luz involucra
también energía suficiente para causar cambios en energía vibracional y rotacional de cada uno de
sus estados electrónicos en el EE, tal como ocurre cuando se irradia al EF con luz infrarroja. En este
caso, se originan líneas de absorción de diferentes intensidades que no se resuelven, con la
aparición de un continuo o banda. Para una sustancia determinada, la longitud de onda a la cual se
produce el máximo de absorbancia en el espectro se conoce como λmáx.

La señal espectral permite, por un lado, identificar algunos grupos funcionales presentes en las
moléculas y, por el otro, estimar la concentración de una sustancia. La espectrometría es la
técnica espectroscópica usada para evaluar la concentración de una especie y utiliza un
instrumento llamado espectrómetro. En el caso de la espectrometría que utiliza fotones (UV-Vis,
IR), se suele hablar de espectrofotometría. Para la medición de la intensidad de absorción se usan
espectrofotómetros en los cuales se puede medir la absorbancia o la transmitancia, como
veremos después.

Modos de excitación electrónica

Cuando un fotón UV-Visible de energía adecuada incide sobre una especie absorbente, un electrón
es promovido desde el EF al EE. El acto primario de excitación por la luz involucra tres etapas: 1)
interacción de la molécula con fotón (UV, visible), 2) fotoexcitación, 3) producción del EE o
transición electrónica. La absorción depende de la estructura de las moléculas, y es característica
para cada sustancia química. Hemos dicho que sólo absorben en el UV-Vis aquellas sustancias que
presentan un cromóforo, en el cual se localiza, aproximadamente, la transición electrónica
responsable de una determinada banda espectral y que absorbe la luz. Bajo irradiación UV-Vis
pueden ocurrir distintas transiciones electrónicas:

Transiciones σ→σ*: ocurren a λ < 50 nm. Este tipo de transiciones se dan sobre todo en
hidrocarburos que únicamente poseen enlaces σ C-H o C-C. La energía requerida para que tenga
lugar esta transición es relativamente grande, y pertenece a la región espectral denominada
ultravioleta de vacío (UVV) (Figura 3.2.).
Figura 3.2. Transición σ→σ*

Transiciones n→σ*: ocurren a λ entre 150-200 nm. Corresponden a compuestos que poseen
átomos con pares de electrones no compartidos (electrones de no enlace, como en el caso de O,
N, Cl) (Figura 3.3). La energía necesaria para que se produzca esta transición sigue siendo alta
(aunque menor que en las σ→σ*), perteneciendo éstas a la región espectral UV lejano.

Figura 3.3.Transición n→σ*

Transiciones n→π* y transiciones π→π*: ocurren a λ entre 200-700 nm. La mayoría de las
aplicaciones de la espectroscopia UV -Vis están basadas en transiciones que ocurren en esta zona.
Se requiere que las especies participantes aporten un sistema de electrones π (grupos
cromóforos: compuestos con insaturaciones, sistemas aromáticos multicíclicos, etc.). Las energías
de excitación en las transiciones π→π* son medianamente altas, correspondiendo a las regiones
UV lejano y cercano, mientras que las n→π* son algo menores (Figura 3.4.).
 Figura 3.4.Transiciones π→π* y n→π*

En las moléculas existen también átomos o grupos de átomos que no absorben radiación, pero
hacen que se modifique alguna de las características de la absorción del cromóforo.

La naturaleza del solvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración de electrolitos o

la presencia de sustancias interferentes pueden provocar también desplazamientos de las bandas
en el espectro UV-Vis. Los efectos son los siguientes:

- Efecto hipsocrómico: corrimiento a λ menores (desplazamiento al azul) por sustitución o cambio

en el medio, por ej. El solvente.

- Efecto batocrómico: corrimiento a λ mayores (desplazamiento al rojo).

- Efecto hipercrómico: aumento de la intensidad de una banda espectral por sustituyentes o

interacciones con el entorno molecular.

- Efecto hipocrómico: opuesto a hipercrómico.

- Auxocromo: átomo o grupo de un cromóforo que, generalmente por conjugación con un

cromóforo, ocasiona un desplazamiento batocrómico y/o un efecto hipercrómico en una banda
determinada del mismo, generalmente en la de menor frecuencia. Esta palabra se encuentra en
desuso.

Un ejemplo de estos efectos se da cuando en las moléculas existen dobles o triples enlaces π
conjugados que absorben energía a longitudes de onda mayores (Figura 3.6). Si existen varios
enlaces conjugados, la absorción se desplaza hasta el visible y provoca coloración en las moléculas,
como en el caso del β-caroteno.
Figura 3.6. Transiciones π→π* en dienos conjugados.

3.3. Ley de Lambert – Beer

La base de la espectrofotometría de absorción UV -Vis y su uso en el análisis cuantitativo están

dados por la relación conocida como ley de Lambert – Beer, que establece que la absorbancia de
una solución es directamente proporcional a la concentración del analito en esa solución.

Por lo tanto, puede emplearse para determinar la concentración de un compuesto en una

solución. La longitud de onda λ de absorción de la luz es específica de cada cromóforo.

Cuando un haz de radiación UV-Vis atraviesa una solución que contiene un analito absorbente, la
intensidad (I)* que atraviesa la muestra es menor que la del haz incidente (Io). La fracción de
radiación que ha traspasado la muestra se denomina transmitancia (T = I/Io). La transmitancia T
está relacionada con la absorbancia (A) de acuerdo a la siguiente expresión:

A = −log T = −log (I/Io) (3.2)

Por aspectos prácticos, para las mediciones se usa la absorbancia (A) en lugar de la transmitancia
(T), debido a que, de acuerdo a la ley Lambert – Beer, A está linealmente relacionada con la
concentración del analito absorbente a una determinada longitud de onda:

A = −log10 (I/Io) = εcl (3.3) dónde:

A: absorbancia medida

I: intensidad de la luz transmitida

Io: intensidad de la luz incidente

ε: coeficiente de absorción molar*, característico de cada sustancia absorbente a cada longitud de

onda

l: longitud del camino óptico (distancia que atraviesa la luz dentro de la muestra)
c: concentración de la sustancia absorbente (mol L-1).

La ley de Lambert-Beer se cumple para valores pequeños del producto εcl (0,01 a 0,1).

Para cada analito absorbente y longitud de onda λ, ε es una constante y es una propiedad
molecular fundamental asociada a un solvente dado, a una temperatura y presión particular.

La absorbancia A y el coeficiente de absorción ε son a veces definidos en términos del logaritmo

natural en lugar del logaritmo de base 10. ε es una constante relacionada con el área de incidencia
del cromóforo y la probabilidad de que se produzca la absorción.

Cuando ε es inferior a 10000, la absorción se debe a una transición electrónica prohibida por las
reglas de selección, tema que no analizaremos aquí pero que se puede consultar en las referencias
[2, 3, 5].

El espectrofotómetro UV-Vis registra las longitudes de onda a las cuales se cuantifica y registra la
absorción. El espectro se registra como absorbancia (A) vs. longitud de onda (λ).

Aplicación de la espectrometría UV-Vis para la determinación de la concentración de especies

químicas.

Para las determinaciones analíticas es solamente necesario disponer de un espectrofotómetro

UV -Vis, un equipo accesible y económico para la mayoría de los laboratorios, y con este equipo
medir el cambio de la absorbancia de un compuesto a diferentes concentraciones de analito por
un método estandarizado para la especie en cuestión. Generalmente, se realiza una curva de
calibración de la cual se puede obtener el coeficiente de absorción molar.

La espectrometría UV-Vis se emplea generalmente en la determinación cuantitativa de la

concentración en solución de especies químicas como iones metálicos de transición y compuestos
orgánicos muy conjugados. Muchas de las determinaciones incluyen un paso de reacción entre la
especie y un compuesto que origine un derivado coloreado o absorbente en el UV-Vis (por
ejemplo, un complejo o aducto).

En particular, las soluciones de iones metálicos de transición son generalmente coloreadas pues
absorben la luz visible debido a la excitación desde un estado electrónico a otro de los electrones
de los átomos del metal. El color de las soluciones de iones metálicos puede ser afectado por la
presencia de otras especies, como algunos aniones o ligandos. Como se mencionó antes, los
compuestos orgánicos, especialmente aquéllos con un alto grado de conjugación, también
absorben luz en las regiones visible o ultravioleta del espectro electromagnético, con coeficientes
de absorción bastante elevados.

Por lo general, se usa el agua como disolvente para compuestos inorgánicos y etanol para
compuestos orgánicos porque este alcohol absorbe muy débilmente a la mayoría de las longitudes
de onda. Como ya se ha dicho, la polaridad y el pH pueden afectar también la absorción de un
compuesto.

El espectrofotómetro UV-Vis [2]

El instrumento usado en la espectrofotometría ultravioleta-visible se denomina espectrofotómetro

UV-Vis, y permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene
una cantidad desconocida de soluto con una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia. Se mide la transmitancia de la muestra que se expresa habitualmente como porcentaje
(%T), o bien la absorbancia (A).