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I. EL PROBLEMA
Figura 1. La mitocondria
El ciclo de Krebs
Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimáticos se encuentran localizados en la matriz mitocondrial
con excepción de la succínico deshidrogenasa proteína integral de la membrana interna.
Este proceso metabólico permite la descarboxilación de los esqueletos carbonados que le llegan en forma
de Acetil CoA, provenientes de diferentes compuestos (carbohidratos, ácidos grasos, aminoácidos). Esta vía
metabólica oxidativa está asociada a la reducción de las coenzimas FAD y NAD +, que finalmente ingresan a la
cadena de transporte electrónico para su reoxidación (ver figura 2).
La succínico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una enzima que remueve dos
protones y dos electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada a la coenzima FAD +,
que transfiere los electrones a la cadena de transporte electrónico. Este proceso lo inhibe en forma
competitiva la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato, oxalacetato y y oxalato, los cuales
se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situación que genera la acumulación de succinato.
El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrónico artificial como el azul de
metileno que es coloreado en su estado oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida que se reoxida la
coenzima FAD. Cuando éste indicador de oxido – reducción se encuentra en contacto con el O 2 del aire se
reoxida tomando de nuevo la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno. Cuando el azul de
metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoxida tomando la coloración azul y
formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla mediante una capa de aceite mineral.
La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa
Este flujo de electrones es exergónico por esto tres complejos enzimáticos de la cadena respiratoria utilizan
la energía liberada para bombear protones al espacio intermembrana de las mitocondrias, generando un
potencial electroquímico que pormueve después el regreso de los protones a la matriz mitocondrial y la
síntesís de ATP através del complejo V o la ATP sintasa.
Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores más fuertes como es el caso de ión cianuro (CN-), azida
(N3-), monóxido de carbono (CO) y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente este complejo
enzimático. Con ello se ve interrumpido el transporte electrónico y se deja de utilizar el O 2 generando una
condición de cianosis celular.
La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de aceptores
electrónicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos de los
complejos de la cadena respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza
fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.
La siguiente ecuación química representa la acción de esta sustancia indicadora de las reacciones de oxido –
reducción en los sistemas in vitro.
III. REACTIVOS.
IV. MATERIALES.
MATERIAL DE PRUEBA.
Tejido muscular, hepático, cardíaco de vaca, conejo o ave, bien fresco (traído del matadero ese mismo día).
V. PROCEDIMIENTO.
Procedimiento para el monitor: Pesar una muestra de aproximadamente 6 g de tejido libre de sangre y
colocarla en un mortero con arena lavada, enfriada previamente en un baño de hielo. Proceder a macerar
cuidadosamente hasta formar una pasta suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de
buffer fosfato pH 7,4, hasta completar un volumen de aproximadamente 18 mL. Transferir la mezcla a un
erlenmeyer de 150mL y mantenerlo en un baño con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente.
Pasar la muestra a tubos de centrífuga y centrifugar a 1500 rpm por 7 minutos. Transferir el sobrenadante a
otro erlenmeyer de 150mL y marcarlo como extracto enzimático; mantenerlo en baño de hielo hasta su
posterior uso.
Preparar una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la Tabla 1, hasta adicionar el
agua. Dejar los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos y sin retirarlos del baño agregar el extracto
enzimático y la p-fenilendiamina, agitar bien, este momento corresponde al tiempo cero, observar y
registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado, el color final y la intensidad del color.
Tubos
Blanco 1 2 3 4
Reactivos (mL)
Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la tabla 2. Antes de agregar el
extracto enzimático, deje los tubos incubando a 37ºC durante 10 minutos, y sin retirarlos del baño agregue
el extracto enzimático, inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el
momento en que colocó el extracto enzimático y anote el tiempo en que cambia el color, color e intensidad
de color final.
Tabla 2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa
Tubos
Blanco 1 2 3 4 5
Reactivos
mL
Buffer fosfato pH 7.4 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 1,0
Succinato de sodio 1% 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Azul de metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5
Malonato de sodio 1%. 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Oxalato de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0
Extracto enzimático 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1,0
VI. BIBLIOGRAFÍA.
- MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. (2002). Bioquímica. 3 ed. Madrid: Addison Wesley.
- PLUMMER, D. (1981). Bioquímica práctica. México: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana.
- NELSON, David. L. y COX, Michael. Lehninger. Principles of Biochemistry. 3 ed. New York: Worth Publischer,
1993.
PREINFORME E INFORME
2-Para los órganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es más fermentativo (anaerobio) o
aerobio, tenga en cuenta el color característico de los citocromos que hacen parte de la fosforilación
oxidativa.
3- tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la cadena respiratoria, así como
del azul de metileno y la p-fenilendiamina, compuesto que se usarán para evidenciar la actividad de las
enzimas citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa.
4- De acuerdo con el fundamento teórico de la guía y la bibliografía describa brevemente los cambios de
color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina cuando:
Diagrama de flujo
Diagrama de flujo
2. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa
Diagrama de flujo
Fichas técnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),
extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o
peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA