PERFIL DE SENSIBILIDADE DE AMOSTRAS ISOLADAS DE CASOS DE CANDIDURIAS

HOSPITALARES AOS ANTIFÚNGICOS CONVENCIONAIS

Santos, L. S.1,2, Bernardes, R. C.2, Magalhães, L. M.1,2, Siqueira, F. S.1, Khouri, S.1
1
NUFABI (Núcleo de Estudos Farmacêuticos e Biomédicos) Faculdade de Ciências da Saúde,
Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP)
Av. Shishima Hifumi, 2911, São José dos Campos, SP, 12244-000
lisimaolgf@hotmail.com; soniak@univap.br;
2
Valeclin Laboratório de Análise Clínicas S/S Ltda
Av. Adhemar de Barros,1188, Vila Ruby, São José dos Campos/SP
valeclin@valeclin.com.br

Resumo - As infecções fúngicas, de origem hospitalar, passaram a ser de grande importância nos últimos
anos, e nas últimas décadas, C. albicans e espécies não-albicans são os principais agentes dessas
infecções. Devido ao aumento de infecções hospitalares por estes agentes o presente estudo aborda a
técnica do Antifungigrama para auxilio no tratamento das infecções urinárias por Candida spp. A técnica do
antifungigrama consiste em um teste de sensibilidade aos antimicrobianos através dos diâmetros de halo,
no qual foram testados antifúngicos convencionais. O antifungigrama ainda não é empregado rotineiramente
como o antibiograma, embora tenha respaldo do NCCLS – (NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL
LABORATORY STANDARDS), atualmente CLSI. As Candidas isoladas apresentaram resistência
significativa aos azólicos, Itraconazol (92.3%), Fluconazol (92,3%), seguido do antimetabólico Fluocitosina
(84,6%) e do poliênico Anfotericina B (7,7%). Entretanto, o Cetoconazol, apresentou - se efetivo sob as
amostras testadas. Conclui-se que, de acordo com os resultados obtidos, o perfil de resistência dos isolados
das Candidas aos antifúngicos foi alto, demonstrando assim uma grande preocupação e restrita opção nas
terapias destas candidúrias.

Palavras-chave: Antifungigrama, leveduras, infecção hospitalar

Área do Conhecimento: Ciências Biológicas

Introdução Imunodeficiência Adquirida ) e aqueles que sofrem

As infecções fúngicas, de origem hospitalar,
passaram a ser de grande importância nos últimos
anos, pelo seu aumento progressivo e pelas
elevadas taxas de morbidade e mortalidade.
Muitas dessas infecções são de origem endógena
e outras podem também ser adquiridas por via
exógena, pelas mãos de profissionais da área da
saúde, infusos contaminados, biomateriais e
fontes inanimadas ambientais. (DINIZ, et al., 2005)
E os índices de infecções hospitalares nas UTIs
(Unidades de Tratamento Intensivos) tendem a
serem bem maiores do que aqueles encontrados
em outros setores do hospital, devido aos tipos de
procedimentos invasivos durante o tempo em que
o paciente se encontra internado, as patologias e
ao comprometimento imunológico, que deixam os
pacientes mais susceptíveis as infecções,
As leveduras do gênero Candida são
patógenos em destaque nestas infecções
nosocomiais, principalmente em pacientes
imunocomprometidos, incluindo aqueles que são
submetidos à terapia imunossupressora para
tratamento de câncer, transplante de órgãos,
pacientes com SIDA (Síndrome da
o tratamento prolongado com antibacterianos ou
intervenções médicas invasivas, como o uso de
cateteres intravasculares.(PAULA, et al., 2007).
Atualmente, Candida albicans tem maior
prevalência que as outras espécies não-albicans
em infecções do trato urinário.
O desenvolvimento de testes de
susceptibilidade aos antimicrobianos tem sua
história vinculada aos avanços obtidos na
quimioterapia antibacteriana. (SIDRIM; MOREIRA,
1999). Testes de susceptibilidade, in vitro,
envolvendo princípios das metodologias
conhecidas como difusão em ágar e diluição em
tubo. (SCHREIBER, 2007). Atualmente se tem
como recurso o Antifungigrama, que é um teste
que oferece como resultado padrões de
resistência ou susceptibilidade através de
diâmetros de halo a leveduras do gênero Candida
aos vários antimicrobianos (antifúngicos).
Atualmente, há poucas opções de antifúngicos
no mercado para o tratamento de infecções
urinárias, os que estão descritos a seguir são os
mais utilizados e mais indicados.
A Anfotericina B é um antifúngico poliênico que
como o Itraconazol também inibe a síntese do

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ergosterol, um componente da parede antifúngica.
Mesmo com a sua elevada toxicidade e a
introdução de antifúngicos azólicos sistêmicos na
década de 1980, a potência, o espectro de ação e
os quase 50 anos de experiência clínica têm
assegurado que a AB permaneça como fármaco
de escolha no tratamento.(FILlPPIN, et al.2006). O
tratamento com anfotericina B está indicado
quando não há resposta clínica/laboratorial ao
fluconazol, quando o teste de sensibilidade “in
vitro” demonstrar resistência ou em infecções
sistêmicas em pacientes gravemente enfermos. É
importante comentar que as espécies não-albicans
podem apresentar maior resistência ao fluconazol,
sendo necessário utilizar anfotericina B.
(STRABELLI, T. M. V., 2001).
O cetoconazol tem sido mais utilizada no
tratamento de várias espécies de Candida sp,
excluindo, alguns isolados de Candida tropicalis e
Candida albicans nas quais demonstram
resistentes. (SIDRIM & MOREIRA, 1999).
A exemplo, de outros derivados azólicos, os
mecanismos de resistência ao itraconazol são
poucos conhecidos. Contudo, sabe-se que
isolados de Candida glabata têm, frequentemente,
mostrado - se resistente a essa droga. (SIDRIM &
MOREIRA, 1999).
Fluconazol é um antifúngico triazol bem
tolerado e um agente seguro que tem boa
atividade clínica contra Cryptococcus neoformans
e a maioria de Candida spp. isolada. O uso
aumentado desta droga deu origem ao
desenvolvimento de resistência a Candida spp.,
principalmente C. glabrata e C. krusei isoladas.
(JR, et. al., 2005).
O presente estudo tem como objetivo realizar
uma investigação do perfil de susceptibilidade de
amostras de urinas positivas para leveduras do
gênero Candida, obtidas de pacientes internados
em um hospital particular em São José dos
Campos – SP.
Metodologia
Esse trabalho foi certificado pelo comitê de
ética da Universiadde do Vale do Paraíba –
UNIVAP, com parecer favorável sob protocolo nº
H004/CEP/2009.
Para investigação da incidência de leveduras
do gênero Candida, envolvidas em infecções
urinárias nosocomiais, foram analisadas as
uroculturas positivas no período de fevereiro a
maio de 2009 do laboratório de Microbiologia em
um Hospital particular de São José dos Campos-
SP. Essas amostras foram isoladas em diferentes
setores do hospital, sendo de pacientes adultos.
As amostras foram coletadas em frasco estéril,
próprios para urocultura, com realização do exame
de Urina Tipo I e semeadas em meio ágar Cled e
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encubadas por 24h a 37º e as mesmas que
tiveram crescimento com caracteristicas
macroscópica de levedura foram enviadas a
NUFABI (Núcleo de Estudos Farmacêuticos e
Biomédicos- da Universidade do Vale do Paraíba
– UNIVAP), onde foram semeadas em meio
Chromagar Candida® para isolamento das
espécies e identificação da Candida albicans, que
após 48 horas de incubação apresentou coloração
esverdeada. Nesse meio de cultura há alteração
da coloração da colônia dependendo da espécie
da Candida isolada, sendo C. tropicalis, azul-
acinzentado e C.kruzei, rósea.
As espécies consideradas não-albicans foram
identificadas, ou seja, confirmadas através do
sistema de identificação API-20 C AUX (Bio
Meurieux, França), (Tabela3). Essas amostras
isoladas de Candidas foram mantidas até a
realização do antifungigrama.
Após a identificação, as amostras foram
submetidas aos testes de susceptibilidade, o teste
foi realizado no Valeclin Laboratório, que cedeu
espaço para realização do teste.
Foi utilizado o método de difusão em ágar,
porém foi testado também o método de inundação,
ou seja, o Pour Plate, onde é intornado o tubo de
cann contendo a diluição na placa de ágar
Sabouraud, conforme indicação do fabricante.
Nesta segunda metodologia, não se obteve
sucesso, pois houve um vasto crescimento de
colônias de leveduras o que dificultou a
visualização dos halos de inibição.
Pelo método de difusão em ágar, foi
primeiramente realizada uma diluição da amostra
de 24h, em solução salina estéril 85% seguindo o
padrão de turbidez 0,5 da escala Mac Farland.
Foram preparadas em placas de petri o meio
de cultura àgar Sabouraud, onde com o auxilio de
um swab estéril realizamos a semeadura por
esgotamento em três direções e deixamos em
repouso durante 15 minutos.
Após o mesmo colocamos os seguintes discos
impregnados com antifúngicos (Anfotericina B,
Fluorocitocina – 5, ketoconazol, Itraconazol e
Fluconazol) da marca CECON, que disponibilizou
os discos para teste. Esses discos de antifúngicos
são os mais indicados em caso de infecção
urinária por leveduras.
Essas placas foram encubadas a 37ºC durante
um período de 48h, para melhor visualização dos
halos de inibição (Figura 1). Após esse tempo de
48 horas foi realizada a leitura, conforme valores
de referência (Tabela 1).
2
Tabela 1: Valor de referência da zona de inibição Tabela 2: Identificação das espécies do gênero
dos agentes antifùngicos Candida.

Zona de Amostras Espécie de Candida

Antifúngicos Interpretação
Inibição (mm)
1 C. albicans
> 20 Sensível 2 C. glabrata
1
KET 20 - 10 Intermediário
3 C. albicans
< 10 Resistente
> 10 Sensível 4 C. glabrata
2
AB ≤ 10 Intermediário 5 C. glabrata
ou Resistente 6 C. albicans
> 19 Sensível 7 C. albicans
3
FLU 19 - 14 Intermediário
< 14 Resistente 8 C. albicans
> 20 Sensível 9 C. albicans
4
FC5 20 -10 Intermediário 10 C. kruzei
< 10 Resistente C. albicans
11
≥ 20 Sensível
ICZ
5
19 - 12 Intermediário 12 C. tropicalis
≤ 11 Resistente 13 C. albicans
1 2
KET = Ketoconazol; AB = Anfotericina B
3 4
FLU = Fluconazol; FC5 = Fluocitosina 5mcg
5
ICZ = Itraconazol Tabela 3: Variação do diâmetro dos halos (em
mm), de amostras isoladas do gênero Candida.
Resultados
1
Halos de inibição dos Antifúngicos
No estudo realizado foram investigadas 111
(100%) amostras de urinas, sendo que cerca de
13 amostras (11,7%) foram positivas para Amostras KET AB FLU FC5 ICZ
leveduras. As espécies de maior ocorrência foram
Candida albicans (61,5%), seguida de Candida S S
glabrata (23,1%), Candida krusei (7,7%) e 1 R R R
23mm 17mm
Candida tropicalis (7,7%). 2
S S
R R R
A leitura do antifungigrama (Tabela 3) foi 25mm 18mm
realizada com muita cautela, apesar desse teste I S
3 R R R
ter sido aprovado e valores finais tenham sido 17mm 19mm
S S
propostos pelo NCCLS – (NATIONAL 4 R R R
22mm 12mm
COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY S S I
STANDARDS). 5 R R
30mm 17mm 17mm
Os resultados obtidos neste trabalho, em sua S
grande maioria, ou seja, 92,3% respectivamente, 6 R R R R
25mm
das amostras apresentaram uma resistência aos 7
I S
R R R
antifúngicos azólicos, que são Intraconazol e 15mm 13mm
Fluconazol, e ao antimetabólito, Fluocitosina – 5, S S I
8 R R
que são os antifungicos mais usados atualmente 22mm 12mm 16mm
I S
no mercado. (Figura1). 9 R R R
12mm 11mm
Os resultados, do perfil de resistência dos S S
isolados de Candidas , frente aos antifúngicos 10 R R R
26mm 12mm
testados como o Itraconazol (92,3%), Fluconazol S S I
(92,3%), seguido de Fluocitosina 5mcg (84,6%), 11 R R
33mm 11mm 17mm
Anfotericina B (7,7%) foram bastante altos. 12
S S
R
S
R
Entretanto, os isolados de Candida, frente ao 25mm 15mm 33mm
antifúngico Cetoconazol, demonstraram-se todas S S
13 R R R
sensíveis. 29mm 12mm
1
Abreviatura conforme descrito na tabela 1.

XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e 3

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Na figura 1 pode-se observar a formação ou a
ausência dos halos de inibição.
A
A B
Figura 1: Antifungigrama – visualização do halo de
inibição das amostras isoladas, A – Candida
albicans amostra 11 e B – Candida tropicalis,
amostra 12.
Discussão
Entre as espécies de fungos relacionadas com
manifestações clínicas, o gênero Candida
apresenta-se como principal responsável por
infecções urinárias hospitalares, principalmente
em setores críticos, como as unidades de terapia
intensiva (MÍMICA, et al., 2009).
No estudo realizado obtivemos em maior
predomínio a espécie albicans (61,5%). Candida
albicans é o patógeno mais comum. Candida
tropicalis, Candida krusei, Candida Parapsilosis e
Candida guilliermondii são encontradas com
menor freqüência. (CROCCO, et al., 2004).
O antifungigrama ainda é pouco conhecido,
sendo este derivado do teste de susceptibilidade
antimicrobiana (Bauer e Kirby , 1956). A partir de
1986 o NCCLS - (NATIONAL COMMITTEE FOR
CLINICAL LABORATORY STANDARDS),
organizou um subcomitê para padronização do
teste de suscetibilidade aos antifúngicos para
leveduras, derivado do método de microdiluição
em caldo.
O teste de disco difusão com discos de
fluconazol utilizando meio Mueller-Hinton ágar
com 2% de glicose e 0,5mg/mL de azul de
metileno é adequado para procedimentos
laboratoriais de triagem da resistência de isolados
de Candida. (MENEZES, et al., 2009).
Atualmente tem-se o método de difusão em ágar,
em meio Sabouraud Dextrose, o qual foi utilizado,
que é bem aceito entre os laboratórios de análises
clínicas e o que foi utilizado nesse trabalho. Mais
ainda não são todos que realizam esse teste que é
uma auxilio no tratamento de infecções por
fungos, nesse caso, leveduras.
Em estudo realizado por Menezes et al. (2009)
evidenciou que no trabalho realizado não houve C.
tropicalis resistente a Anfotericina B, mais que 3
amostras (5,9%) de Candida tropicalis foram
XIII Encontro Latino Americano de Iniciação Científica e
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resistentes ao fluconazol, e 3 (5,9%) resistentes
ao itraconazol, e que os isolados de Candidas
resistentes ao fluconazol também foram
resistentes ao itraconazol. Esses dados são
condizentes com o presente estudo, uma vez que
o isolado de C. tropicalis (7,7%) apresentou
resultado semelhante.
O fluconazol é um antifúngico azólico bem
tolerado e que possui uma boa atividade clínica
sob o isolado de Candida spp. O uso aumentado
desta droga deu origem ao desenvolvimento de
resistência de Candida spp., principalmente C.
glabrata e C. krusei isoladas. (JUNIOR, et al.,
2005). No presente estudo verificou-se também
essa resistência ao fluconazol, sendo apenas 1
amostra (7,7%) que apresentou halo com zona de
inibição intermediária.
Mujica et al. (2004), evidenciou em seu artigo
que (93,5%) espécies de Candida, sendo elas da
espécie albicans apresentou sensibildade ao
fluconazol. Entretanto, este estudo mostra que
100% das C. albicans foram resistentes a este
antifúngico.
Em relação à técnica empregada para os
ensaios do perfil de sensibilidade, foi observado
um ótimo crescimento da levedura em Agar
Sabouraud Dextrose com os antifúngicos bem
como a visualização dos halos de inibição e
facilidade na execução do ensaio, podendo ser
implantado no laboratório como rotina.
Conclusão
Os resultados obtidos, no presente trabalho,
demonstram que os antifúngicos convencionais
testados em amostras clínicas em isolados do
gênero Candida, apresentaram uma significativa
resistência aos antifúngicos mais utilizados, que
são os derivados azólicos. Demonstrando assim,
uma maior resistência e conseqüentemente
resultando em poucas opções de tratamento ao
paciente, mais ainda é válido, pois através desse
teste de susceptibilidade, promove a terapêutica
correta dos pacientes acometidos por estas
infecções.
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