UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUIMICA Y BIOLOGIA

ANÁLISIS INSTRUMENTAL
SEGUNDO SEMESTRE 2015

Trabajo de investigación
“Técnicas HPLC y Espectrofotometría
de absorción atómica”
 I INTRODUCCIÓN

1.1 Espectrometría de absorción atómica

La espectrometría de absorción atómica es una técnica para determinar la

concentración de un elemento metálico determinado en una muestra.

Los principios teóricos de la absorción atómica fueron establecidos en 1840 por

Kirchhoff y Bunsen, pero la forma moderna fue desarrollada en gran medida durante la
década de los 50 por Alan Walsh, apareciendo los primeros instrumentos comerciales
a principios de 1960.

Se basa en la siguiente ley: “cualquier materia que pueda emitir luz a una cierta
longitud de onda también absorberá luz a esa longitud de onda”.

Los electrones de los átomos pueden ser promovidos a orbitales más altos por un
instante mediante la absorción de una cantidad de energía generando luz a una
determinada longitud de onda. En general, cada longitud de onda corresponde a un
solo elemento. Como la cantidad de energía que se pone en la llama es conocida, y la
cantidad restante se puede medir, es posible, a partir de la ley de Beer-Lambert,
calcular cuántas de transiciones tienen lugar, y así obtener una señal que es
proporcional a la concentración del elemento que se mide.

Los componentes básicos de un equipo de absorción atómica son:

1.2 Cromatografía de líquidos HPLC

En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fundó Waters Corporación y comenzó a

vender instrumentos de HPLC. Esto promovió el uso de HPLC en las áreas de análisis
prácticos. Los sistemas de CL que Waters Corporation desarrolló utilizan bomba de
alta presión que genera un rápido flujo de eluyente, y por lo tanto resultó en una
mejoría dramática en el tiempo de análisis. Comparados con la “cromatografía de baja
presión” los nuevos tipos se llamaron “cromatografía líquida de alta presión”. Por lo
tanto, se solía pensar que HPLC significa cromatografía líquida de alta presión, sin
embargo hoy en día es entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografía
Líquida de Alta resolución.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utiliza una fase móvil líquida para
separar los componentes de la muestra. Los componentes se disuelven en un
disolvente y a continuación se hacen pasar por la columna a una gran presión. A
continuación, interactúan con la fase estacionaria y salen en momentos distintos, igual
que ocurre con la cromatografía de gases. Si una cantidad excesiva de gas
permanece disuelta en la fase móvil líquida a la presión de la columna, el gas puede
salir del detector y provocar grandes picos no deseados. Estos pueden eliminarse
mediante el burbujeo de helio de gran pureza a través del líquido cuando el sistema
HPLC no disponga de un desgasificador integrado. El helio debe presentar unos
niveles bajos de hidrocarburos, ya que estos pueden disolverse en el disolvente y
generar ruido de línea base.

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 II DESARROLLO

2. 1 Espectrofotometría de absorción atómica

2.1.1 Insdustria:

La aplicación principal del método es el análisis cuantitativo de precisión para un metal

dado. La espectroscopia de absorción atómica es el método más empleado para la
determinación de metales debido a su especificidad, sensibilidad y facilidad de
operación.

Como el método puede analizar hasta más de 60 elementos de forma directa,

principalmente en el rango de μg/ml-ng/ml, la espectroscopia de absorción atómica se
ha usado para analizar trazas de muestras en diferentes y variadas industrias como
por ejemplo: geológicas, biológicas, metalúrgicas, vítreas, cementos, aceites para
maquinaria, sedimentos marinos, atmosféricas, así como en la industria del petróleo y
sus subproductos; y una amplia gama de muestras de industrias químicas y
farmacéuticas.

2.1.2 Análisis:

La muestra en forma líquida es aspirada a través de un tubo capilar y conducida a un

nebulizador donde ésta forma un rocío. Las gotas son conducidas a una flama, donde
se produce la formación de átomos. Estos átomos absorben la radiación emitida por
una lámpara y la cantidad de radiación absorbida está en función de su concentración.
La señal de la lámpara una vez que pasa por la flama llega a un monocromador. Esta
señal de radiación electromagnética llega a un detector y pasa a un amplificador y por
último a un sistema de lectura. Para el análisis de una muestra, se deben poner las
condiciones específicas del elemento que vamos a analizar y luego habrá que calibrar
siguiendo uno de estos procedimietos:

- Curva de calibrado:
Se utilizan soluciones patrones que contienen el elemento a determinar de
concentraciones conocidas. Se representan la absorbancia de cada solución patrón
frente a la concentración. Se procura trabajar en el intervalo lineal de la curva. Una vez
obtenida la curva patrón, se mide la absorción de la misma, utilizando idénticas
condiciones a las usadas cuando se preparó la curva patrón. De la medida de la
absorbancia del problema se puede determinar su concentración a partir de la curva
de calibrado por extrapolación.

- Método de adición:
Permite trabajar en presencia de una interferencia sin eliminarla y obtener una
determinación con buena exactitud del elemento en la solución-muestra. Interferencias
físicas y algunas interferencias químicas pueden ser compensadas empleando este
método que consiste en la adición de cantidades diferentes de una solución estándar
del elemento a determinar a varias porciones iguales de la solución-muestra. De esta
forma, la interferencia afectará por igual a todas las soluciones.

Como muchos materiales de interés no son directamente solubles en los disolventes

habituales, requieren un tratamiento de descomposición previo para obtener una
disolución del analito adecuada para la atomización. Los tratamientos más habituales
son con ácidos minerales en caliente, oxidación con reactivos líquidos (digestión
húmeda) , combustión en una bomba de oxigeno y/o fusión a elevada temperatura.

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2.1.3 Beneficios:

Las ventajas principales de esté tipo de método son que puede analizar hasta 82
elementos de forma directa, sus límites de detección son inferiores a la ppm, tiene una
precisión del orden del 1% del coeficiente de variación, la preparación de la muestra
suele ser sencilla, tiene relativamente pocas interferencias, su manejo es sencillo, el
precio es razonable y existe abundante bibliografía.

En comparación a otros métodos similares como la fotometría de llama, donde la

sensibilidad de ambos métodos son similares la espectrofotometría de absorción
atómica la ha desplazado casi completamente, debido a que la primera es más
susceptible de interferencias. La mayor aplicación de la fotometría de flama es en la
detección de Sodio y Potasio mientras que por EAA es posible determinar más de 70
elementos. Con respecto a la espectroscopia de fluorescencia atómica, a pesar de que
esta es más sensible que las dos técnicas nombradas anteriormente, requiere de
fuentes de radiación más intensas. Esta técnica produce mayores efectos de
interferencia y este es otro factor limitante.

2.1.4 Detector:

Los detectores miden la intensidad de la radiación antes y después de la absorción por

la muestra. A partir de los valores obtenidos se podrá calcular la radiación absorbida.
En los aparatos comerciales se emplean tubos fotomultiplicadores. Un tubo
fotomultiplicador consiste de un cátodo fotoemisivo (fotocátodo), consistente
de metales alcalinos, seguido de electrodos enfocadores, un multiplicador de
electrones (dínodos) y un colector de electrones (ánodo) en un tubo al vacío.

Cuando la luz entra al fotocátodo, este convierte la energía de la luz incidente en

fotoelectrones emitidos al vacío, los cuales son enfocados hacia los dínodos, donde
son multiplicados en un proceso de emisión secundaria. Al final, la señal de salida se
obtiene en el ánodo.

Gracias a la emisión secundaria de cada dínodo, el tubo fotomultiplicador presenta el

beneficio de tener una alta sensibilidad y un bajo ruido.

2. 2 Cromatografía de líquidos HPLC

2.2.1 Industria:

La aplicación principal del método es la separación de materiales con grandes pesos

moleculares que presentan una volatilidad muy baja y no pueden separarse mediante
cromatografía de gases.

Se usa principalmente en la biotecnología, ciencias e industria médica y farmacéutica.

En la industria médica y farmacéutica permite un análisis cualitativo y cuantitativo, en
el cual se analizan materias primas y productos terminados para asegurarse que la
calidad de los niveles previamente establecidos se cumpla. Este análisis lo realiza un
laboratorio de control de calidad de la empresa

2.2.2 Análisis:

La HPLC se usa para encontrar pequeñas cantidades de anualitos en matrices de

muestras difíciles, con esto se puede verificar que la calidad de los niveles
previamente establecidos se cumpla. La HPLC comienza en forma de una manguera

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de alta presión que genera y mide una tasa de flujo especializada desde la reserva
que soporta al solvente. Un inyector introduce la muestra de forma continua en la fase
de vapor del flujo móvil que lleva la muestra hacia la columna de la HPLC. Un detector
se usa para medir las bandas separadas del compuesto conforme se eluden desde la
columna HPLC. La fase móvil saca el detector y se puede recolectar o enviar para
hacer pruebas.

2.2.3 Beneficios:

El HPLC es un proceso automático que toma sólo unos pocos minutos para producir
resultados. Esta es una marcada diferencia en la cromatografía líquida que utiliza la
gravedad en lugar de una bomba de alta velocidad para forzar compuestos a través de
un tubo densamente empaquetado. Es capaz de separar macromoléculas y especies
iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de
otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida
interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a
una fase estacionaria activa. Los resultados obtenidos son de una alta resolución y
son fáciles de leer, y las pruebas se reproducen con facilidad a través del proceso
automatizado.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor
gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

2.2.4 Detector:

Ultravioleta (UV): Este tipo de detector responde a sustancias que absorben luz. El
detector de UV es principalmente utilizado en las ciencias biomédica y farmacéutica
para separar e identificar los principales componentes activos de una mezcla. Su
ventaja es que son los más versátiles, ya que cuentan con la mayor sensibilidad y
linealidad.

Fluorescencia: Es el detector más sensible. Se utiliza prácticamente de manera exclusiva

en la cromatografía líquida (LC). Se trata de un detector específico que detecta
solamente aquellas sustancias que emiten luz.. Como es muy sensible, su respuesta
es solamente lineal sobre un rango de concentración relativamente limitado. Como no
hay muchos elementos que se tornan fluorescentes, los científicos necesitan sintetizar
muestras para que sean detectables.

Índice de refracción (IR): Es el detector LC menos sensible y utiliza un monocromador.

Detecta componentes que no son iónicos. Sirve para analizar el azúcar, alcohol,
ácidos grasos y polímeros. Su ventaja es que Es adecuado para la detección de todos
los componentes.

Detector electroquímico: La detección se basa en amperometría, polarografía,

culombimetría y conductrometria. Ofrecen una alta sensibilidad, simplicidad,
conveniencia y aplicabilidad generalizada. Es especialmente adecuado para el uso con
el sistema de tipo semi-micro o capilar.
Espectrofotómetro de masas: Los anualitos se detectan basándose en su peso
molecular. Su uso no se limita a la identificación de la estructura y se puede utilizar
para cuantificar límite de detección muy bajo de componentes elementales y
moleculares.

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 V CONCLUSIONES

5.1 La espectrofotometría de absorción atómica es un método de análisis

principalmente de metales que se utiliza en una gran variedad de industrias debido a
su especificidad y sensibilidad. El método se basa en el uso de un equipo que a través
de sus distintos componentes relaciona la absorbancia con concentración de un
analito, utilizando ya sea el método de curva de calibrado o de adición estándar. El
principal beneficio con respecto a otros métodos similares es que es el método que
produce menos efectos de interferencias, además de su alta cantidad de elementos
que analiza directamente. Utiliza detectores del tipo tubo fotomultiplicador, que poseen
una alta sensibilidad y bajo ruido.

5.2 La cromatografía de líquido de alta resolución, es un método de análisis

principalmente de compuestos no volátiles (alto peso molecular, iones metálicos) o
termolábiles que se utiliza en gran variedad de industrias, medicina y medioambiente,
debido a su gran sensibilidad y determinación cuantitativa exacta.
En la industria médica y farmacéutica permite un análisis cualitativo y cuantitativo, en
el cual se analizan materias primas y productos terminados para asegurarse que la
calidad de los niveles previamente establecidos se cumpla. El método se basa en la
distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra móvil. En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye
a través de una columna que contiene a la fase fija. Su principal beneficio es que
resultados obtenidos son de una alta resolución y son fáciles de leer, y las pruebas se
reproducen con facilidad a través del proceso automatizado. Utiliza detectores del tipo
ultravioleta (UV), fluorescencia, índice de refracción (IR), detector electroquímico y
espectrofotómetro de masas.

IV BIBLIOGRAFÍA

- http://www.espectrometria.com/espectrometra_de_absorcin_atmica
- http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/ab482s04.htm
- http://www.ancap.com.uy/docs_concursos/ARCHIVOS/2%20LLAMADOS%20FI
NALIZADOS/2011/REF%2022_2011%20TECNICO%20LABORATORIO%20LU
BRICANTES/MATERIAL%20DE%20ESTUDIO/ESPECTROMETRIA.PDF
- https://es.wikipedia.org/wiki/Fotomultiplicador
- rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8252/3/T7Abasorc.doc
- http://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-
lquidos-hplc
- http://www.ehowenespanol.com/importancia-hplc-medicamentos-farmacias-
sobre_154094/
- http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/HPLC5_26122.pdf
- http://www.fing.edu.uy/iq/analisis/cursos/ainst/hplc.pdf
- http://shodexhplc.com/lessons/leccion-6-los-detectores-para-hplc/?lang=es
- http://pendientedemigracion.ucm.es/info/cvicente/reduca/7.pdf