You are on page 1of 11

BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J.

Chimoy Effio
Manual de Prácticas

I. DETERMINACION DEL pH, pK Y PREPARACION DE


BUFFERS.

I.1 OBJETIVOS (Dos sesiones, 8 H)


a. Los alumnos prepararán las siguientes soluciones: HCL 20, 200 mM;
NaOH 20, 200 mM.
b. El alumno aprenderá a estandarizar y usar correctamente un pH
metro.
c. Los alumnos prepararán los siguientes buffers: fosfato 0.2M pH 8.2,
acetato 200 mM pH 3.8 y Tris-Glicina 25 mM pH 8.3
d. Los alumnos dispondrán de tres indicadores en solución a fin de
determinar el pH de una solución.
e. El alumno determinará el pH de diferentes soluciones mediante el
uso del pH metro e indicadores, tiras o varillas.
f. El alumno podrá preparar con tres indicadores líquidos un solo
indicador para medir el pH en un rango de 1-10.
g. El alumno titulara los buffers acetato, fosfato y glicina a fin de evaluar
su capacidad de tamponamiento, así como determinar sus pK.

I.2 INTRODUCCIÒN
Dado que la gran mayoría de reacciones en el organismo dependen del
pH resulta importante medir este valor con gran exactitud.
El pH se define como –Log [H+] = Log 1/ [H+]
En los líquidos corporales el pH se mantiene normalmente dentro de límites
muy estrechos: en el líquido extracelular es aproximadamente de 7.4; y algo
menor en el intracelular.
Otro valor ligado al pH es el pKa cuyo valor se obtiene, en la ecuación
de Herderson – Hasselbach cuando la [Sal]=[Ácido]; la concentración de la
sal es igual a la del acido:
pH = pKa + Log {[Sal]/[ac.]}, l si [sal] = [ac.] entonces pH = pka
El pKa se puede obtener experimentalmente al plotear el valor de Log [sal]
/ [ac.] vs. pH correspondiendo el valor del intercepto al pKa
La medición del pH se realiza por indicadores líquidos coloreados /
incoloros, indicadores de papel y con el pH metro. Sin embargo la forma
estricta de medir el pH es con el pH metro (que es un potenciómetro).
Antes de entrar al detalle de cómo medir el pH, recordemos que en 1909
Sorensen definió que una solución es neutra si el pH es igual a 7. Una
solución es alcalina cuando el pH es mayor que 7 y una solución es ácida si
el pH es menor que 7.
Por otro lado , debemos considerar que un acido es toda sustancia que
dona protones (H+) mientras que una base aquella que acepta protones
(OH-). Las bases y los ácidos pueden ser fuertes (ej. HCl) o débiles (ej. Ac.
Acético). La acidez de una solución está dada por [H+]. La concentración de
[H+] se expresa como la molaridad (M) {(mol de H+/ lt). Ej. Un acido
monoprotónico con 10 -6 M {mol. H+/ lt} tendrá un pH de – Log 10-6 = 6.
El método potenciométrico comprende dos tipos de análisis: a) la
medición directa de un potencial de electrodo y b) los cambios en la fuerza
electromotriz que produce la adición de un titulante.
Los eléctrodos más empleados en los pH metros son: electrodos de vidrio,
electrodos de estados sólidos y precipitados, electrodos de enzimas y

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 1


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

sensores de gases. El desarrollo de nuevos tipos de electrodos con


selectividad iónica están pasando a ocupar su lugar junto con el electrodo
de vidrio. Todos ellos involucran un proceso de intercambio iónico en el
mecanismo de determinación del potencial; se producen potenciales que
pueden describirse adecuadamente por la ley de Nersnst; en todos los
casos se miden las cavidades de los iones, es decir la concentración iónica
libre termodicamente efectiva, mas no concentraciones.
Bates y Guggehein establecen que:
pH = pHs - {(E - Es)/2.3 RT}xF, donde:
pH =pH a determinarse
pHs=pH del Standard
T=Temperatura en grados kelvin (0K)
F= Constante de Faraday
R= constante de los gases
E= Fuerza electromotriz (fem) de la sustancia por determinante el pH
Es= fem. del standard.
El pH metro mide el voltaje de una solución a través del electrodo de
vidrio, el cual es permeable a H + pero no a otros cationes o aniones ;la
magnitud de este potencial viene dado por la ecuación :

E= (2.303 RTxLog {[H+]i/[H+]e}/F, donde:


[H+] i =concentración de H+ en el interior
[H+] e=concentración de H+ en el exterior
Si la [H+] se fija en uno de ellos, el potencial será determinado por el pH de
la otra solución.

V= E fijo - 2.302 RTxLog{ [H+]i/H+]e}/F (1)

Conociendo que [H+] i = HCL 0.1N, luego

V= E fijo + 2.302 RT – 2.302 RTxpH (2)


F F
V= constante – 2.302 RTxpH
F
Donde el voltaje generado esta directamente relacionado con el pH. La Fig. 1
muestra un esquema general de un pH metro con electrodo de vidrio y
uno de referencia (calomel).

Una estrategia de medir el pH es mediante soluciones o tiras indicadores, estos


por lo general son ácidos o bases débiles cuyos iones tienen distinto color
que las moléculas no disociadas. La disociación depende de pH en que se
encuentre la solución. El cambio de color se debe a la disociación del
indicador , pues sus formas acido/base conjugada representa colores
diferentes (una de ellas es incolora , la otra coloreada).
Los indicadores líquidos (ej. Fenolftaleina, Rojo de metilo) son utilizados en
los análisis volumétricos para reconocer el punto final de una titulación.

La ecuación del estado de disociación del indicador es:

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 2


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

[Hind] [H+] + [Ind-]


ac. débil base conjugada
(Color a) (Color b)

Fig.I.1 Esquema General de un pH metro


(Adaptado de D. Freifelder. 1979)

Si consideramos que Hind es la concentración y estado del indicador no


-
disociado; luego el estado disociado es: [H +] y [Ind ]; luego su constante de
disociación está dada por la ecuación :

K= [H+] [Ind-], despejando [H+] = [Hind] x k, calculando Log:


[Hind] [Ind- ]

- log [H+] = pK + Log {[Hind]/[Ind-]}


La relación [Hind] / [Ind-] es la que determina el color y guarda una
relación directa con el pH. Cada indicador tiene una “zona de viraje”
característica del indicador ; así por ejemplo el azul del bromofenol a pH 3
es amarillo mientras que a pH azul violáceo (ver tabla I.1).
Las tiras de indicadores de pH son tiras de papel impregnadas con un
indicador o una mezcla de indicadores. Las tiras indicadoras permiten saber
el pH de una solución con una aproximación de 0.2 unidades.
Obviamente, la desventaja de los indicadores (aún de las tiras) es que no se
pueden aplicar a soluciones coloreadas. Su utilidad, sin embargo debe
estimarse como preliminar o aproximado.

Los amortiguadores de pH (buffers, tampones, reguladores) son sistemas que


garantizan que el pH de una solución varié muy poco después de agregar

TABLA I.1 INDICADORES DE USO COMUN: pK Y COLOR

INDICADOR pK RANGO DE pH Y VARIACION DE COLOR

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 3


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

Azul de bromofenol 3.86 3.0– 4.6 AMARILLO ANARANJADO

Azul de bromotimol 7.10 6.0 - 7.6 AMARILLO – AZUL

Azul de timol 8.90 8.0 – 9.6 AMARILLO – AZUL

Fenolftaleina 9.40 8.2 – 9.8 INCOLORO - GROSOSELLA

Naranja de metilo 3.40 3.1 – 4.4 ROJO ANARANJADO

Púrpura de bromocresol 6.30 5.2 – 6.8 AMARILLO- PURPURA

Púrpura de cresol (ácido) 1.15 1.2 – 2.8 ROJO - AMARILLO

Púrpura de cresol (básico) 8.32 7.4 – 9.0 AMARILLO – PURPURA

Rojo de clorofenol 5.98 5.0 – 7.0 AMARILLO ROJO

Rojo de cresol 8.20 7.0 – 8.8 AMARILLO PURPURA

Rojo de metilo 4.95 4.4 – 6.2 GROCELLA ANARANJADO

Timolftaleina 7.76 7.0 - 8.2 INCOLORO –AZUL

Verde de bromocresol 4.68 3.8 – 5.4 AMARILLO AZUL

Amarillo de alizarina 11.20 10 – 12.1 AMARILLO – ROJO NARANJA

un ácido o una base. Los buffers generalmente están compuestos de un


ácido débil y su sal conjugada.
En los organismos vivos, sobre todo a los valores de pH en que se
realizan la mayor parte de sus funciones, los sistemas amortiguadores
presentes en la célula y algunos líquidos extracelulares garantizan la
constancia de esta característica.
Los sistemas amortiguadores de pH, conocidos como buffers que tienen
incidencia en los organismos son:
(a) fosfato acido / fosfato básico
(b) ac. carbónico / carbonato
(c) Proteína acida / proteína Básica

Analicemos el buffer acetato:

(99%) (1%)
-
[CH3COOH] [CH3COO ] + [H+]
(1%) (99%)

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 4


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

-
[CH3COONa] [CH3COO ] + [Na+]

Ahora si se añade un ácido o una base:

[CH3COOH] + [CH3COO- ] + [Na+] + [H+]  sube [CH3 COOH]

-
[CH3COOH] + [CH3COO- ] + [Na+] + [OH-] sube [ CH3 COOH ]
El pH de un buffer esta dado por la ecuación de Henderson – hasselbach:

pH = pK+ log[sal]
[ac.]

La relación [sal]/[ac.] da la concentración del buffer ejemplo 100mL de una


solución 0.2 M fosfato monobásico de sodio se mezcla con 100 mL de una
solución 0.2 M de fosfato bibásico de potasio; luego el pH de la solución
-
resultante será: (pKa del H2PO4 =6.86)
pH =6.86 + log 0.2 = 6.86
0.2
A continuación se muestra la Tabla I.2 con los pKs de los sistemas mas
usados en bioquímica.

Tabla I.2 pKas de algunos ácidos importantes (250C)

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 5


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

pKas DE ALGUNOS ACIDOS IMPORTANTES (250C)


SUSTANCIA pK1 pk2 pk3 pk4
Ac. Acetico 4.76
Ac. Ascorbico 4.30 11.82
Ac. Carbónico 4.68 10.25
Ac. Citrico 3.13 4.76 6.40
EDTA 2.00 2.67 6.27 10.95
Ac. Fomico 3.15
Ac. Ortofosforico 2.15 6.86 12.36
Ac. Parafosforico 1.58 2.36 6.60 9.25
Ac.-2-(N morfolino) 6.15
etano sulfonico
Ac. N-2-hidroxietilpipe-
razina-N’2-etanosulfóni- 7.55
co
AC. oxálico 1.27 4.27
AC. Succínico 4.21 5.64
+
Glicina [H ] 2.35 9.78
Tris –(hidroximetil)
Glicina TRS [H+] 8.08
veronal 7.43
Es importante señalar que para calibrar un potenciómetro son necesarios
buffers standares proporcionados generalmente por el fabricante.

Tabla I.3 Buffers Estándares


pH
25ºC 37ºC

1. Fosfato mono básico-K 50 mM


4.01 4.02

2. Fosfato mono básico-K 25 mM +


Fosfato dibásico-Na 25 mM 6.86 6.84

3. Tetraborato sódico 10 mM 9.18 9.06

Los rangos de tamponamiento de los buffers mas usados son:


Rango pH
Buffer acetato 3 --- 6
Buffer fosfato 6 --- 9
Buffer Amonio / Borato 8 --- 11

Finalmente consideramos las curvas de titulación, obtenidas al graficar, en


las ordenadas, los valores de pH de una solución y en el eje de las abcisas

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 6


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

los meq (volumen x normalidad) del titulante. Las graficas son diferentes,
considerando corresponda a un acido o a una base (fuerte o débil).

I.3 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS


Material de vidrio: Fiolas de 100 ml, Beackers de 50/100 ml, Pipetas de
1/5/10 ml
Reactivos: HCl 38%, NaOH, Azul de Bromotimol 0.1%, Verde de
bromocresol 0.04%, Rojo de fenol 0.1%. Ac. Acético glacial, Acetato de
sodio. Fosfato dibasico de sodio, Fosfato monobásico de potasio. Trizma
base, Glicina. (Merck o SIGMA)
Solución RKS, indicador universal de pH rango 1-10
Soluciones standares de pH 4.01/6.86/9.18
Equipos: pH Metro / cocina eléctrica
Otros: Tiras Indicadores de pH SIGMA (0-14), Varillas de pH (0-14). Placas
de porcelana con pozos.

PROCEDIMIENTOS
A. Preparación de soluciones: (En todos los casos usar fiolas¡¡¡)
HCl 200 mM
0.73g* de ac. Clorhídrico fumante 38% ( =1.19)
Agua destilada cantidad suficiente para (csp) 100 ml
* Gramos de HCl/mL= (% del ácido)(densidad del ácido)= 0.38x1.19= 0.4522.
1 mL de ácido acético 38% contiene 0.4522 g y 1.614 mL, 0.73g.
HCL 20 mM
Tomar 10ml de HCL 200 mM y agregar agua destilada csp 100ml.
NaOH 200 mM
0.8 g de hidróxido de sólido (pesar rápidamente porque esta sustancia es
higroscópica) y añadir agua destilada csp 100 ml
NaOH 20 mM
Tomar exactamente 10ml de Na0H 200 mM y agregar agua destilada csp 100
ml

B. DETERMINACIÓN DEL pH
B.1 Método potenciométrico
Primero hay que standarizar al equipo: (ver Fig.I.2). El conmutador de
función debe estar en posición (). Colocar las pilas (parte posterior).
Verificar la caída de potencial, haciendo que el conmutador de función (B)
esté en la posición . Luego observar que la aguja se ubique en la
zona negra. Si no ocurre esto cambiar de pilas.
En un beacker de 50 ml, colocar 25 ml de una solución estándar pH
6.86; introducir cuidadosamente el electrodo de vidrio (ES UNA MEMBRANA
MUY DELICADA) y asegúrese que:
El potenciómetro de sensibilidad (A) esté en posición 60 mV/ pH y el rango
del conmutador (C) en 0-14.
Ahora cambie el conmutador de función a posición (I). Con el
potenciómetro de punto cero (D) ajuste el valor de pH a 6.86. Retorne a
la posición ().
Lave el electrodo, séquelo y cambie de solución estándar pH
9.08; si la aguja no marca 9.08 ajustar con A. EL pH METRO YA ESTÁ LISTO
PARA MEDIR pH de cualquier solución.

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 7


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

Cuando termine de medir el pH lave bien los electrodos y deje el


aparato en la posición ().

B.2 Método de los indicadores líquidos:


Sobre una placa de porcelana con pozos, poner una gota pequeñísima del
indicador mixto (Merck 5). Luego una gota de los standares para el pH:

4.01 6.36 9.18

Electrodo

A B C D
Fig.I.2 pH metro

Indique que pH corresponde al patrón de colores del indicador. Asimismo


discuta su sensibilidad y exactitud.

B.3 Método de las tiras de papel de papel o varillas indicadoras de pH


Considerar las mismas soluciones standares de pH 4.01 6.86 9.18, tomar un
centímetro de papel indicador de pH o una varilla, de rango 0-14;
humedecerlas con cada una de las soluciones por separado, es decir use
un centímetro de papel o una varilla por muestra. Analizar el viraje del color
con el patrón de colores que viene en la caja de la tira.

B.4 Medir el pH de soluciones diluidas de HCl e NaOH: el alumno preparará


una solución de HCl 1N e NaOH 1N. Luego con cada una de ellas preparará
soluciones diluidas seriadas de HCl e NaOH 10 -1.10-2,10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 8


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

de la siguiente manera: de una solución 1N tomará 1 mL y en una fiola


completará a 10 mL con agua destilada para obtener la dilución 10 -1, de esta
dilución tomamos 1 mL y completamos a 10 mL con agua destilada para
obtener la dilución 10-2. De manera similar se obtendrán las siguientes
diluciones. Medir con el pH metro, tiras de pH y solución universal el pH del
agua destilada y de todas las soluciones.

C. Preparación de Buffers
Buffer acetato 1M pH 3.8
Pesar 6.88 g de ac. Acético glacial ( =1.42) y agregar agua destilada 80 ml,
ajustar, con el pH metro, a pH 4.00 con acetato de sodio (sólido). Finalmente
agregar agua destilada csp 100 ml

Buffer acetato 100 mM pH 3.8


Tomar 10 mL de buffer acetato pH 3.8 1M y diluir con agua destilada csp 100
mL.
Buffer fosfato 1M pH 8.2
Pesar 14.2g de fosfato dibasico de sodio y agregar 80 ml de agua destilada,
luego ajustar a pH 8.2 con fosfato monobásico de potasio (sólido) hasta
obtener pH 8.2. Finalmente completar con agua destilada csp 100 ml
Buffer Tris-glicina 25 mM pH 8.3
En una fiola de un litro, colocar 3g de Trizma base y 14.4g de glicina agregar
agua csp 1L. Verificar el pH con el pH metro.
En general para preparar un buffer se tiene en cuenta la ecuación de
Henderson-Hasselbach y de ésta extrapolar la concentración del ácido y de la
sal:

pH = pK + Log {[sal]/[ácido]}

Ej. El pK del Ac. Acético es 4.76. Para preparar 100 mL de un buffer acetato
100 mM pH 4.00, preparamos 100 de una solución de Ac. Acético 100 mM y
una solución de Acetato-Na 100 mM. En la ecuación de Henderson-Hasselbach
remplazamos valores pH= 4.00 y pK= 4.76  4 – 4.76= log [Sal/Acido]= - 0.76
 antilog (-0.76)= Sal/Acido  0.17= Sal/Acido  0.17 (Acido)= Sal. Por lo
tanto debemos mezclar 50 mL de Acido Acético + 8.5 mL de Acetato-Na.
Verificar el pH con el pH metro. Si el pH es mayor ajustar con gotas (25 µL) de
HCl 5M y si es menor con NaOH 5M, luego completar a 100 mL con agua
destilada. En la siguiente tabla damos los volúmenes de sal y ácido para
obtener los buffers acetato 100 mM pH 4,50, 5.00 y 5.50.

mL, Acético 100 mM mL, Acetato-Na 100 mM pH


50 8.5 4.00
50 38.5 4.50
30 52.2 5.00
15 82.5 5.50

D. Producción de un indicador liquido. El alumno dispondrá de 3


indicadores líquidos: azul de bromotimol + rojo fenol + verde de
bromocresol, preparará las mezclas a)1:1:1 b)1:2:1 y c)1:1:2. En un beacker

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 9


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

con 25 mL de HCl 0.1 M adicionará 2 gotas de la mezcla –a- y medirá el pH con


el pH metro registrando el color correspondiente. Luego adicionará, de 100 en
100 L, NaOH 50 mM anotando los colores correspondientes a los pHs 1,
2,3…10. Repetirá este procedimiento para las mezclas –b, c-. Después de
confrontar los colores obtenidos con las tres mezclas el alumno deberá indicar
cual es la mezcla ideal que permita determinar el pH para cada color.

E .Capacidad Tamponante y Determinante de pKa


E.1 Del buffer fosfato pH 6.86: en un beacker de 50 mL colocar 25 mL de una
solución buffer fosfato pH 6.86 100 mM medir el pH inicial con un pH metro.
Titular, de 100 en 100 µL, con HCL 500 mM. Registrar el pH después de añadir
cada 100 µL. Añadir HCl hasta pH aprox. 5. Realizar lo mismo con otros 25 ml
de buffer pero titulando con NaOH 500 mM hasta aprox. pH 9.
E.2 Del buffer acetato pH 4.76: preparar 100 mL de un buffer acetato-Na pH
4.76 100 mM. Titular como para el buffer fosfato (E.1) con HCl 500 mM e NaOH
500 mM hasta aprox. pH 3 y 7 respectivamente. Registrar el pH después de
añadir cada100 µL.
E.3 De glicina: preparar 100 mL de una solución 100 mM del aminoácido
glicina (0.75g de glicina y agua csp 100 mL) titular con HCl e NaOH, como se
ha procedido con los buffers acetato y fosfato. Titular en los rangos de pH 1-4 y
8-11.
E.4 Determinación del pKa: con los valores obtenidos y registrados en E.1
y E.2 se puede obtener directamente los puntos de inflexión correspondiente
al pK. Graficando ∆pH /∆ volumen vs. meq. de acido o base añadidos. El pK
corresponde al pH donde se produce un máximo.

I.4 RESULTADOS

I.5 DISCUSION Y CONCLUCIONES

I.6 CUESTIONARIO
1. ¿Que otros procedimientos conoce para determinar el pK a de una
solución? Explique.
2. ¿Qué complicaciones ocurren para medir pH con el electrodo de vidrio?
3. ¿Cuál es el pH del ac. Acético 100 mM y del fosfato mono básico-K 250
mM?
4. ¿Explique como se preparan las varillas para medir pH (Merck o SIGMA?
5. ¿Que otros procedimientos sugiere usted para realizar esta practica?

I.7 REFERENCIAS

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 10


BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J. Chimoy Effio
Manual de Prácticas

Chimoy E,PJ., López L, C., Monteghirfo G, M.1989. Manual de Prácticas


de Bioquímica y Biología Molecular. CONCYTEC. Fac. Cs. Biológicas.
UNPRG. Lambayeque.
NELSON, D.L. & M.M. COX. 2000. Principles of Biochemistry. Worths
Publishers
D. Freifelder.1979, Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Ed.
Reverte. Cáp. 4
FIELD K & W REAN. (1999). Molecular Biology Techniques: An intensive
laboratory course. Acad Press
Manual del manejo del pH meter TM-5 Forschungsins Titutd Meinsberg.
Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada Ed. Internacional.
México Cáp.1
Tablas de Merck. Tablas auxiliares para el Laboratorio Químico.
Walton HF & Reyes J. 1978. Análisis químico e instrumental Moderno. Ed
Reverte. España.españa.Cap .1

Determinación del pH, pK y Preparación de Buffers. 11

You might also like