Bioquímica de Alimentos, Facultad Ciencias Químicas y

Farmacéuticas, Universidad de Chile.

TRABAJO PRÁCTICO N°1. PREPARACIÓN DE CASEÍNA.

Las caseínas (del latín caseus, queso) son por definición las fosfoglucoproteínas que
precipitan de la leche descremada a pH 4.6 y 20°C, es decir, son proteínas que contienen
tanto residuos de hidratos de carbono como de fosfatos; estos últimos generalmente
esterifican a los hidroxilos de las serinas.
Su estabilidad en el seno de la leche se debe a su fuerte carga eléctrica negativa, que
cuando se neutraliza en el punto isoeléctrico, las hace inestables. Su contenido de
nitrógeno es aproximadamente de 15.6%, excepto en el caso de la fracción k que es de
14.3%, ya que contiene una mayor cantidad de hidratos de carbono.

La caseína está formada por alpha(s1), alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-caseína

formando una micela o unidad soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son solubles en la leche,
solas o combinadas. Si se añade la kappa caseína a las dos anteriores o a cada una de ellas
por separado se forma un complejo de caseína que es solubilizado en forma de micela.
Esta micela está estabilizada por la kappa caseína mientras que las alfa y beta son
fosfoproteínas que precipitan en presencia de iones calcio.

A. AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA: Caliente en un vaso de precipitado 150ml de agua

destilada a 38ºC, añada 50ml de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido
acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta). Deje
sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal. Lave el precipitado
con 20ml de etanol en el mismo filtro. - Seque el precipitado colocando varios pliegues de
papel de filtro. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente
pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico o
hexano. Filtre nuevamente. Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de fácil
manipulación que es la caseína.
B. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CASEÍNA: Coloque aproximadamente 250 mg de
caseína en un vaso de 50ml. Agregue 20ml de agua destilada y 5 ml de NaOH 1N; agite
hasta lograr una solución total de la caseína. -Una vez disuelta la caseína, se vierte en un
matraz aforado de 50 ml, adicione 5 ml de ácido acético 1N y diluya con agua destilada
hasta un volumen final de 50ml y mezcle bien. - La solución debe ser clara y limpia y si no
es así, debe volver a filtrar. Anote la concentración de la solución en mg/ml

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TRABAJO PRÁCTICO nº 2. PROPIEDADES Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS

1- PROPIEDADES

Las proteínas, macromoléculas polielectrolíticas, están presentes en todos los seres

vivos uni y pluricelulares, constituyendo gran parte de la estructura celular. Además
muchas de ellas tienen funciones fisiológicas y bioquímicas especializadas.
Las proteínas son solubles en soluciones acuosas ya que sus grupos iónicos interactúan
con las moléculas polares del agua. La carga neta y el grado de interacción de la
proteína con el solvente dependerán de la naturaleza de los aminoácidos que las
construyen y de los factores relacionados con el medio en que está disuelta, como:

a) pH
b) Fuerza iónica
c) Efecto de la temperatura
d) Presencia de ciertos aniones y cationes
e) Polaridad del solvente

a) EFECTO DEL pH SOBRE LA SOLUBILIDAD: Las proteínas poseen grupos ácidos o

básicos provenientes de los grupos ionizables de las cadenas laterales R de los residuos
de aminoácidos que las componen. Estos grupos ácidos y básicos de las proteínas
tienen distinto grado de ionización según el pH de la solución, considerando sus
respectivos valores de pKa. El grado de ionización afecta la interacción entre las
moléculas de proteínas, y entre las proteínas y el solvente.
Cada proteína tiene un valor característico de punto isoeléctrico (pI), el cual es el pH en
el que la carga neta de la proteína es cero y no migra en un campo eléctrico. Las
proteínas presentan una mínima solubilidad en su pI.

b) EFECTO DE LA FUERZA IONICA DEL SOLVENTE: La fuerza iónica depende de la

concentración y carga de los iones que existen en una solución. Cuando se añade una
sal a una proteína, ocurre un incremento de la solubilidad de esta. A este efecto
solubilizante de la fuerza iónica se le llama SALTING IN, y se produce en un rango de
fuerza iónica baja. Cabe mencionar que las proteínas precipitan y se desnaturalizan en
agua destilada.

Al seguir aumentando la fuerza iónica (seguir agregando sal), se obtiene un máximo de

solubilidad, seguido de un descenso de la misma. Se conoce como SALTING OUT al
efecto precipitante de la fuerza iónica alta y ocurre debido a que las proteínas
prefieren interaccionar entre ellas compitiendo por el agua con las moléculas de sal,
precipitando. Este efecto puede ser utilizado en forma selectiva para lograr concentrar
y purificar proteínas.

La mayor parte de los solventes orgánicos son excelentes precipitantes de las

proteínas. Sin embargo solventes orgánicos que presentan constates dieléctricas
relativamente altas pueden ser buenos solventes proteicos, entre ellos se encuentran
el dimetilsulfoxido, la formamida y el acido dicloroacético.

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c) EFECTO DE LA TEMPERATURA: Las temperaturas altas tienen un efecto

desnaturante sobre las proteínas, lo que se manifiesta como una disminución de la
solubilidad (precipitan) y pérdida de la actividad catalítica en el caso de las enzimas y
acción biológica en general.

d) PRESENCIA DE ANIONES Y CATIONES EN EL MEDIO: Las proteínas tienen distinta

carga según el pH del medio, y forman sales insolubles con ciertos iones metálicos
pesados y otros iones.
A valores de pH sobre el pI la proteína estará cargada negativamente, por lo que la
adición de metales pesados (ej: Cu2+, Hg2+, Pb2+) neutraliza la carga de la proteína y
causa su precipitación.

A valores de pH bajo el pI la proteína se encontrará cargada positivamente, por lo que

la adición de algunos compuestos ácidos fuertes como el ácido tricloacético (TCA),
acido sulfosalesílico (que tienen carga negativa fuerte), formaran sales insolubles.

2- CUANTIFICACION

Existen varios métodos por los cuales es posible medir la concentración de proteínas
presentes en una solución. La elección del método depende de la naturaleza de la
proteína, de la rapidez y sensibilidad deseadas.

a) METODO DE BIURET: Los compuestos que tienen dos o más uniones peptídicas
(como por ejemplo las proteínas) producen un color púrpura característico cuando se
tratan con soluciones de sulfato de cobre diluidas. El color se debe a la formación de
un complejo de coordinación entre el cobre y cuatro átomos de nitrógeno. Este
método es reproducible para una proteína dada, pero requiere de altas
concentraciones de proteína para la formación del color, siendo el rango útil del
método entre 0,5 y 10 mg de proteína agregada. El color formado es estable durante
una hora. Como interferente cabe mencionar al MgSO4, pues precipita en el medio.
Para determinar la concentración protética de una muestra se debe utilizar una curva
de calibración con una proteína de concentración conocida y se sigue
espectrofotométricamente a 540 nm.

b) METODO TURBIDIMÉTRICO: Las proteínas precipitan cuando se mezclan con

soluciones diluidas de ácido tricloacético, sulfosalisílico o ferrocianuro de potasio en
ácido acético. La turbidez generada por la precipitación de las proteínas es posible
seguirla a una longitud de onda de 620nm y es proporcional a la cantidad de proteína
presente. Sin embargo este método presenta desventajas, ya que no todas las
proteínas precipitan en la misma cantidad, e interfieren otras sustancias precipitables
por los ácidos como los ácidos nucleicos. Es un método sencillo y rápido. Su rango útil
es entre 0,1 y 3 mg de proteína agregado.

c) METODO DE WARBURG: La tirosina y el triptófano absorben a 275 y 280 nm

respectivamente, por lo tanto las proteínas que contienen aminoácidos pueden
absorber en esta región. El coeficiente de extinción específica varía de acuerdo a la
cantidad de estos aminoácidos en una proteína dada. La desventaja de este método es
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que muchos compuestos absorben en esta región, particularmente los ácidos

nucleicos, que poseen un máximo de absorción a 260 nm. Las proteínas puras
presentan una razón de absorción 280nm/260 nm cercana a 1,8, mientras que los
ácidos nucleicos esta razón es de 0,5. El rango útil del método es entre 0.1-0,6 mg/ml
de proteína. Al utilizar este método se deben utilizar factores de corrección de la
lectura espectrofotométrica (valores tabulados) para descontar los interferentes.

d) METODO DE FOLIN-LOWRY: Las proteínas reaccionan con el reactivo de Folin para

dar un complejo coloreado. El color que se forma es debido a la reacción del cobre
alcalino con la proteína, tal como sucede con el ensayo de Biuret, y la reducción del
fosfomolibdato por la tirosina y el triptófano presentes en la proteína. La intensidad
del color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes y cambiará según
la clase de proteínas. Se lee en espectrofotómetro a 750 nm. Permite cuantificar
muestras del orden de los ng de proteína.

e) ABSORCIÓN A 210: Por debajo de los 230 nm la extinción de una solución de

proteínas sube bruscamente alcanzando un máximo a 190 nm, esto se debe
principalmente al enlace peptídico. En la práctica es conveniente medir a 210 nm, ya
que el coeficiente de extinción molar a esta longitud de onda es de cerca de 200 para
la mayoría de las proteínas. Todas ellas tienen una absorción específica similar, pues el
contenido de los enlaces peptídicos es semejante. Numerosos compuestos, tales como
los ácidos carboxílicos, amortiguadores iónicos, alcoholes, bicarbonato y compuestos
aromáticos también absorben en esta región, así es que hay que tener cuidado con la
interpretación de resultados.

g) METODO DE BRADFORD: Se basa en la reacción del colorante Azul de Coomassie G-

250 con los grupos aminos libres de las proteínas. Se lee a 295 nm y permite la
cuantificación de proteínas en el rango de los µg.

h) METODO DE KJEDAHL: Este método se basa en la cuantificación del nitrógeno

presente en una muestra, de acuerdo al origen de la muestra, a través de un factor se
relaciona la cantidad de Nitrógeno encontrado con el porcentaje de proteínas que lo
originaron. El método se basa en la destrucción de la materia orgánica con ácido
sulfúrico concentrado, formándose sulfato de amonio que en exceso de hidróxido de
sodio libera amoníaco, el que se destila recibiéndolo en: Acido sulfúrico donde se
forma sulfato de amonio y el exceso de ácido es valorado con hidróxido de sodio en
presencia de rojo de metilo, o Acido bórico formándose borato de amonio el que se
valora con ácido clorhídrico. Este método es particularmente usado en valoración de
contenido proteico en alimentos.

i) MÉTODO DE BCA: El ácido bicinconínico, sal sódica, es un compuesto capaz de

formar un complejo púrpura intenso con iones Cu+1 en medio alcalino. Este reactivo
forma la base de un método analítico capaz de monitorizar el ión cuproso producido en
una reacción entre las proteínas con Cu+2 en medio alcalino (reacción de Biuret). La
estabilidad del reactivo y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de
proteínas que es sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros métodos. La sensibilidad del método va entre 0,5 a 10
mg de proteína agregada.

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PARTE EXPERIMENTAL

1- METODO DE BIURET: realice una curva de calibración, utilizando una solución patrón
de BSA de concentración conocida, determinada por pesada. Esta curva debe cubrir el
rango útil del método, para esto realice las diluciones necesarias con NaCl 0,1 M para
quedar en este rango. No olvide hacer un blanco.

Además recibirá una muestra problema de concentración desconocida. Esta muestra

está en el rango de 1-5 mg/ml de proteína.

Procedimiento: ponga 4 ml de reactivo de Biuret a su set de tubos de ensayo, agregue

1 ml por tubo de solución de ovoalbúmina diluida (curva de calibración), 1 ml de su
muestra problema y1 ml de blanco, agite espere 20 minutos a temperatura ambiente y
lea en espectrofotómetro a 540 nm.

2- EFECTO DEL pH SOBRE LA SOLUBILIDAD DE UNA PROTEINA.

Prepare un set de tubos tal como se indica en el cuadro adjunto, agregando los
componentes en el orden señalado, agitando después de cada agregada. Examine los
tubos a los 10 minutos.

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

(mL) (mL) (mL) (mL) (mL)
Caseína (5 mg/mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Agua destilada 8,4 8,5 8,0 7,0 7,4
Ácido acético 0,01 N 0,6 --- --- --- ---
Ácido acético 0,1 N --- 0,5 1,0 2,0 ---
Ácido acético 1,0 N --- --- --- --- 1,6

Informe el grado de turbidez de cada tubo, indicando si es: O= opalescente, P=

precipitado. N= no hubo cambio.
Además calcule el pH de cada tubo, utilizando la fórmula de Hendersor- Hasselbach.
NO OLVIDE CONSIDERAR LA CONSENTRACIÓN DE LA SOLUCIÓN QUE CONTIENE A LA
SOLUCIÓN DE CASEÍNA (PRÁCTICO ANTERIOR).
¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína? Justifique su respuesta.

3- EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA SOBRE LA SOLUBILIDAD DE UNA PROTEÍNA.

4.1-Salting in: Tome dos gotas de proteína BSA y lleve a 5 ml con agua destilada,
agregue ácido acético 0,1 N gota a gota, mezclando suavemente después de cada
adición. Observará la aparición de un enturbiamiento cuando se alcance un pH
correspondiente al punto isoeléctrico. Siga agregando ácido hasta que el
enturbiamiento desaparezca. Una vez ocurrido esto, agregue NaOH 0,1 N hasta su
enturbiamiento, es decir, retornar al pI (la proteína tamponada en su pI), empiece a
agregar lentamente NaCl 2M hasta que desaparezca el precipitado. Anote los
volúmenes gastados.

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Volumen de ácido acético 0,1 N hasta pH=pI

Volumen de ácido acético 0,1 N hasta pH>pI
Volumen de ácido acético 0,1 N hasta pH<pI
Volumen de NaOH 0,1 N hasta pH=Pi
Volumen de NaCl 2M hasta la solubilización de la proteína
¿Por qué el NaCl permitió la solubilización de la proteína?

4.2-Salting out: prepare 5 tubos con sulfato de amonio y agua según las cantidades que
se dan en el siguiente cuadro, agitando después de agregar cada componente al tubo.
Deje reposar los tubos 15 minutos y anote el precipitado o enturbiamiento observado
con ++++, ++ , 0
Calcule la fuerza iónica de cada tubo utilizando la siguiente fórmula:

µ=½∑ci zi2

ci : Concentración del ión

zi : Número de carga del ión

Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5

(NH4)2SO4 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0
2,5 M (mL)
Agua (mL) ----- 1,0 2,0 3,0 4,0
Proteína en 2 2 2 2 2
gotas

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TRABAJO PRACTICO Nº3. CINETICA ENZIMATICA

Medición de la actividad enzimática

Las enzimas son biocatalizadores complejos de gran especificidad y eficiencia,

producidas por las células de organismos vivos, que aumentan la velocidad de las
reacciones biológicas a través de vías bien definidas y cuya actividad está sujeta a
regulación. Las sustancias sobre las que actúan las enzimas, transformándolas, se
denominan sustratos.

Los ensayos enzimáticos son métodos de laboratorio para medir actividades

enzimáticas. Son vitales para el estudio de las cinéticas enzimáticas y la inhibición
enzimática. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa
presente y del nivel de actividad de la misma (capacidad de transformación de sustrato
en producto). Se expresa como la cantidad de sustrato convertido por unidad de
tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reacción. Todos los ensayos enzimáticos
miden el sustrato consumido o el producto generado en la reacción durante un
tiempo.

Para que una sustancia sea apropiada como sustrato de una enzima en un ensayo
enzimático debe reunir los siguientes requisitos: a) Que experimente una
transformación bien definida por la acción catalítica de la enzima; b) Que sea específica
para la enzima respectiva o un grupo muy restringido de enzimas; c) Que según las
condiciones de ensayo, previamente fijadas, no sufra una descomposición espontánea
o produzca otras reacciones no catalizadas por la enzima; d) Que la transformación del
sustrato sea fácilmente medible.

Al iniciar el trabajo con una enzima es indispensable fijar las condiciones

experimentales considerando los conocimientos sobre la naturaleza de las enzimas. Es
por ello que debemos considerar: el efecto de la temperatura, pH, Fuerza iónica,
necesidad de co-factores enzimáticos, entre otros (depende de la enzima). Debemos
recordar que la alteración de los factores previamente mencionados afectará la
actividad enzimática medida.

Para demostrar y medir una actividad enzimática es necesario conocer la cantidad de

producto liberado por tiempo. La curva de progreso de una reacción enzimática
corresponde a la gráfica de aparición de producto en el tiempo o desaparición del
sustrato en el tiempo en una reacción donde esté actuando la enzima. El ensayo
enzimático más simple que permite determinar la actividad enzimática, mide la
velocidad enzimática en el tiempo inicial, a partir de la pendiente de la curva de
progreso.

¿Cómo se calcula la actividad enzimática?

Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que

cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto en las condiciones definidas
para nuestro ensayo (temperatura, pH, fuerza iónica, etc.). Normalmente, las unidades

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de actividad que contiene una solución se suele expresar en función del volumen de la
misma, en U/mL de solución o referida a la cantidad de proteína presente en la
solución, expresada en U/mg de proteína. En este último caso, la actividad enzimática
se denomina Actividad específica.

U= µmoles/min (actividad)
U/mL

Para calcular la actividad enzimática en micromoles de sustrato transformados

por minuto, hay que tener en cuenta la Ley de Lambert-Beer:

A = €· b· C

Donde A es la absorbancia , € es el coeficiente de extinción molar (M-1 x cm-1), b es

grosor de la cubeta (1 cm) y c la concentración en moles por litro.

Despejando obtenemos:
c = A/(€·b) y como sabemos que b=1 c=A/€

Luego en lugar de usar la absorbancia directamente utilizaremos la velocidad inicial

(m) obtenida de la pendiente de la cuerva de progreso absorbancia (sustrato) v/s
tiempo en minutos

m/€= (Molar/min), con lo que si consideramos el volumen total de reacción

VR (volumen sustrato + volumen enzima)

U = (m·VR)/ € = µmoles Unid. Act. Enz. (U)

Luego si queremos calcular U/ml, consideramos el volumen de enzima utilizado para el

ensayo enzimático y dividimos la actividad enzimática U por los ml de enzima
utilizados.

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Controles de un ensayo enzimático:

-Blanco de una reacción enzimática

-Tiempo cero de una reacción enzimática (cantidad de producto en el medio de ensayo
antes de empezar la reacción)
-Control no enzimático (Contaminación del producto inicial más el producto generado
no enzimáticamente en las condiciones de ensayo)
PARTE EXPERIMENTAL

OBJETIVOS ESPECÍFICOS DEL TRABAJO PRÁCTICO

1. Determinar la actividad enzimática de la peroxidasa de rabanito.

2. Realizar curvas de progreso con distintas concentraciones de enzima.
3. Determinar parámetros cinéticos básicos.

PROTOCOLO DEL ENSAYO ENZIMÁTICA

Usted dispone de una solución de guayacol al 1% en 50% etanol 50% H20

Solución de H202 1%
Extracto enzimático de rabanito (no olvide mantenerlo en hielo)

1. Preparar una dilución en serie, de tres tubos, de enzima, a partir de una solución
de extracto de rabanito pura. Preparar las siguientes soluciones:

Solución A mL Solución B mL

H2O dest 4.7 H2O dest 2

Guayacol 1% 0.1 Enzima dil 0.5
H2O2 0.2 Total 2.5
Total 5 mL

2. Tomar 1.5 mL de la solución A y agregar en un tubo o directamente sobre la cubeta

del espectrofotómetro.

3. Usar esta solución como blanco de la reacción coloque dentro del espectrofotómeto
y marque el cero en el espectrofotómetro (a 470 nm).

4. Agregue 1,5 mL de la solución B sobre la solución A y agite rápidamente. Tome la

primera lectura en ese momento (Tiempo 0). Registrar las lecturas adicionales cada 15
segundos por tres minutos. Anotar en forma tabular.

5. Repetir paso 4 para cada dilución de enzima. Al finalizar deberá tener una tabla con
tres columnas de datos. Si hacen todo como debe ser, el proceso completo no les
tomará más de 30 minutos.

6. Grafique los datos en formato de Absorbancia vs Tiempo en segundos. Esta curva

será la Curva del progreso de la reacción. La parte que más nos concierne es la parte
lineal temprana (antes de que comiencen a estabilizarse las lecturas). Dibuje sobre
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esos puntos la mejor línea recta posible y calcule la pendiente de la línea (no de los
datos). Las unidades de estas gráficas son en Absorbancia sobre tiempo.

7. Determine actividad enzimática considerando que coeficiente de extinción molar

para el complejo tetraguayacol es € =7.019 M-1 cm-1.

Tarea (previa al práctico): describa la reacción enzimática catalizada por la

peroxidasa de rabanito usando como sustratos guayacol y H 202. ¿Qué cambio visible
podremos observar en esta reacción?

Pregustas para el informe:

¿Qué concentración de la enzima considera usted que es la óptima en sus

condiciones de trabajo?
¿En qué tiempo calcularía la actividad la actividad enzimática?
¿Alcanzó a la llegada a un equilibrio?
¿Qué ensayos experimentales faltarían para determinar Km y Vmáx?

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TRABAJO PRÁCTICO N°3. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON DODECIL

SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE).

La electroforesis en geles de poliacrilamida es el método de análisis cualitativo de

mezclas de proteínas de uso más extendido. Es particularmente útil en el seguimiento
de purificación de proteínas y la determinación de la masa molecular relativa de las
proteínas estudiadas.

Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización vinílica del monómero

acrilamida (CH2=CH-CO-NH2) y del monómero entrecruzador N,N´-metilen-bis-
acrilamida (CH2=CH-CONH-CH2-NH-CO-CH=CH2). La polimerización se inicia con la
formación de radicales libres del monómero, que se producen por radicales libres de
oxígeno, por causa de la acción de iones persulfato (iniciador de la reacción). Las
aminas terciarias como el N,N,N,N´-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como
catalizadores de esta reacción, porque causan la formación de radicales libres del
persulfato. Esta reacción es fuertemente inhibida por altos niveles de oxígeno, por lo
que la solución debe ser desgasificada para lograr una formación de gel reproducible.
El resultado final de la polimerización de estos compuestos generará una maya que
opondrá resistencia al paso de las proteínas retardando su migración.

Con el fin de asegurar la completa linealización de las proteínas, previo a su carga en el

gel, son hervidas durante 5 minutos en un tampón que contiene 2-mercapto etanol y
dodecil-sulfato de sodio (SDS). El primero reduce los puentes disulfuros presentes en
la estructura terciaria de las proteínas y el detergente SDS desnaturaliza por completo
las proteínas, rompiendo las interacciones no covalentes que determinan la estructura
terciaria y cuaternaria. El anión SDS se une a las proteínas por absorción no específica
(aproximadamente una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos, con
una relación SDS/proteína máximo de 1,4 g/g), por lo que todos los complejos SDS-
proteína toman carga neta negativa.

Al aplicar una diferencia de potencial a las proteínas cargadas negativamente estas

migraran hacia el ánodo, generando el fenómeno conocido como movilidad
elecroforética. La relación carga/masa es aproximadamente igual para todas las
proteínas de la muestra, por lo que el tamaño de la proteína será el factor
determinante de la separación. A mayor masa molecular aparente las proteínas
tardaran más tiempo en migrar hacia el ánodo, debido a la oposición provista por la
maya de acrilamida del gel. Por el contrario, a menor tamaño molecular menor será el
tiempo requerido para atravesar dicha maya.

El Rf es una medida convencional de la movilidad de la proteína relativa al frente de

migración y se define como la distancia desde el inicio del gel separador hasta el centro
de cada banda dividida entre la distancia a la que ha migrado el ión líder. Con motivo
de lograr una migración homogénea

El peso molecular (PM) de las proteínas puede determinarse en electroforesis al

comparar las movilidades electroforéticas (Rf) de varios marcadores de peso molecular
conocido. La migración de los derivados proteína–SDS hacia al ánodo es inversamente
proporcional al logaritmo de su peso molecular (log PM). Por lo que, al realizar una
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grafica del log PM de la proteína patrón (std PM) en función del valor de Rf se puede
estimar, por el análisis de regresión lineal o por interpolación en la curva del log de PM
contra Rf, el peso molecular de las bandas de proteína observadas. Cabe mencionar
que para observar las bandas de proteína se hace necesario la utilización de colorantes
tales como azul de coumassie, rojo de ponseu, nitrato de plata, entre otras.

PARTE EXPERIMENTAL

1- Preparación de geles.

Monte los vidrios de acuerdo a las instrucciones del docente, luego conservando en
hielo mezcle en un vaso de precipitado plástico los reactivos necesarios para el gel
concentrador al 10% según la tabla adjunta. Una vez realizada la mezcla agregue la
mezcla al sistema de vidrios montado, a continuación cuidadosamente coloque una
mezcla de agua saturada en butanol sobre la mezcla del gel. Mantenga a temperatura
ambiente hasta que se observe gelificación (aparición de dos fases), a continuación
retire el agua saturada en butanol y lave con abundante agua destilada. Prepare la
mezcla para el gel concentrador según la tabla y agregue sobre el gel separador la
solución. Finalmente coloque la peineta cuidadosamente y deje gelificar.

10%(separador) ml 5% (concentrador) ml
Agua destilada (ml) 3,850 2,1
0,5 M Tris-HCl(pH 6.8) - ---------- 0,38
0.4% SDS (mL)
1.5 M Tris-Base(pH 8.8) - 2,6 -----------
0.4% SDS (mL)
30% Acrylamide -0.8% Bis 3,340 0,5
(mL)
10% Am Persulfate (μL) 0,1 0,03
TEMED (μL) 0,01 0,003
SDS 10% 0,1 0,03

2- Corrida y carga del gel.

Monte el gel previamente preparado en la cámara electroforética, a continuación

agregue amortiguador de corrida (Glicina 192 mM, Tris-base 25mM y SDS 0,1%) hasta
llenar las cámaras. Paralelamente prepare las muestras de proteínas que se le
entregaran mezclando 1 parte de buffer de carga 4x(Tris-HCl (pH 6.8) 100 mM, SDS 8%,
azul de bromo fenol, glicerol 40% y 2-Mercaptoetanol 20%) con 3 partes de muestra.
Hierva las muestras por 5 minutos, finalmente cargue las con un micropipeta los
bolsillos en su gel colocando con las muestras hervidas y un estándar de peso
molecular, tape las cámaras y conéctelas a la fuente de poder. Corra el gel a voltaje
constante hasta que el frente de corrida (azul) alcance el final del gel.

*No olvide anotar el orden en que usted cargo las muestras en el gel.

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3- Tinción de las proteínas separadas en el gel.

Una vez terminada la corrida desmoste los vidrios y lave con agua destilada su gel,
luego en un recipiente plástico coloqué su gel y agregue solución teñidora (metanol,
agua, acético 5:5:2 y 0,1% azul coumassie R-250). Mantenga su gel a 60 °C por 1 hora y
luego retire la solución teñidora y agregue solución desteñidora (25% etanol,10% ácido
acético glacial, realice este paso las veces necesarias), adicione mas solución
desteñidora e incube a 60 °C hasta observar bandas discretas.

4- Determinación de los Rf y masa molecular aparente.

Mida con una regla la distancia desde el inicio del frente de corrida hasta el centro de
cada banda observada, esto realícelo para cada carril por separado. Utilizando el
estándar de peso molecular determine las masas moleculares aparentes de cada
banda.

Compare los perfiles proteicos obtenidos, analice las diferencias y semejanzas entre las
distintas muestras.

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