1.08512.

0500 Preparación des muestras

La toma de muestra debe ser realizada por personal especializado.

1.08512.2500 Esputo
Para liberar micobacterias de mucosidad y conjuntos celulares se debería tratar
el esputo previamente con Sputofluol®. En esto, el principio activo hipoclorita
Microscopía disuelve el material orgánico de forma oxidativa, liberando de esta manera las
micobacterias con suavidad.
Preparación del reactivo: Preparación de la solución de Sputofluol® 15 %
Tb-color carbolfucsina en solución Para preparar aprox. 100 ml de solución se añaden juntos:

para tinción microscópica en frío de micobacterias Sputofluol® 15 ml

Agua destilada 85 ml

Preparación de muestra en tubo de centrífuga:

Producto sanitario para diagnóstico in vitro Muestra 1 parte

(mínimo 2 ml)
Solución de Sputofluol® (al 15 % en agua destilada) 3 partes
El presente “Tb-color carbolfucsina en solución - para tinción microscópica en
frío de micobacterias” es utilizado para el diagnóstico celular en la medicina Agitar vigorosamente 10 minutos
humana, se empleo en el examen bacteriológico e histológico de muestras de Centrifugar a 3000 - 4800 R/min 20 minutos
origen humano. Se trata de una solución de colorante lista para el uso que, junto
con otros materiales de diagnóstico in vitro pertenecientes a nuestra cartera, Decantar el líquido excedente
hace evaluables determinadas para el diagnóstico estructuras de destino bacte- Extender el sedimento
rianas (p. ej. micobacterias resistentes a los ácidos, mediante fijación, inclusión, Secar al aire
tinción, contratinción, montaje) en material de examen bacteriológico e histológi-
co, como pueden ser frotis de cultivos bacterianos de enriquecimiento o cortes
histológicos p. ej. del pulmón. Líquidos extraídos por punción, lavados, sedimentos
Extender las muestras en el portaobjetos después de pasos convenientes de
Principio enriquecimiento, y dejarlas secar al aire.
Las micobacterias absorben los colorantes sólo muy lentamente debido a la ele- Cortes histológicos
vada proporción de ceras y lípidos en la pared celular. Para acelerar la absorción
del colorante fucsina y así la formación del complejo micolatofucsina en la pared Tb-color carbolfucsina en solución puede ser utilizada para la tinción de cortes
celular, se calienta la solución de carbolfucsina aplicada sobre el preparado nor- histológicos.
malmente hasta formación de vapores. Aquí no es necesario el calentamiento Para la tinción de preparados histológicos, la solución de azul de metileno según
gracias a una modificación de la Tb-color carbolfucsina en solución (método de Löffler, art. 101287, debería ser utilizada en una dilución de 1+9.
Kinyoun). Desparafinar de forma habitual los cortes y rehidratar en serie descendente de
Una vez las micobacterias han absorbido el colorante, a penas lo ceden de nue- alcohol. Para pruebas fijadas con formalina se suprime el tratamiento previo con
vo a pesar de tratamiento intensivo con solución decolorante, como p. ej. ácido Sputofluol®.
clorhídrico-alcohol. Las micobacterias son por ello denominadas como de tinción
sólida frente ácidos y alcohol y aparecen en el preparado microscópico teñidas Fijación
de rojo, mientras que todos los microorganismos no resistentes a los ácidos se
La fijación se realiza sobre la llama del mechero de Bunsen (2 a 3 veces, evitan-
tiñen de acuerdo con la contratinción. En el presente instrucción de empleo se
do una acción excesiva del calor).
contratiñe de la forma correspondiente con verde de malaqita o azul de metileno.
El material también puede ser fijado durante 20 minutos a una temperatura de
A través de un tratamiento previo de los preparados con Sputofluol® se liberan
100 a 110 °C en un armario de secado o encima de una placa calefactora.
las bacterias del esputo viscoso y material celular circundante. El Sputofluol®
Si se aplican temperaturas más elevadas o un calentamiento más prolongado,
tiene además un efecto desinfectante por el cual se consigue la eliminación de
deberá esperarse un empeoramiento de la capacidad de tinción.
microorganismos.
Todas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la tecnología.
Material de las muestras Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.
Frotis de material bacteriológico secados al aire, termofijados y sometidos a un Deben usarse instrumentos adecuados para la toma de muestras y en la prepa-
tratamiento previo con Sputofluol® como esputos, frotis tomados de punciones ración, y deben seguirse las instrucciones del fabricante para la aplicación / el
aspirativas con aguja fina (PAAF/FNAB), soluciones de lavado, imprints, efusio- empleo.
nes, pus, exsudados, cultivos líquidos y sólidos
Cortes de tejido de origen humano fijados con formalina e incluidos en parafina Preparación del reactivo
(cortes de parafina con 3 - 5 µm de espesor) La Tb-color carbolfucsina en solución - para tinción microscópica en frío de
micobacterias está lista para el uso, la dilución de la solución no es necesaria y
Reactivos empeora el resultado de la tinción así como la estabilidad.
Art. 108512
Tb-color carbolfucsina en solución 500 ml, 2,5 l Técnica
para tinción microscópica en frío de micobacterias Para conseguir un óptimo resultado de tinción, deberían respetarse los períodos
indicados.
Necesario además:
Art. 100327 Ácido clorhídrico-alcohol para microscopía 1 l, 5 l Tinción de preparados de frotis
Art. 101287 Azul de metileno en solución según Löffler 100 ml, 500 ml, Tinción en el banco de tinción
para microscopía 2,5 l
Art. 108000 Sputofluol® para microbiología y microscopía 1l Portaobjetos con frotis fijado
Art. 110630 Tb-color verde malaquita (oxalate) en solución 500 ml Tb-color carbolfucsina en cubrir completamente y teñir 5 minutos
para examen microscópico de micobacterias solución
(tinción en frío)
Agua corriente del grifo enjuagar hasta que ya no se
desprendan nubes de color
Alternativamente:
En lugar de la combinación de los reactivos sueltos puede utilizarse también el Ácido clorhídrico-alcohol cubrir completamente y 15 - 30
kit de tinción 1.16450.0001: dejar actuar segundos*
Agua corriente del grifo enjuagar inmediatamente
Art. 1.16450.0001
Tb-color Kit de tinción 1 set Tb-color verde malaquita cubrir completamente y 1 minuto
para examen microscópico de micobacterias (tinción en frío) (oxalate) en solución dejar actuar
Agua corriente del grifo enjuagar cuidosamente
Secar al aire (p. ej. durante la noche o a 50 °C en el armario de secado)

* en dependencia del espesor del material

Tinción en la cubeta de 60 ml de Hellendahl Tinción de preparados histológicos
Los portaobjetos han de ser inmersos y movidos en las soluciones, la simple Desparafinar de forma habitual los preparados histológicos y rehidratar en serie
introducción proporcionará resultados de tinción insuficientes. descendente de alcohol.
Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes Los portaobjetos han de ser inmersos y movidos breve en las soluciones, la simple
pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de solu- introducción proporcionará resultados de tinción insuficientes.
ciones. Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes
pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de solu-
Portaobjetos con frotis fijado ciones.
Tb-color carbolfucsina en solución 5 minutos
Portaobjetos con tejido histológico
Agua corriente del grifo 45 segundos
Tb-color carbolfucsina en solución 30 minutos
Ácido clorhídrico-alcohol 15 - 30 segundos*
Agua corriente del grifo 45 segundos
Agua corriente del grifo 15 segundos
Ácido clorhídrico-alcohol 15 segundos
Tb-color verde malaquita (oxalate) en solución 5 minutos
Agua corriente del grifo 15 segundos
Lavar con agua corriente del grifo** 10 segundos
Azul de metileno en solución según Löffler* 5 minutos
Montar con Aquatex® y cubreobjetos.
Lavar con agua del grifo 10 segundos
* en dependencia del espesor del material Etanol 70 % 1 minuto
** Para evitar el arrastre del colorante no deshidratar los cortes tras la contra-
tinción con Tb-color verde malaquita (oxalate) en solución. Etanol 70 % 1 minuto
Etanol 96 % 1 minuto
Tinción en el aparato automático de tinción Etanol 96 % 1 minuto
Los portaobjetos deberían ser escurridos bien por goteo después de los diferentes
Etanol 100 % 1 minuto
pasos de tinción, de esta manera se podrá evitar el innecesario arrastre de solu-
ciones. Etanol 100 % 1 minuto

Reactivo Tiempo Estación Xileno o Neo-Clear® 5 minutos

Portaobjetos con frotis fijado Xileno o Neo-Clear® 5 minutos

Tb-color carbolfucsina en solución* 5 minutos 1 Montar con Neo-Mount los preparados humedecidos con Neo-Clear®, o los
®

preparados humedecidos con xileno con p. ej. Entellan® Nuevo y cubreobjetos.

Lavar con agua del grifo 45 segundos 5
Ácido clorhídrico-alcohol 15 segundos 2 * Para la contratinción de preparados histológicos se recomienda la solución de
azul de metileno según Löffler en una dilución de 1+9. El colorante de azul de
Lavar con agua del grifo 15 segundos 5 metileno no es eliminado del tejido por lavado durante la deshidratación.
Tb-color verde malaquita (oxalate) en 60 segundos 3
solución Los preparados histológicos pueden ser montados y almacenados con medios
de montaje anhidros (p. ej. Neo-Mount®, Entellan® Nuevo o DPX nuevo) y cubre-
Lavar con agua del grifo 10 segundos 5 objetos después de la deshidratación (series de alcohol ascendentes) y la
Secar al aire (p. ej. 3 minutos en la estación 6, o durante la noche o a 50 °C en clarificación con xileno o Neo-Clear®.
el armario de secado) Para el análisis de preparados teñidos con un aumento microscópico >40x se
recomienda el uso de aceite de inmersión.
* Cambiar la solución en la estación 1 después de 10 a 15 pasadas, o cuando
se haga necesario. Resultado
Micobacterias rojo
Para el almacenamiento de preparados bacteriológicos durante varios meses Fondo azul claro
se recomienda el montaje con medios de montaje anhidros (p. ej. Neo-Mount®,
Entellan® Nuevo o DPX nuevo) y cubreobjetos. Para ello, los preparados han de Evaluación
ser secados con gran esmero. Sin montaje, la tinción tendrá una estabilidad de Un hallazgo positivo significa que “hay bacilos acidorresistentes“, y un hallazgo
unos 3 días; si se cubre con aceite de inmersión, la estabilidad será de sólo unas negativo significa que “no hay bacilos acidorresistentes“. No se puede distinguir
horas. si se trata de Mycobacterium tuberculosis o de otro género de micobacteria.
Para el análisis de preparados teñidos con un aumento microscópico >40x se Tampoco se puede verificar la vitalidad de las bacterias (activas, inactivas).
recomienda el uso de aceite de inmersión. Si se encuentran micobacterias, deberían efectuarse más pruebas en laborato-
rios especiales.
Resultado
Micobacterias rojo Localización de errores
Fondo verde claro Fijación
Es importante realizar una termofijación suficiente por medio de un mechero
Bunsen o en un armario de calor para eliminar el potencial infeccioso de los
preparados y evitar que las bacterias sigan creciendo.

Ninguna tinción de micobacterias

El paso crítico en la tinción de micobacterias es el paso de descoloración, que
puede ser influenciado por el espesor del frotis.
Por lo demás, una solución recién preparada de ácido clorhídrico-alcohol es
muy reactiva, por lo que el resultado debería ser evaluado con gran esmero.
Durante la descoloración, los tiempos indicados aquí deberían ser respetados
con máxima exactitud, ya que de lo contrario se podrían presentar resultados
incorrectamente negativos.

Fuerte tinción de fondo

Si la tinción de fondo es demasiado intensa (azul oscuro) en preparados his-
tológicos se recomienda el uso de una solución de trabajo de azul de metileno
según Löffler con una dilución de 1+9.
En este contexto cabe destacar una tendencia a la tinción excesiva sobre todo
en tejidos compactos, mientras que el período de incubación necesario para teji-
dos “esponjosos”, como el pulmón, es mayor (5 minutos como viene indicado).

Notas técnicas
El microscopio usado debería corresponder a los requisitos de un laboratorio de
diagnóstico médico.
Si se utilizan aparatos automáticos de tinción, deberán tenerse en cuenta las
instrucciones de operación del fabricante, tanto del aparato como del software.
Eliminar el aceite de inmersión en exceso antes de archivar.
Diagnóstico
Los diagnósticos deberán ser establecidos solamente por personas autorizadas
y cualificadas.
Deberán emplearse terminologías vigentes.
Deberán elegirse y realizarse ensayos ulteriores según métodos reconocidos.
Cada aplicación debería implicar controles adecuados (p. ej. ISOSLIDE® AFB,
art. 1.02560.0001) para descartar resultados erróneos.
Almacenamiento
Guardar la Tb-color carbolfucsina en solución - para tinción microscópica en frío
de micobacterias de +15 °C a +25 °C.
Estabilidad
La Tb-color carbolfucsina en solución - para tinción microscópica en frío de mico-
bacterias se puede utilizar hasta la fecha de caducidad indicada.
Después de abrir el frasco por primera vez, el contenido almacenado entre +15 °C
y +25 °C es utilizable hasta la fecha de caducidad indicada.
Los frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.
Capacidad
aprox. 250 tinciones / 500 ml
Art. 109843 Neo-Clear® (sustituto de xileno) 5l
para microscopía
Art. 110630 Tb-color verde malaquita (oxalate) en solución 500 ml
para examen microscópico de micobacterias
(tinción en frío)
Art. 116450 Tb-color kit de tinción 1 set
para examen microscópico de micobacterias
por tinción en frío
Clasificación de substancias peligrosas
Art. 108512
Tener en cuenta la clasificación de substancias peligrosas en la etiqueta y las
indicaciones en la ficha de datos de seguridad.
La ficha de seguridad está disponible en el sitio web y a solicitud.
Componentes principales del producto
108512
C.l. 42520 o 42510 6 g/l*
C6H5OH 40 g/l
1 l = 0,99 kg
* Ambos colorantes pueden ser utilizados para preparar una solución, el resultado de la tinción
resenta la misma sensibilidad y especificidad.

Notas sobre el empleo

Solamente para uso profesional.
Otros productos de IVD
Para evitar errores, la aplicación debería ser realizada por personal especializado. Art. 101603 Gram-color modificado 1 set
Deben cumplirse las directivas nacionales sobre seguridad en el trabajo y ase- (exento de fenol) kit de tinción para la tinción
guramiento de la calidad. de Gram de preparados bacteriológicos
Deben emplearse microscopios equipados de acuerdo con el estándar. Art. 105174 Hematoxilina en solución modificada según 500 ml, 1 l, 2,5 l
Si es necesario, deberá utilizarse una centrifugadora que corresponda al están- Gill III
dar de laboratorios y a las exigencias. para microscopía
Art. 109204 Azur-eosina-azul de metileno según Giemsa 100 ml, 500 ml,
Protección contra infecciones en solución para microscopía 1 l, 2,5 l
Debe observarse a toda costa una protección eficaz contra infecciones de acuer- Art. 109215 Fucsina fenicada en solución según 100 ml, 500 ml,
do con las directivas de laboratorio. Ziehl-Neelsen 2,5 l
para microscopía
Indicaciones para la eliminación de residuos Art. 111609 Histosec® pastillas 1 kg, 10 kg (4x
El envase debe ser eliminado de acuerdo con las directivas válidas de elimina- punto de solidificación 56-58°C 2,5 kg), 25 kg
ción de residuos. medio de inclusión para histología
Las soluciones usadas y las soluciones caducadas deben eliminarse como Art. 111885 Gram-color 1 set
desecho peligroso, debiéndose cumplir las directivas locales de eliminación de Equipo de tinción para la tinción de Gram
residuos. Podrá pedirse información sobre los procedimientos de eliminación Art. 115355 CYTOCOLOR® 6x 500 ml
bajo el Quick Link “Hints for Disposal of Microscopy Products” en Tinción citológica estándar según Szczepanik
www.microscopy-products.com. Dentro de la UE tiene validez el REGLAMENTO para microscopía
(CE) Nº 1272/2008 sobre la clasificación, el etiquetado y el envasado de sustan-
cias y mezclas, por el que se modifican y derogan las Directivas 67/548/CEE y
Literatura
1999/45/CE y se modifica el Reglamento (CE) Nº 1907/2006.
1. Romeis - Mikroskopische Technik, Editors: Mulisch, Maria, Welsch, Ulrich,
2015, Springer-Verlag Berlin Heidelberg
Reactivos auxiliares
2. Theory and Practice of Histological Techniques, John D Bancroft and Marilyn
Art. 100327 Ácido clorhídrico-alcohol 1 l, 5 l Gamble, 6th Edition
para microscopía
3. Theory and application of Microbiological Assay, Hewitt, W. and Vincent, S.,
Art. 100497 Tb-color modificado 1 set 1989, Academic Press
Kit de tinción para la identificación de mico-
bacterias (AFB) mediante tinción en caliente 4. Conn’s Biological Stains: A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for
Use in Biology and Medicine, 10th Edition, (ed. Horobin, R.W. and Kiernan,
Art. 100579 DPX nuevo 500 ml J.A). Bios, 2002
medio de montaje anhidro
para microscopía
Art. 100869 Entellan® nuevo para montadores de 500 ml
cubreobjetos para microscopía
Art. 101287 Azul de metileno en solución según Löffler 100 ml, 500 ml,
para microscopía 2,5 l
Art. 101597 Tb-Fluor exento de fenol 1 set
kit de tinción para examen de micobacterias
por microscopía de fluorescenia (tinción con
auramina-rodamina)
Art. 102560 ISOSLIDE® AFB Preparados de control 25 tests
con tejido de referencia para la detección de
micobaterias en tejido histológico
Art. 104699 Aceite de inmersión frasco gotero de
para microscopía 100 ml, 100 ml,
500 ml
Art. 107961 Entellan® Nuevo 100 ml, 500 ml, Consult instructions Manufacturer Catalog number Batch code
medio de montaje rápido 1l for use
para microscopía
Art. 108000 Sputofluol®
para microbiología y microscopía 1l
Art. 108298 Xileno (mezcla de isómeros) 4l Caution, consult Use by Temperature
para histología accompanying documents YYYY-MM-DD limitation
Art. 108562 Aquatex® frasco gotero de
(medio de montaje acuoso) 50 ml
para microscopía Status: 2017-07-28
Art. 109016 Neo-Mount® 100 ml, 500 ml
medio de montaje anhidro Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany
para microscopía Tel. +49(0)6151 72-2440
Art. 109093 Tb-flúor 6x 500 ml www.microscopy-products.com
Equipo de tinción para examen de mico-
baterias por microscopía fluorescente EMD Millipore Corporation, 290 Concord Road, Billerica,
MA 01821, USA, Tel. +1-978-715-4321