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Curso: Inseminación artificial

Profesor: Ing. MSci. Próspero Cabrera


Villanueva

Alumna: Andrea Cavassa Gamarra

Código: 20121242

Tema: Preparación de dilutores para semen de


toro, dilución, refrigeración y congelamiento del
semen

2017
Preparación de dilutores para semen de toro, dilución,
refrigeración y congelamiento del semen

INTRODUCCION
La posibilidad de poder mantener el semen congelado ha provocado un alto desarrollo en el
campo de la reproducción bovina, especialmente si hablamos de la inseminación artificial.

Pero el hecho de mantener semen congelado durante muchos años, no es el punto relevante
sino que la importancia radica en que los espermatozoides pueden sobrevivir y mantener su
vitalidad durante muchos años.

Es por ello que cuando se pretende crio preservar el semen bovino, se debe poner especial
atención en los medios en los cuales se va a realizar su dilución y los crio protectores que se va
a utilizar ya que son la clave para obtener un semen de excelente calidad y en las mejores
condiciones para obtener unos altos niveles de fecundación con la inseminación artificial.

Además decimos que la dilución tiene como objetivo aumentar el volumen total de eyaculado,
de esta manera es posible que tan solo con un eyaculado podamos obtener un mayor número
de pajuelas para la inseminación artificial, para varias hembras; y lo más relevante que le
proporciona a los espermatozoides un ambiente óptimo para que conserven su vitalidad y poder
de fecundación.

Los diluyentes son sustancias con la capacidad de aumentar el volumen de eyaculado y


proporcionar un medio adecuado para la sobrevivencia y poder de fecundación de los
espermatozoides.

Los primeros medios utilizados para diluir el semen fueron principalmente las soluciones salinas
o azucaradas para aumentar el volumen del semen para su empleo inmediato más bien que
como conservadoras de él.

Durante varios años se ha ido investigando y comprobando varias sustancias que tengan la
capacidad de proporcionar un medio adecuado para la crio conservación del semen.

A lo largo de este proceso se ha determinado que para que una sustancia sea considerada como
un diluyente para el semen bovino esta debe tener la capacidad de nutrir, amortiguar y proteger
las células espermáticas.

OBJETIVOS

 Conocer la composición y preparación de dos dilutores Tris en bovinos


 Evaluar los diluyentes para la crio conservación de semen bovino: Tris con glicerina,
tris sin glicerina y Andromed
 Determinar número de dosis y cantidad de dilutor para diferentes volumen de semen
MARCO TEÓRICO
CRIOCONSERVACIÓN DE SEMEN BOVINO

La crio preservación de semen es una importante biotecnología reproductiva, que busca


promover la conservación del germoplasma masculino por tiempo indeterminado. Esta
biotecnología, cuando se asocia a la inseminación artificial, representa un mecanismo
eficiente para la promoción y difusión de material genético de excelente calidad. La crio
preservación de semen proporciona una economía para el productor, al reducir los costos
de alimentación y transporte de los reproductores, así como los riesgos de transmisión de
enfermedades sexualmente transmisibles. (CASTELO, 2008).

“La posibilidad de preservar el semen mediante su congelación abrió una nueva dimensión
al empleo de la inseminación artificial, otorgándole más potencia aún a esta valiosa
biotecnología reproductiva”. (ROLDÁN., 2006).

Dentro de la crio conservación del semen bovino debemos tener en cuenta que lo
importante es lograr obtener un buen diluyente para asegurar la vitalidad de dichos
espermatozoides.

La sobrevivencia después de la crio conservación de muchos tipos de células, incluyendo los


espermatozoides, es fuertemente dependiente de la tasa de congelación y descongelación,
y especialmente de la temperatura a la cual las células son enfriadas antes de su
introducción en nitrógeno líquido.

Principios básicos para la crio conservación del semen bovino

Desde el descubrimiento del glicerol como agente crio protector efectivo y del
establecimiento de las técnicas básicas de crio preservación, el semen de una variedad de
especies se congela y utiliza con éxito en la inseminación artificial. Sin embargo, y con
excepción de los bóvidos, la utilización generalizada de semen congelado no se ha extendido
a las otras especies domésticas (HOLT, 2000).

El proceso de crio preservación incluye 5 etapas: Dilución, refrigeración, adición del crio
protector, congelación y descongelación. Mientras que algunas fases son relativamente
inocuas, otras son muy estresantes, como es el caso de la refrigeración y la congelación.

DILUYENTES

“Por diluyente entendemos la solución acuosa que permite aumentar el volumen del
eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias, preservar las características funcionales de
las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad adecuado”. (CARBALLO, 2009)17

“El diluyente que se añade para congelación generalmente es del tipo TRIS (buffer), El
diluyente debe contener sustancias iónicas o no iónicas que mantengan la osmolalidad del
medio (TRIS), una fuente de lipoproteína de alto peso molecular (yema de huevo, leche
descremada), una fuente de energía como fructosa o glucosa, y un crio protector”.
(ESCOBAR, 2011).

Características que deben tener los diluyentes


 Deben ser isotónicos al semen (tener la misma concentración de iones libres).
 Capacidad amortiguadora (evitar cambios de pH al neutralizar los ácidos producidos por
el metabolismo de los espermatozoides).
 Proteger a los espermatozoides de las lesiones producidas por el choque térmico.
 Proporcionar nutrientes para el metabolismo de los espermatozoides.
 Controlar contaminantes microbianos.
 Los espermatozoides deben de estar protegidos contra daño durante la congelación y
descongelación.
 Debe preservar la vida de los espermatozoides con un mínimo de efecto sobre la
fertilidad (CARBALLO, 2009).

Componentes de los diluyentes

 Azúcares: son componentes importantes en los diluyentes, ya que pueden actuar como
fuente de energía para los espermatozoides durante su almacenamiento, como es el
caso de la glucosa y de la fructuosa, o bien como críoprotector ya que también actúan
manteniendo o incrementando la presión osmótica de manera extracelular en el
espermatozoide, lo que permite mantener la integridad de la membrana espermática al
almacenamiento por un largo período.
 Sustancias buffer o amortiguadores: actúan dando estabilidad a la membrana, ya que
mantienen la tonicidad total del diluyente, lo cual es importante cuando el semen es
almacenado por largos periodos de tiempo. El Tris [Tris (Hidroxymethyl) aminomethane]
es usado como el principal componente en el diluyente para la congelación de semen
de toro, siendo predominante una buena capacidad buffer, diurética y actividad
osmótica; así como una baja toxicidad a una alta concentración.
 Sustancias orgánicas: son las que previenen el choque por enfriamiento, por ejemplo la
yema de huevo por medio de sus lipoproteínas, fosfolípidos y lecitinas. (FERNADEZ,
2013).

YEMA DE HUEVO

La yema de huevo es un ingrediente comúnmente utilizado para la congelación ya que preserva


la motilidad e integridad de las membranas del acrosoma y mitocondrias del espermatozoide,
además es un buffer osmótico. También se ha notado que la yema de huevo protege durante la
congelación; ya que se adhiere a la membrana y la recubre, esta facultad de protección se
adjudica a la gran densidad de la fracción de lipoproteínas.

Las propiedades protectoras de la yema de huevo sobre los espermatozoides durante la


congelación fueron descubiertas por primera vez por Philips en 1939. Posteriormente se
encontró que la yema de huevo tenía al menos dos factores activos, proteger contra el daño al
enfriamiento y ayuda manteniendo la viabilidad.
Las lipoproteínas de baja densidad (LDLs) contenidas en la yema de huevo fueron definidas como
ingredientes activos. La adición de LDLs de otras fuentes fracasó por no producir la misma
protección que la yema de huevo. Esto fue probablemente porque las LDLs de la yema de huevo
contienen componentes, proteínas particularmente que trabajan en conjunto para proporcionar
protección a los espermatozoides.

La adición de yema de huevo al dilutor tiene un efecto benéfico sobre el porcentaje de motilidad,
especialmente después de un rápido enfriamiento del semen a 10 y 5 ºC, ya que las lipoproteínas
de baja intensidad actúan como crioprotectores, contribuyendo a la protección contra el shock
de frío (factor de resistencia) y manteniendo la viabilidad del espermatozoide (factor de
conservación) (Fiser y Fairfull, 1986).

CRIOPROTECTORES

Los agentes criprotectores son los que tienen la finalidad de proteger a los espermatozoides
durante la fase de cristalización debido a las bajas temperaturas, el glicerol es la sustancia
más empleada debido a los resultados obtenidos. La eficiencia protectora del glicerol ha sido
atribuida a su capacidad de “atrapar” el agua y ayuda a que solo se lleguen a formar
pequeños cristales de hielo (FERNADEZ, 2013).

Cuadro N° 1. Crio protectores permeables de bajo peso molecular, crio protectores no


permeables de bajo peso molecular, crio protectores no permeables de alto peso molecular.

Los crio protectores incrementan la probabilidad de supervivencia celular, pero a


determinadas concentraciones resultan tóxicos para las células, por ello, debe establecerse
un equilibrio entre la mínima cantidad necesaria que provea protección celular durante el
proceso de congelación-descongelación, y la máxima cantidad que no presente efectos
tóxicos para las mismas.
Efectos dañinos de la crio conservación sobre el espermatozoide

La reducción de la capacidad fecundante está relacionada a dos razones puntuales, una baja
viabilidad post descongelamiento y un trastorno subletal en una proporción de espermatozoides
sobrevivientes. La baja viabilidad se debe a factores como: cambio de temperatura, estrés
osmótico, la formación de hielo intracelular y la toxicidad. El estrés osmótico y la formación de
hielo intracelular producen una disminución de la viabilidad espermática. Esto se ve reflejado
en la motilidad, capacitación espermática e integridad acrosomal. Una de las principales
características de los espermatozoides crio preservados es la disminución de la proporción de
células mótiles. La motilidad post descongelamiento se reduce a valores entre 40 a 50%.
(RAMONEZ, 2013).

PREPARACION DEL DILUTOR TRIS

Para la clase se solicitó la preparación de 50 cc de dilutor:

Para: 100 cc ---- 33.6 cc células madre

50 cc ----- X

X = 16.8cc Células Madre

Dilutor I Dilutor II
Soluc. Madre 16.8 16.8
Agua
3.2
bidestilada
Yema de huevo 5 5
Glicerina 3.2
25 25

Calculo del Nº de dosis a preparar y la cantidad de dilutor necesario para la congelación del
semen:

N° dosis = Volumen (cc) x % motilidad x % de vivos

N° espermatozides por dosis

N° dosis = 7.4 x 15 000 x 106 x 0.8 x 0.8 = 336.8 = 237 pajillas


30 x 106
¿Qué cantidad de semen se puede diluir en 50 cc de dilutor?
- Cada pajilla contiene 0.5cc de semen más dilutor (S+D)

Entonces: 236.8 x 0.5 = 118.4 (S+D)

118.4 – 7.4 cc = 111 cc Dilutor

Si 111 cc ---- 237 pajillas

50 cc ----- X

X = 106.75 pajillas

Ahora 106.75 x 0.5 = 53 cc (S+D)

 Por tanto se requiere 3 cc de semen.

BIBLIOGRAFÍA
Carpio Chuchuca, Samantha (2015). “Evaluación de dos diluyentes para la crio
conservación de semen bovino: yema de huevo vs leche descremada”. Trabajo de grado
previo a la obtención del Título de Médico Veterinario Zootecnista. Universidad
Politécnica Salesiana sede Cuenca.
Concentración Seminal (millones de espermatozoides /cc)
Volumen
cc 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500
Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor
2 26 11 30 13 34 15 38 17 43 19 47 21 51 24 55 26 60 28 64 30
2.5 32 14 37 16 43 19 48 22 53 24 59 27 64 30 69 32 75 35 80 38
3 38 16 45 19 51 23 58 26 64 29 70 32 77 35 83 39 90 42 96 45
3.5 45 19 52 23 60 26 67 30 75 34 82 38 90 41 97 45 105 49 112 53
4 51 22 60 26 68 30 77 34 85 39 94 43 102 47 111 51 119 56 128 60
4.5 58 24 67 29 77 34 86 39 96 44 106 48 115 53 125 58 134 63 144 68
5 64 27 75 32 85 38 96 43 107 48 117 54 128 59 139 64 149 70 160 75
5.5 70 30 82 36 94 41 106 47 117 53 129 59 141 65 153 71 164 77 176 83
6 77 32 90 39 102 45 115 52 128 58 141 64 154 71 166 77 179 84 192 90
6.5 83 35 97 42 111 49 125 56 139 63 153 70 166 77 180 84 194 91 208 98
7 90 38 105 45 119 53 134 60 149 68 164 75 179 83 194 90 209 98 224 105
7.5 96 41 112 49 128 57 144 65 160 73 176 81 192 89 208 97 224 105 240 113
8 102 43 119 52 137 60 154 69 171 77 188 86 205 94 222 103 239 111 256 120
8.5 109 46 127 55 145 64 163 73 181 82 199 91 218 100 236 109 254 118 272 128
9 115 49 134 58 154 68 173 77 192 87 211 97 230 106 250 116 269 125 288 135
9.5 122 51 142 61 162 72 182 82 203 92 223 102 243 112 263 122 284 132 304 143
10 128 54 149 65 171 75 192 86 213 97 235 107 256 118 277 129 299 139 320 150
10.5 134 57 157 68 179 79 202 90 224 102 246 113 269 124 291 135 314 146 336 158
11 141 59 164 71 188 83 211 95 235 106 258 118 282 130 305 142 329 153 352 165
11.5 147 62 172 74 196 87 221 99 245 111 270 123 294 136 319 148 343 160 368 173
12 154 65 179 78 205 90 230 103 256 116 282 129 307 142 333 154 358 167 384 180
12.5 160 68 187 81 213 94 240 108 267 121 293 134 320 148 347 161 373 174 400 188
13 166 70 194 84 222 98 250 112 277 126 305 140 333 153 361 167 388 181 416 195
Concentración Seminal (millones de espermatozoides /cc)
Volumen
cc 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor Dosis Dilutor
2 68 32 73 34 77 36 81 39 85 41 90 43 94 45 98 47 102 49 107 51
2.5 85 40 91 43 96 46 101 48 107 51 112 54 117 56 123 59 128 62 133 64
3 102 48 109 51 115 55 122 58 128 61 134 64 141 67 147 71 154 74 160 77
3.5 119 56 127 60 134 64 142 67 149 71 157 75 164 79 172 82 179 86 187 90
4 137 64 145 69 154 73 162 77 171 81 179 86 188 90 196 94 205 98 213 103
4.5 154 72 163 77 173 82 182 87 192 92 202 96 211 101 221 106 230 111 240 116
5 171 80 181 86 192 91 203 96 213 102 224 107 235 112 245 118 256 123 267 128
5.5 188 88 199 94 211 100 223 106 235 112 246 118 258 124 270 129 282 135 293 141
6 205 96 218 103 230 109 243 116 256 122 269 128 282 135 294 141 307 148 320 154
6.5 222 104 236 111 250 118 263 125 277 132 291 139 305 146 319 153 333 160 347 167
7 239 112 254 120 269 127 284 135 299 142 314 150 329 157 343 165 358 172 373 180
7.5 256 121 272 129 288 137 304 145 320 153 336 161 352 169 368 177 384 185 400 193
8 273 129 290 137 307 146 324 154 341 163 358 171 375 180 393 188 410 197 427 205
8.5 290 137 308 146 326 155 345 164 363 173 381 182 399 191 417 200 435 209 453 218
9 307 145 326 154 346 164 365 173 384 183 403 193 422 202 442 212 461 221 480 231
9.5 324 153 345 163 365 173 385 183 405 193 426 203 446 213 466 224 486 234 507 244
10 341 161 363 171 384 182 405 193 427 203 448 214 469 225 491 235 512 246 533 257
10.5 358 169 381 180 403 191 426 202 448 214 470 225 493 236 515 247 538 258 560 270
11 375 177 399 188 422 200 446 212 469 224 493 235 516 247 540 259 563 271 587 282
11.5 393 185 417 197 442 209 466 222 491 234 515 246 540 258 564 271 589 283 613 295
12 410 193 435 206 461 218 486 231 512 244 538 257 563 270 589 282 614 295 640 308
12.5 427 201 453 214 480 228 507 241 533 254 560 268 587 281 613 294 640 308 667 321
13 444 209 471 223 499 237 527 250 555 264 582 278 610 292 638 306 666 320 693 334
ANEXOS

glicerina
Mezcla de semen mas dilutor