UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS DINÁMICAS

PRÁCTICA N° 8

“DETERMINACIÓN DE COLESTEROL TOTAL, HDL, LDL Y TAG EN SUERO”

COMPETENCIAS PROCEDIMENTALES

Al finalizar esta práctica, el alumno:

1. Determina la concentración de triacilglicéridos empleando el método enzimático.

2. Cuantifica colesterol total, HDL, LDL y VLDL en suero.

INTRODUCCION

El colesterol es un lípido anfipático que se encuentra en los tejidos, membranas celulares

y en las lipoproteínas plasmáticas como colesterol libre o éster de colesterilo. Es
sintetizado en numerosos tejidos a partir de Acetil–CoA y finalmente eliminado del
organismo en la bilis, ya sea como colesterol o como sales biliares.

Los niveles de colesterol total en sangre varían desde 100 mg/dL (o menos) en jóvenes
a 200 mg/dL en adultos y adulto mayor, sin embargo existe bibliografía que indica el
límite para los adultos mayores de 240 mg/dL. Se sabe que el riesgo de enfermedad
cardiaca coronaria es tres veces mayor en varones adultos cuando los niveles son
mayores de 230 mg/dL y aumenta a 6 veces en individuos con más de 260 mg/dL de
colesterol sérico; de aquí la importancia del control de los niveles de colesterol
sanguíneo.

El colesterol es transportado en la sangre por tres lipoproteínas la HDL, LDL y VLDL. Se

sabe que existe relación a enfermedades cardiovasculares y afecciones coronarias con
la elevación de la concentración de LDL y disminución de las HDL y conjuntamente la
determinación de la concentración de los triglicéridos, proveen una valiosa información
para el diagnóstico de dislipidemias y de la predicción de enfermedad coronaria. Los
valores de HDL deben ser mayores a 35 mg/dL como mínimo, óptimo mayor a 45 mg/dL

Los triglicéridos, triacilglicéridos o triacilgliceroles son acilgliceroles, un tipo de lípidos,

formados por una molécula de glicerol, que tiene esterificados sus tres grupos hidroxilo
por tres ácidos grasos, saturados o insaturados. Los ácidos grasos están unidos al
glicerol por el enlace éster. Son transportados en la sangre por las lipoproteínas en
diferente proporción y concentración. Los valores normales varían ampliamente con la
edad desde 20 mg/dL pero es deseable que su concentración sea menor a 150 mg/dL.

FUNDAMENTOS
Determinación de colesterol total
En la práctica el colesterol total se determinará empleando un método enzimático
colorimétrico tipo Trinder a punto final. Inicialmente los esteres de colesterol son
hidrolizados por la colesterol éster hidrolasa en colesterol libre y ácidos grasos. El
colesterol libre es oxidado por el colesterol oxidasa generando en el medio de reacción
colest-4-en-3-ona y peróxido de hidrógeno; este último por medio de la peroxidasa y en
presencia de 4-amino antipirina y Fenol forma un complejo coloreado el Quinoneimino,
que es de color rosado rojiso, directamente proporcional a la concentración de
colesterol, se mide a una longitud onda de 500 nm. El sistema se desarrolla en buffer
fosfato 50 mmol/L a pH 6,7.

CHE
Esteres de colesterol + H2O ----------------Colesterol + Ácidos grasos
CHO
Colesterol + O2 --------------- Colest-4-en-3-ona + H2O2
POD
H2O2 + 4-aminofenazona + fenol ----------- Quinoneimino(rojo)

Determinación de colesterol-HDL
El colesterol ligado a las lipoproteínas de alta densidad se determina en el sobrenadante
obtenido por centrifugación, después de la precipitación de las fracciones LDL y VLDL.
La precipitación de las lipoproteínas LDL y VLDL se realiza adicionando al suero una
solución de ácido fosfotungstico 1,4 mmol/L en cloruro de Mg 8,6 mmol/L
En el sobrenadante se determina el colesterol de la fracción HDL con el sistema
colorimétrico de colesterol total y se lee a 500 nm.

Determinación de triglicéridos.
Los triglicéridos presentes en el suero, son hidrolizados por la lipasa específica,
liberando ácidos grasos y glicerol. El glicerol es fosforilado por la enzima glicerocinasa y
posteriormente, el glicerol- 3P es oxidado a dihidroxiacetona fosfato por la enzima
glicerol-fosfato-oxidasa, generándose peróxido de hidrógeno. Posteriormente en una
reacción tipo trinder el peróxido por medio de la peroxidasa reacciona con la 4 amino
antipirina y el 4-cloro fenol para producir el compuesto coloreado Quinoneimino,
proporcional a la concentración de triglicéridos en l muestra, a una longitud de onda
máximo de 500 nm. Todo el sistema está en buffer fosfato pH 7,2.

MATERIALES Y EQUIPOS.
Tubos de ensayo. Pipetas, Gradilla.
Tubos al vacío para extracción venosa. Ligadura, alcohol, algodón, guantes.
Rtvo. Colesterol (reactivo enzimático para la determinación de colesterol)
Rtvo. TAG (reactivo enzimático para la determinación de triglicéridos)
Baño maría, Espectrofotómetro.
Estándar: Colesterol 200 mg/L y TAG 200 mg/L.

PROCEDIMIENTO
Paciente en ayuno. Realizar la extracción de sangre sanguínea en un tubo sin
anticoagulante para un volumen de aproximadamente 5 mL, dejar coagular en
temperatura de 37°C por espacio de 15 minutos, luego centrifugar y obtener el suero
libre de hemólisis.

MUESTRA DE SUERO SIN DILUIR: para la Determinación de Colesterol Total y TAG.

DETERMINACION DE HDL:
Se requiere de reactivo precipitante. Hacer la precipitación colocando en un tubo cónico
ependorff 0,5 mL de suero puro y 200 uL de reactivo precipitante (Ac.fosfotungstico -
Mg) mezclar suave y constantemente durante 20 segundos, dejar reposar el tubo por 20
minutos y posteriormente centrifugar a 15 minutos a 3000 rpm.
Retirar el ependorff de la centrífuga y trasvasar el sobrenadante a otro tubo pequeño
para poder pipetear y realizar el protocolo.
PROTOCOLO PARA COLESTEROL TOTAL (CT) Y HDL:

Rotular y Colocar en tubo de ensayo 13 x 100

B St C CT HDL

uL. St Colesterol 200 mg % -- 10 -- --

uL. Suero -- -- 10 --
uL. Sobrenadante HDL -- -- -- 10
uL. Agua destilada 10 -- -- --
mL. Rvo Enzimático 1 1 1 1
Mezclar, Incubar a 37 °C x 10’

Leer las absorbancias a 500 nm, dentro los 60 min.

PROTOCOLO PARA TAG

B St MP
uL. St TAG. 200 mg % -- 10 --
uL. Suero -- -- 10
uL. Agua 10 -- --
mL. Rvo Enzimático TAG 1 1 1
Leer las absorbancias a 500 nm, dentro los 60 min.
Corregir las lecturas.

CÁLCULOS

[𝑺𝒕]
Sí 𝑉𝑆𝑡 = 𝑉𝑀𝑃  [𝐌𝐏] = 𝒙𝑨𝒃𝒔 𝒎𝒑𝒙𝑭𝒅
𝑨𝒃𝒔𝒕

𝒈 𝑺𝒕 𝑽𝒇𝑴𝒑 𝟏𝟎𝟎
Sí St 𝑉𝑆𝑡 ≠ 𝑉𝑀𝑃  [𝐌𝐏] = × 𝑨𝒃𝒔𝑴𝒑 × ×
𝑨𝒃𝒔 𝑽𝒇𝑺𝒕 𝑽𝑹

VALORES DE REFERENCIA

1. COLESTEROL TOTAL
Deseable: < 200 mg %;
Límite de alto Riesgo: 200 – 240 mg % Alto Riesgo: > 240 mg.

2. HDL
Varones: > 35 mg %
Damas: > 45 mg %

3. LDL
Bajo riesgo < 150 mg %
Sospechoso 150 a 190 mg %
Alto Riesgo > 190 mg %

4. TRIGLICERIDOS
25 – 160 mg %

5. VLDL=TAG/5
CUESTIONARIO

1. ¿Por qué es importante determinar las fracciones de colesterol en suero?

2. ¿Cuál sería la solución buffer apropiada en la terminación de colesterol, si reactivo

enzimático trabaja a un pH óptimo de 6,7?

3. ¿Cómo prepararía 800 mL de Buffer para el reactivo enzimático de Colesterol de pH

6,7 y 50 mM?

4. Defina el término Índice Aterogénico y manifieste los valores: normales, bajo riesgo y
alto riesgo.

5. Describa el proceso de la formación de las placas de ateromas.