Curso teórico-práctico de Citogenética Humana 2016

Facultad de Bioanálisis, Veracruz, U.V.

Curso Teórico-práctico Citogenética humana

Procedimiento para Obtención de cromosomas

Lunes 29 de febrero 2016.

1.- Toma de muestra de sangre periférica

Material
1 jeringa de 3 ml con aguja hipodérmica
2 torundas de algodón con alcohol
1 ligadura

Reactivos
200µl heparina sódica

Descripción
En condiciones de esterilidad, Se hepariniza la jeringa con 200 µl de
heparina sódica.
Se coloca la ligadura en el brazo del paciente, se ubica la vena y se limpia
el área con una torunda, se realiza la punción. Se extraen 3 ml de sangre y
se mezcla suavemente.
La jeringa debe ser rotulada con el nombre del alumno.

IMPORTANTE.- Para cultivo celular las muestras biológicas no se

refrigeran ni congelan.

1. 2.- Cultivo de linfocitos de sangre periférica

Procedimiento para obtención de cromosomas, mediante un cultivo de sangre

periférica y con la estimulación de linfocitos T para su proliferación con el uso
de la fitohemaglutinina. Las células que se encuentran en mitosis se detienen
en la metafase (fase del ciclo celular en donde existe un mayor nivel de
compactación de los cromosomas). El ciclo celular de las células se detiene
con la colchicina.

Material y Equipo Reactivos

Incubadora Medio RPMI 1640® (Gibco # 22400089)

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Campana de flujo laminar Fitohemaglutinina PHA® (Gibco Cat 10576015)

Micropipeta de 200 µl
Puntas estériles Hipoclorito al 5%
2 tubos cónicos de 15 ml Alcohol 70%
Gradilla para tubos cónicos
gasas
torundas
Guantes estériles
Marcador
1 pipeta de 10ml estéril

Procedimiento:

Limpieza de la cámpana de flujo laminar:

Con una gasa e hipoclorito al 5% se limpia la superficie de la campana y se
desecha la gasa. Se realiza una nueva limpieza ahora con una gasa y alcohol
al 70%. Se enciende el flujo de la campana y la luz UV durante 5 minutos. Se
introduce todo el material y los reactivos.

Siembra:
1.- En la gradilla se colocan dos tubos falcon de 15ml, se rotulan. A cada tubo,
se agregan 5 ml de medio RPMI 1640 con una pipeta estéril.
2.- Con la micropipeta se agregan 150 l de fitohemaglutinina a cada tubo.
3.- Por inversión, se mezcla la jeringa con la muestra de sangre periférica
obtenida con heparina como anticoagulante, se desecha la primera gota sobre
una torunda y se agregan 15 gotas de muestra a cada tubo falcon, se tapan los
tubos.
4.- Se colocan dentro de la incubadora en posicion inclinada (aproximadamente
30°) durante 72 hrs a 37°C.
7.- Se retira el material de la campana y se limpia nuevamente la superficie con
una gasa y alcohol, permitiendo correr el flujo durante 5 minutos.

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Jueves 03 de marzo de 2016.
3.- Cosecha

Material y Equipo Reactivos

Incubadora
Baño maria Colchicina
Gradilla para tubos falcon de 15 ml Solucion hipotonica KCl 0.075M
Micropipeta de 200 l Fijador 3:1
Puntas estériles
2 probetas de 50 ml
4 gasas
Guantes esteriles

Procedimiento

2. Pasadas las 72hrs, se agregan 40 l de colchicina y se coloca en la

incubadora durante 2 horas a 37°C.
3. Centrifugar a 2500 rpm x 10 minutos.
4. Se retira el sobrenadante y se resuspende el botón celular.
5. Se agregan 10ml de solucion hipotónica precalentada a 37°C y se
mezcla suavemente con la pipeta de tranferencia.
6. Se incuban a 37°C durante 20 minutos en baño maria.
7. Agregar a cada tubo 1ml de fijador frío, mezclar con la pipeta de
transferencia y centrifugar a 2500 rpm x 10 minutos.
8. Retirar el sobrenadante y resuspender el botón.
9. Se toma el botón celular con la pipeta y se agregan a cada tubo 10 ml
de fijador frío. Rápidamente se resuspende el boton en el fijador frío.
10. Centrifugar a 2500 rpm x 10 minutos.
11. Retirar el sobrenadante y resuspender la pastilla.
12. Se agregan 7 ml de fijador frío y se mezcla.
13. Centrifugar a 2500 rpm x 10 minutos
14. Se repiten los pasos 10, 11 y 12 una vez más o hasta que se obtenga
un sobrenadante claro y un botón limpio.
15. Se diluye el botón final en 1 ml de fijador frío.
16. Se gotea una laminilla de cada tubo y se revisa en contraste de fases.
Se evalúa el indice mitótico, la calidad de las metafases obtenidas y se
ajusta la altura del goteo. Se gotean un total de 4 laminillas por caso.
17. Las preparaciones se maduran en la estufa a 37°C durante 2 a 5 días
para que se realice las bandas GTG.

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NOTAS:

Debe cuidarse la esterilidad de todos los reactivos y material utilizado en este

proceso.
El medio de cultivo y la fitohemaglutinina deben estar a temperatura ambiente
en el momento de la siembra.
Despues de ser usados, la fitohemoaglutinina se debe guardar a -20 °C y el
medio de cultivo RPMI 1640 a 4°C.
Evitar el contacto directo con pipetas y puntas, en caso de contacto, cambiar
inmediatamente.
Antes y después de usar todos los reactivos deber ser esterilizados con una
torunda. Al terminar sellar con parafilm la boca de los frascos.
Para evitar posibles confusiones, cuando se trabajen varias muestras solo se
DEBE INTRODUCIR EN LA CAMPANA UNA MUESTRA A LA VEZ, ANTES DE
SER SEMBRADA, LOS TUBOS FALCON SE DEBEN ROTULAR CON LOS
DATOS CORRESPONDIENTES.
Los portaobjetos, antes de ser utilizados deben lavarse con jabon neutro, y
almacenarse en un vaso de precipitado con alcohol al 50%, en refrigeracion
(4°C).

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Viernes 04 de marzo del 2016.
4.- Bandas GTG

Material y equipo. Soluciones y reactivos.

5 vasos coplin. 225 ml de buffer sörensen.
2 vasos de precipitado. 1ml de alcohol
2 hojas de papel filtro 0.01gr de tripsina.
1 Balanza analítica. 0.01gr de EDTA.
1 pipeta serologica de 5ml. 25 ml de Colorante wright.
1 probeta de 50ml. 5 ml de Colorante giemsa.
Microscopio 300 ml de agua potable
Aceite de inmersion

Procedimiento

1. Pesar 0.01 gr de tripsina y 0.01 gr de EDTA, posteriormente se disuelven

en 50 ml de buffer Sörensen y se depositan en un vaso coplin.
2. En otro vaso coplin se depositan 50 ml de buffer sörensen.
3. Se repite el procedimiento 2 en un nuevo vaso.
4. Siguiente coplin, depositar 25 ml de colorante wright y diluir en 25 ml de
buffer sörensen.
5. Depositar 5 ml de colorante giemsa y diluir con 45 ml de buffer sörensen.
6. Sumergir las laminillas maduradas en el vaso coplin que se describio en
el paso 1, por X número de segundos.
7. Enjuagar en el 2do. Vaso coplin.
8. Sumergir las laminillas en el vaso descrito en el paso 3 por X número de
segundos.
9. Introducir las laminillas por 1 minuto al colorante wright diluido.
10. Introducir las laminillas por 1 minuto al colorante giemsa.
11. Enjuagar en agua con alcohol y posteriormente en agua potable.
12. Valorar al microscopio.
13. El análisis de las metafases se hace seleccionando las mejores
metafases considerando el tamaño y dispersión adecuada de los
cromosomas.

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Preparación de reactivos

Solucion hipotonica (KCl 0.075 M) :

Cloruro de Potasio 0.56 grs

Agua destilada, aforar a 100 ml

Almacenar a temperatura ambiente.

Fijador (3:1)

Metanol absoluto (tres partes) 75 ml

Acido acetico glacial (una parte) 25 ml
Preparar antes de usar y mantener en congelador durante la cosecha, no
almacenar.

Buffer Sörensen

Fosfato de potasio monobasico 6.63 gr

Fosfato de sodio dibasico 2.56 gr

Aforar con agua destilada 1(L) y almacenar a temperatura ambiente.

Colorante Giemsa.
Glicerol 66 ml.
Hemocolorante giemsa en polvo 1 grm.
Methanol 66 ml.

Calentar 50ml de glicerol a 55°C y mantener a esa temperatura, durante este

tiempo se pulveriza finamente el colorante en un mortero, se agrega al glicerol
caliente y lavar los restos de colorante contenidos en el mortero con los 15 ml
restantes de glicerol y agregarlos a la mezcla. Mantener en agitacion la mezcla
durante 2 hrs y agregar los 66ml de metanol.