UNIVERSIDAD

NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA
CARRERA MÉDICO CIRUJANO
M. Enfermedades infecciosas, microbiología y
parasitología médicas

Práctica I

Cultivo, aislamiento e identificación bacteriana

Objetivos

● Que el estudiante conozca y realice dos de las diversas técnicas de siembra de cultivos de bacterias en medios
sólidos.
● El alumno efectuará el aislamiento de cultivos bacterianos primarios en medios sólidos.
● Conocer, seleccionar y realizar de manera adecuada la toma de muestra biológica para cultivos bacterianos
primarios.
● Se realizará la tinción más utilizada para la diferenciación de bacterias (tinción de Gram)
● Los alumnos podrán observar el grupo al cual pertenecen (Gram positivas o Gram negativas) las bacterias
aisladas en el cultivo primario. Así mismo el estudiante distinguirá y describirá las diferentes morfologías
bacterianas que presentan los cultivos bacterianos primarios con la ayuda del microscopio.
● Los alumnos investigarán la composición del medio de cultivo bacteriano primario utilizado en la práctica.
● Se mencionará de manera general la utilidad que tienen los medios de cultivo y la aplicación de usar medios
diferenciales y selectivos en lugar de un medio de cultivo general.

Introducción:

Louis Pasteur desechó la hipótesis de la generación espontánea. Pero fue Gustav Henle (1809-1885) quien señaló por
primera vez las pautas para considerar que un germen (microorganismo) era la causa de una enfermedad determinada.
[1]. Los perfeccionamientos técnicos introducidos por Robert Koch (1843-1910) y sus colaboradores, tales como los
medios de cultivos sólidos, le permitieron emitir a Koch en 1882 sus famosos postulados, que son los siguientes:
1. El microorganismo debe estar presente, en abundancia, en los tejidos, sangre o excretas del animal que sufre la
enfermedad.
2. Debe ser aislado y estudiado en cultivo puro.
3. Debe ser capaz de reproducir la misma enfermedad cuando es inoculado a animales sanos.
4. Debe ser encontrado, también en abundancia, en los animales así inoculados experimentalmente (6).
Las bacterias, hongos y protozoos se miden en micrómetros (μm), por lo que resulta necesario utilizar el microscopio
óptico para poder observarlos. Estos microorganismos pueden ser clasificados basados en estructuras celulares como
morfología, patrones de tinción. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano con estructuras
que las hacen diferentes. Muchas bacterias disponen de flagelos, pilis o fimbrias, cápsulas, otras presentan o no movilidad.
La observación de las estructuras de los microorganismos se facilita utilizando muestras teñidas, para ello se tiñen con
colorantes que son compuestos químicos para aumentar el contraste (4).

Fundamento:
El sistema respiratorio se divide en vías altas o superiores, que comprenden las áreas anteriores a la laringe, incluyendo la
nasofaringe, orofaringe, laringe, epiglotis, oído externo y medio, y los senos paranásales, y vías bajas o inferiores que
incluyen todas las estructuras posteriores a la laringe. El tracto respiratorio habitual (la faringe) está formado por distintos
microorganismos entre los que destacan los siguientes grupos y especies: Streptococcus, Staphylococcus, Micrococcus,
Neisserias, Moraxella catarrhalis, Corynebacterium, Haemophilus spp, Porphyromonas spp, Prevotella, Fusobacterium,
Veillonela, Peptostreptococcus, Actinomyces, etc. Sin embargo, cuando encontramos una patología en la faringe, el
agente etiológico más frecuentemente aislado es el Streptococcus pyogenes, pero también, otros microorganismos
patógenos que podemos hallar son: Streptococcus pneumoniae, Streptococcus alfa-hemolítico, etc (5).

Frotis bacteriano.
Las tinciones aumentan artificialmente el contraste entre las células bacterianas y el medio circundante. Se requiere que la
muestra de estudio se someta al proceso de fijación para ser observada, ya sea en un frotis o en extensión sobre
portaobjetos, lo que asegura una adecuada separación en las células y permite se distribuya de forma homogénea y
posteriormente se realiza la tinción siguiendo los procedimientos adecuados (7).

Fijación con calor:
Se toma una pequeña porción de muestra del medio de cultivo sin desgarrar el medio con una asa bacteriológica
esterilizada en la flama y enfriar en un extremo del cultivo sin dañar las colonias, utiliza un portaobjeto, coloca una gota de
solución salina o agua destilada y realiza una extensión, se deja secar al aire; inmediato se pasa la preparación sobre la
llama de un mechero sin quemar la muestra, quedando de esta forma fijada la muestra (7).

Colorantes:
Son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los materiales celulares. Algunos colorantes utilizados
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucléicos y polisacáridos. Colorantes catiónicos son el azul de metileno, cristal violeta y la
safranina (7).

Tinción de Gram:
La diferenciación entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se establece en la naturaleza y características de la
pared celular bacteriana (3).

Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglicano que es capaz de retener al complejo colorante-
mordente (cristal violeta-yodo). Durante la decoloración con alcohol acetona se provoca una deshidratación de esta
gruesa pared y se reduce la porosidad, atrapando entonces al complejo en el interior de la célula. Las bacterias Gram
negativas, poseen una delgada capa de peptidoglicano no puede impedir la salida del complejo colorante-mordente
(cristal violeta-yodo) y es fácilmente teñida por el colorante secundario o de contraste.
Los dos grupos bacterianos a los que nos referimos tendrán diferente color, con el que finalmente se tiñen las bacterias.
Gram positivas se observarán de color violeta o morado por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los
pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial con los siguientes pasos y se teñirán de roja o
rosa debido a la safranina (2).


Mordentes:
Los mordentes intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula con el colorante, esta sustancia puede ser
el Lugol (solución de yoduro de potasio)

Precauciones
Realizar la toma de muestras y manipular los cultivos con el cuidado pertinente, utilizar guantes y cubrebocas durante las
actividades, realizar el desecho de muestras biológicas de manera adecuada en las bolsas o contenedores rojos para
desecho de residuos peligrosos biológicamente infecciosos (RPBI).

La toma de muestra, las resiembras, incubaciones tinción y lecturas se podrán efectuar fuera de las sesiones formales, ya
que se trata de actividades muy sencillas que sólo requieren de 10 a 15 minutos por sesión “extraclase”, y su oportuna
realización optimizará el tiempo global de la asignatura.

Cada estudiante podrá utilizar hasta: Para tinción de Gram
2 cajas petri con agar nutritivo (carne de res) por equipo Caja para tinción (Jugo de 1L ), palitos de madera
Hisopos estériles Piseta con agua destilada
Encendedor Frascos goteros para tinción de Gram.
Lápiz Colorante de cristal violeta
Cajas petri con agar nutritivo Lugol (solución de yoduro de potasio)
Solución salina isotónica Decolorante alcohol-acetona (1:1)
Colorante de safranina
Mechero de Bunsen. Aceite de inmersión
Asa bacteriológica y micológica. Toallas de papel
Portaobjetos y cubreobjetos. Papel filtro
Piseta con solución salina Microscopio.


Actividad I (aislamiento):

Técnica y procedimiento

ü Por equipos de 5 integrantes, obtener una muestra biológica proveniente de un alumno participante. Se podrá
realizar la toma de las diferentes zonas de microbiotas humanas: por exudado faríngeo, exudado nasal, exudado
ótico y microbiota de la piel.
ü Para la toma de muestra de exudado faríngeo, deberá ́ encontrarse el alumno con las siguientes características: 4
horas de ayuno, sin beber agua y sin haber realizado en ese lapso de tiempo su higiene bucal.
ü Con el hisopo estéril se realizará raspado enérgico de la región faríngea del participante, evitando contaminar la
muestra con la saliva propia de la persona.
ü Posteriormente realizar la siembra por estría simple o estría cruzada en el medio de agar nutritivo (cultivo
bacteriano primario) para su crecimiento.
ü Los medios de cultivo se incubarán a 35+ 2°C durante 24 y 72 horas.
ü Se realizara un frotis y posteriormente se teñirá con la técnica de Gram y se observará al microscopio para
identificar las características morfológicas y observar el grupo al cual pertenecen los géneros bacterianos aislados
(Gram positivas o Gram negativos).









Pasos de un frotis.

1. Colocar una pequeña gota de agua o solución salina en el centro de un portaobjetos limpio, marcar con lápiz graso en
un extremo las iníciales del microorganismo.

2. Encender el mechero y utilizar la flama azul, flamear el asa de siembra, tomar y acercar a la flama el medio de cultivo de
donde se tomará una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido con el asa bacteriológica, enfriándola en
una esquina del medio sin dañar el cultivo y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta
formar una suspensión homogénea que quede extendida no aglomerada para facilitar su secado.

4. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjeto a la llama del mechero. Una
vez realizado el frotis y fijadas las bacterias se continua con el
proceso de tinción.

Tinción de Gram:

1. Primer colorante. Un colorante básico (+) catión que en
contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con
ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.

2. Solución mordente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad
entre el colorante y las células, solución de yoduro de potasio.
3. Agente decolorante. Es un disolvente orgánico; alcohol acetona
(1:1).
4. Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color
que el primer colorante, como la safranina.


Cuestionario:
1. ¿Cuál es la morfología de los microorganismos observadas al microscopio?
2. ¿A qué géneros podrían corresponder cada una?
3. ¿Cuáles tipos de tinción existen? ¿Cuál fue el tipo de tinción que se utilizó en la práctica y porqué?
4. Dibuje las formas y agrupaciones de las bacterias que se pueden observar al microscopio óptico.
5. Determine cuál(es) microorganismo(s) patógeno(s) de vías respiratorias altas se encuentra(n) presente(s) en la
faringe o amígdalas de su compañero.
6. Determine cuál(es) microorganismo(s) se encuentra(n) presente(s) en el exudado nasal, ótico o dérmico según
haya sido su caso.
7. ¿Qué es un medio de cultivo?
8. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo?
9. ¿Qué es un medio de cultivo enriquecido? Mencione 2 ejemplos.
10. ¿Qué es un medio de cultivo selectivo diferencial? Mencione 2 ejemplos.
11. Cuál fue el tipo de medio que se utilizó en la práctica
12. Dibuje la técnica de estría simple.
13. ¿Cuál es el objetivo de utilizar la técnica de estría simple?
14. Dibuje la técnica de estría cruzada.
15. ¿Cuál es el objetivo de utilizar la técnica de estría cruzada?






Referencias

(1) Hernández Alina Llop. 2001. Microbiología y parasitología médicas. Editorial Ciencias Médicas Ciudad de La
Habana.
(2) http://depa.fquim.unam.mx/bacteriologia/curri.htm
(3) http://www.libros.unam.mx/manual-de-bacteriologia-experimental-depto-de-biologia-9786070235948-
libro.html
(4) http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/pdf/Bacteriologia_2016.pdf
(5) http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/
(6) Madigan M. T, Martinko J. M., Dunlap P.V and Clark D.P., Brock Biología de los microorganismos, 12ª edición, UK,
Pearson Education, 2009.
(7) Broocks G. F., Butel J. S and Morse S. A., Microbiología médica de Jawets, Melnick y adelberg, 19ª edición,
México, Editorial El Manual Moderno, 2008.