Síntesis de Acido Desoxirribonucleico
complementario a partir de una muestra
de RNA por acción de la Transcriptasa
Reversa
Dependencia: Escuela Profesional de Ingenieria Biotecnologica.
Campus de la Universidad Catolica de Santa Maria
Arequipa
INTRODUCCION
La Transcriptasa reversa, o mejor
conocida como Transcriptasa
inversa, es la enzima que sirve para
construir una molécula de ADN, a
partir de una de ARN, el proceso es
el que utilizan los llamados
Retrovirus, como lo es el virus del
VIH (SIDA).
Los retrovirus son virus de tipo
ARN, o sea que su material
hereditario (por así llamarlo) se
concentra en esa molécula, por lo
que necesitan de la transcriptasa
inversa para poder crear moléculas
de ADN que le ayuden a sintetizar
las proteínas que forman al virus,
este proceso se lleva a cabo dentro
de una célula infectada.
La importancia de esta enzima está
en que puede ser utilizada para que
a partir del RNA pueda sintetizarse
una cadena de DNA, proceso
inverso al que se nos enseña en el
Dogma de la Biología Molecular.
El ADN complementario ADNc
(cDNA) es una molécula de ADN
complementaria a una molécula de
ARNm. Se genera por acción de la
enzima trasncriptasa inversa y
tiene múltiples usos tanto en
investigación básica como aplicada
a biotecnologia.
Una mezcla de mRNA se utiliza
como molde para sintetizar una
cadena de RNA. Para que la
reacción se lleve a cabo se necesira
de un cebador, que se va a valer de
la cola de poliAdenina en el lado 3
prima del mRNA eucariotico, este
cebador se llama oligoT, y tiene de
12 a 18 bases; va a hibridar con la
secuencia de poliA (hay que tener
en cuenta que como las uniones
Adenina-Timina requieren sólo de
dos puentes de Hidrogeno lo cual
facilita la unión.
Las moléculas de ADNc se obtienen
mediante la enzima transcriptasa
inversa a partir de las moléculas de
ARNm de la célula. La transcriptasa
inversa procede de retrovirus y usa
como molde una cadena sencilla de
ARN para dar lugar a una cadena
sencilla de ADNc.
La transcriptasa inversa emplea
ARNm maduro como molde y por
tanto el ADNc no contiene los
intrones que poseen los genes
eucariotas. Así la secuencias de
ADNc corresponden únicamente
secuencias codificadoras de
proteínas.
Luego de la síntesis del cDNA, se
desnaturaliza el hibrido o se
hidroliza el mRNA con álcali para
obtener asi solo la cadena de cDNA.
El proceso se explica mejor en el
siguiente esquema [3]
Los usos del ADNc son múltiples:
 Creación de genotecas de
expresión. Librerías de ADNc
correspondiente al conjunto
de genes expresados en un
estado determinado. Los
fragmentos de ADNc se
integran en un vector y se
generan clonos expresando
cada uno de los fragmentos.
 Empleo de ADNc como
sondas marcadas en
microarrays de expresión. Se
está avanzando mucho en el
desarrollo de microarrays
basados en ADNc orientados
a la prevención, diagnóstico
y seguimiento de distintas
enfermedades.
 Clonación de genes
integrando el ADNc
correspondiente al gen en un
vector bacteriano. Este
sistema permite obtener
grandes cantidades de
proteína en las células
transformadas.
 Deducción de la secuencia de
aminoácidos de la proteína
correspondiente al ARNm del
que procede el ADNc.
Materiales
Se utilizó una muestra de RNA
aislada en la anterior práctica. Para
la síntesis de cDNA se utilizó
1microlitro de oligoT y agua libre de
nucleasas proporcionado por los
laboratorios de la Universidad. Para
la reacción en cadena de la
Polimerasa se utilizaron
8microlitros de supermix, el cual
contiene enzimas y bases puricas,
necesarias para dicha reaccióny
además de primer tubulina. Para la
corrida electroforética se utilizó un
gel de agarosa al 1.5%, preparado
por alumnos de la Escuela
Profesional, además de loading
buffer para marcar el recorrido de
la muestra.
Metodología
El tubo que contenia RNA fue
llevado a centrifuga durante 10
minutos, a 12 000 revoluciones por Conclusiones
minuto. Una vez sacando el tubo de El aislamiento de RNAm durante la
la centrifuga, se puso observar un anterior practica no se dio de
pequeño pellet en la basen un tubo, manera adecuada, por lo que era
se conservó sólo dicho pellet y el casi imposible que se muestre
sobrenadante quedó descartado. cDNA.
Luego, se le agregaron 50ul de agua
libre de nucleasas y se llevó al Referencias
Termoblot a 50°C durante 10
minutos. Luego, en otro tubo, esta
 DNA complementario.
vez uno para PCR (más pequeño), Disponible en
se colocaron 2ul del RNA, 1ul de la http://medmol.es/glosario/9
mezcla de OligoT, 9ul de agua libre 4/
de nucleasas y 8ul de supermix. Se  Retrotranscripción de RNA.
llevó al termociclador, Disponible en
programándolo para que esté a https://www.iib.uam.es/port
42°C durante 60 minutos y a 70°C al/documents/76122/76162
durante 5 minutos. En una corrida /RETROTRANSCRIPCION+D
electroforética, el loading buffer se E+ARN+V2.pdf/4e93a2a0-
siembra junto con las moléculas a de61-40c1-9d93-
estudiar en una lamina en gel de d20d73b5df30
agarosa para que corra del anodo al  cDNA. Disponible en
catodo, ya que nuestra molecula http://www.cecalc.ula.ve/bi
desoxirribonuucleica tiene carga oinformatica/BIOTUTOR/pre
negativa.
gs/c_dna.htm
5 Resultados
 Construcción de una
Se debería mostrar una bandita de
Genoteca de Cdna de
pequeño peso molecular (ya que
Plasmodium Falciparum.
mostraría un avance relativamente
Rosalba González Peña,
largo) correspondiente a la
Universidad Nacional de
secuencia de DNA complementario,
Colombia. Disponible en
sin embargo, no se visualizó dicho
https://encolombia.com/me
resultado.
dicina/revistas-
medicas/enfermeria/ve-
33/enfermeria3300-
construccion/
 Devlin Thomas. Bioquimica,
libro de texto con
aplicaciones clinicas. Quinta
edición, editorial