残留溶剂检查

浙江省食品药品检验所
郑国钢
zgg0617@126.com
前言
„ 定义:残留溶剂系指在原料药或辅料的生产
中，以及在制剂制备过程中使用的，但在工艺
过程中未能完全去除的有机溶剂。
☆USP32版：药物原料、辅料或药物制剂的生产
过程中所用到的或形成的挥发性有机化学物质。
前言

„ 研究性质：杂质研究的范畴
方法学验证符合痕量分析要求
回收率
线性
精密度
…
前言

„ 残留溶剂的基本特征
‡特指有机挥发性化合物；
‡在药品生产过程中使用过；
‡在药品生产过程中应当去除而未除尽；
‡种类相对固定，ICH规定了69种；
‡在具体样品中具有不确定性；
‡残留量相对较低(痕量或微量范围)；
‡同一样品中不同溶剂的残留量相差较大。
前言
„ 研究指导原则:
¾ 国外主要相关指导原则:
ICH Q3c 杂质：残留溶剂的指导原则
¾ 国内主要相关指导原则:
化学药物残留溶剂研究的技术指导原则
残留溶剂研究基本内容
1、确定被测残留溶剂
2、确定残留溶剂类别
3、限度确立
4、确定测定方法
5、选择色谱柱和检测器
6、制备供试品和对照品溶液
7、测定条件的优化
8、方法学验证
9、质量标准建立
10、其他
1确定被测残留溶剂
„ 原料药
‰合成中使用溶剂引入
‰作为合成原料（无法用有关物质项下控制）
MMF合成中中吗啉乙醇
‰作为反应副产物引入
‰由其他合成原料或其他溶剂带入
„ 制剂
‰各种成份（原料药、辅料）带入（一般不要求）
‰制剂制备过程中引入（缓、控释微丸包衣过程使用
有机溶剂；难溶性药物固体分散 ）。
他克莫司溶于无水乙醇和二氯甲烷中分散
1确定被测残留溶剂

„ 现在研究集中在：原料药合成中使用溶剂
„ 影响因素：
‰有机溶剂在合成过程中使用的步骤；
‰后续步骤中使用的有机溶剂对之前使用的
溶剂的影响；
‰中间体（中间体的纯化方法、干燥条件）
（3步、1步等级）；
‰终产品精制方法和条件等。
1确定被测残留溶剂
„ 一般原则
(1) 工艺中使用二类以上和重结晶用溶剂，及根
据工艺特点要求其它溶剂进行残留量研究。
(2)建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行
研究。
„ 建议原则——仔细分析，别落下
(1)申报资料合成工艺中用到所有有机溶剂
(2)液态催化剂等
(3)趋势:胺类和羧酸类
2确定残留溶剂类别
☆残留溶剂分类
„ 风险分类（ICH有机溶剂分类）—订标准
„ 分析角度
‡ 沸点
高沸点：DMF、DMAC、DMSO、乙二醇、丙二醇、丙
三醇、甲酰胺、2－甲氧基乙醇、2－乙氧基乙醇、
（吡啶）
‡ 管能团—酸的、碱的、卤代的，含氮碱性化合物
‡ 溶解性
‡ 特殊品种：N-甲基吡咯烷酮、四氯化碳
„ 工艺角度：第几步，是否精制溶剂
2确定残留溶剂类别
„ICH有机溶剂分类
类别 毒性 PDE（mg/天）
1类溶剂 人体致癌物、疑为人体 0.1以下
致癌物或环境危害物 1,1,1—三氯乙烷外
2类溶剂 有非遗传致癌毒性或 0.5～50
其他不可逆毒性、或
其他严重的可逆毒性
3类溶剂 对人体低毒 ＞50
4类溶剂 没有足够毒性资料
2确定残留溶剂类别
1类溶剂
2确定残留溶剂类别
1类溶剂

当合成路线涉 合成化学发展水平 判断使用

及此类溶剂时 充分实践 是否合理

合理 严格控制残留量
临床研究前
不合理 替代研究 临床研究期间
产品上市后

☆不可避免使用，无论任何步骤使用，均需进行残留量测定
2确定残留溶剂类别

„2类溶剂
‡27种溶剂，浓度限度范围从50ppm（甲基丁
基酮）到3880ppm（环己烷）。
‡原则：考虑其毒性，建议控制使用。
‡应对合成过程中所使用的全部第二类溶剂进
行残留量研究，为最终制定合理可行的质量
标准提供数据支持。
2确定残留溶剂类别

„3类溶剂
原则：为低毒溶剂 ，建议可以使用。但
仍应该控制其量，使结果需符合药典相关
规定，尤其对在终产品精制过程中使用的
第3类溶剂必须进行残留量研究。
2确定残留溶剂类别
„4类溶剂(尚无足够毒性资料的溶剂)

（石油醚）
2确定残留溶剂类别
☆盐酸克林霉素棕榈酸酯举例
• 使用溶剂(６种):乙醇、丙酮(精制)、二氯甲烷、
三氯甲烷、吡啶与DMF。
• 分类:
9 测定方法确认：考虑DMF沸点较高，吡啶顶空条
件下检测灵敏度较低，故上述两种溶剂采用直接
进测定，其余溶剂采用顶空进样测定。
9 标准制定：按照ICH规定将二类有机溶剂二氯甲
烷、三氯甲烷、吡啶与DMF订入质量标准中，限
度参照ICH规定。同时将精制溶剂丙酮列入质量
标准中，限度为不得过0.1%。
3限度确立
„ 有机溶剂残留量表示方法
‡允许日接触量（PDE, mg/天）指某一有机溶剂被
允许摄入而不产生毒性的日平均最大剂量。
‡浓度限度：在PDE基础上为便于计算，引入了浓
度限度(％)表示方法。

浓度限度(％)＝PDE(mg/天)/(1000×剂量(g/天))
[药典附录限度中将剂量初步定为10g/天]
3限度确立
„ 两种表示方法在有机溶剂残留研究中均可行，以
PDE值来计算是更精确；而对于某一具体品种来
说，以浓度限度来计算更为简便。
„ 日使用总量不超过10g，就无需进一步计算；如日
使用量往往超过10g，则应对限度进行折算。
„ 无限度规定的有机溶剂（现一般参照3类）。
二甲苯:0.217%
(60%间二甲苯,14%对二甲苯,9%邻二甲苯,17%乙苯)
3限度确立
„ 多种有机溶剂综合影响
‡基本是控制每种溶剂的残留量不超过各自规定的浓
度限度（暂时没有考虑多种有机溶剂的综合影响）。
☆USP水平决定选择1：药物组分(药物原料、辅料)满足
表2中的浓度限度，每日剂量不超过10g；药品通过。
‡但当使用的溶剂很多或残留量较大，或每日摄取量
高于10g时，建议关注多种有机溶剂的综合影响。
☆ USP水平决定选择2：至少药品的一个浓度组分超过限
度值，或每日剂量超过10g，溶剂的每日摄取量(以组
分和计算)应低于PDE。
4确定测定方法
„ 测定方法
‡干燥失重：专属性差
‡GC法(普通)：首选方法
¾ 顶空进样法
¾ 直接进样法
‡HPLC法：测定吡啶
‡离子色谱法：测定N-甲基吡咯烷酮
‡气质联用
4确定测定方法

GC法
„ 选择进样方法
„ 选择定量方法
4确定测定方法

„ 选择进样方法
‡直接进样
¾ 适用范围：沸点高溶剂或受热不易分解样品
¾ 优点：简便、无需专用设备，绝对进样量大
¾ 缺点：污染进样口及柱子，溶剂峰响应大，样品
分解产物或溶剂杂质峰可能影响测定，对溶剂的
纯度要求高。
4确定测定方法
„ 选择进样方法
‡顶空进样
¾ 适用范围：沸点低溶剂或样品本身对测定有
影响。
¾ 优点：在较低温度下进行，避免组分分解；
减少溶解样品的溶剂量和样品本身对色谱系
统的干扰和污染，增加色谱柱的寿命。
¾ 缺点：需要特定的顶空进样装置，成本较
高，对沸点较高的溶剂检测灵敏度不够，一
般多应用于沸点100℃以下的溶剂。
4确定测定方法
„ 选择定量方法
‡外标法
‡内标法
‡标准加入法:利用加入该组分前后色谱峰响应
信号的变化而计算被测组分含量的方法
¾操作:测定供试品,测定供试品＋对照品
¾使用:边缘产品以标准加入法结果为准;
顶空方式基质效应。
5选择色谱柱和检测器
„ 色谱柱分类
‡填充柱和毛细管柱
‡毛细管柱
¾ WCOT或PLOT
¾ 极性大小（按固定液极性分类）
¾ 按内径分
¾ 液膜厚度
5选择色谱柱和检测器
填充柱 开管柱（毛细管柱）

WCOT

PLOT

填充柱 530系列柱 细孔径柱

柱长 (米) 0.5-10 5-100 5-100

I.D. (mm) 2-4 0.530 0.1-0.25

5选择色谱柱和检测器
‡填充柱和毛细管柱
¾ 填充柱
• 柱效低，分离复杂样品的能力差。
• 以直径为0.25～0.18mm的乙二烯苯-乙基乙
烯苯型高分子多孔小球或其他适宜的填料作
为固定相。
¾ 毛细管柱：柱效高，灵敏度高，分离好。
5选择色谱柱和检测器
‡毛细管柱—WCOT或PLOT
¾壁涂层毛细管柱(wall coated open tubular
column)：把固定液涂在毛细管内壁上(大部分) 。
¾多孔层毛细管柱(porous layer open tubular
column)：毛细管内壁上附着或沉积一层多孔固
体，然后再在多孔固体上涂以固定液。
• 增大表面积，不增加液膜厚度情况下加大涂渍量。
• 常用来分离各种气体及低沸点溶剂。
5选择色谱柱和检测器
‡毛细管柱—WCOT或PLOT
¾PLOT多孔固体
• 分子筛:气体,对水敏感;
• 二乙烯苯基(DVB):PLOT Q,C1-C3异构体分离，极
性化合物，能耐水
• 氧化铝： C1-C10异构体分离，对水敏感。

*毛细管柱法测定乙醇量(常量)
5选择色谱柱和检测器
‡毛细管柱—按固定液极性分类
¾ 极性柱:聚乙二醇 (PEG)
50％氰丙基-50％甲基聚硅氧烷(DB-23)
¾ 中极性柱
35%苯基-65%甲基聚硅氧烷(DB-35)
35%苯基-65%二甲基亚芳基聚硅氧烷(DB-35ms)
50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷
14%氰丙基苯基-86%二甲基聚硅氧烷
6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷
¾ 弱极性柱:5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷(DB-5)
¾ 非极性柱:100％的二甲基聚硅氧烷（DB-1）
 5选择色谱柱和检测器
‡聚乙二醇 (PEG)
PEG柱 表面活性 极性 特点
HP-20M 中性 最低 非键合非交联，淘汰
Wax 中性 居中 键合交联,最低温度下限使用温
20～256/260℃,分析低沸点化合物
INNOWax 中性 最高 键合交联,低流失,最高温度上限
40～260/270℃,分析高沸点化合物
FFAP 酸性 — 键合交联,专为分析酸,尤其专门用
硝基对苯二 于挥发性脂肪酸和酚类分析
甲酸改性

CAM 碱性 — 非键合交联,对胺类有选择性(伯胺
有较好峰型 )
Wax和INNOWax在某些化合物如醇上分离有区别,如二氯甲烷与乙醇
5选择色谱柱和检测器
‡毛细管柱—按按内径分类
¾ 小口径毛细管柱：
• 常见规格0.25mm、0.32mm
• 载气柱流速：1.0～3.0ml/min
¾ 大口径厚膜毛细管柱
• 常见规格0.53mm，1μm～5μm厚液膜。
• 载气柱流速：3.0～5.0ml/min
• 可用于代替填充柱使用。
• 牺牲部分柱效来增加柱容量、提高流量。
5选择色谱柱和检测器
‡毛细管柱—按液膜厚度分类
¾ 薄膜比厚膜洗脱组分快，峰分离好、温度低，适用
高沸点、组分密集或热敏化合物。
¾ 大口径柱保持分离度和保留时间，都只有厚膜。
¾ 0.1～0.2µm 薄膜和0.25～0.5µm 标准膜适用高沸
点化合物。
¾ 1.0～1.5µm厚膜:测定适合流出温度100～200℃。
¾ 3～5µm 超厚膜：分析气体、溶剂和可吹扫出来的
物质。
5选择色谱柱和检测器
„ 选择合适色谱柱
‡样品与待测溶剂按照相似相溶原理选择色谱
‡非极性柱:各组分按沸点顺序流出色谱柱，沸
点低者先出。若试样中有极性组分，相同沸点
的极性组分先出峰。
‡中等极性柱:各组分基本仍按沸点顺序流出色
谱柱，沸点低者先出。但沸点相同极性与非极
性组分，极性组分后出峰。
5选择色谱柱和检测器

„ 选择合适色谱柱
‡极性柱:各组分按极性顺序流出色谱柱，极性
低者先出。
‡注意:混合物中组分性质差别，如分离极性与
非极性混合物，一般选用极性柱。分离沸点差
异较大的混合物，一般选用非极性柱。
5选择色谱柱和检测器

„ 选择合适色谱柱
‡测定含氮的碱性有机溶剂时，通常采用弱极性
色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮的碱性
有机溶剂，如果采用胺分析专用柱。
5选择色谱柱和检测器

„ 选择合适色谱柱
‡根据经验顺序选择
¾ ChP2005中 100％的二甲基聚硅氧烷和聚乙二醇
¾ EP DB-624和Innowax
¾ 仪器商手册。如：Agilent产品目录提供DB-1、
DB-624和DB-Wax的出峰顺序。
非极性色谱柱系统程序升温法测定有机溶剂标准物质混合物
色谱柱：SPB-1柱（30m×0.32mm×1.0μm）

ChP2005附录标准图谱
极性色谱柱系统程序升温法测定有机溶剂标准物质混合物
色谱柱：HP-FFAP柱（25m×0.32mm×0.52μm）

ChP2005附录标准图谱
USP固定相（26种）
USP 固定相组成 推荐
G1 二甲基聚硅氧烷油 DB-1
G2 二甲基聚硅氧烷胶 DB-1
G3 50% 苯基-50%甲基聚硅氧烷 HP-50+
G5 3-氰丙基聚硅氧烷 DB-23
G6 三氟丙基甲基聚硅氧烷 DB-210
G7 50%氰丙基聚硅氧烷-50％苯甲基硅氧烷 DB-225
G14 聚乙二醇（平均分子量950-1050） Wax
G15 聚乙二醇（平均分子量3000-3700） Wax
G16 聚乙二醇（平均分子量15000） Wax
USP固定相
USP 固定相组成 推荐
G19 25%苯基-25％氰丙基甲基硅氧烷 DB-225
G20 聚乙二醇（分子量380-420） Wax
G25 聚乙二醇TPA(20M对苯二甲酸) FFAP
G27 5％苯基-95%甲基聚硅氧烷 DB-5
G28 25％苯基-75%甲基聚硅氧烷 DB-35
G32 20％苯甲基-80%二甲基聚硅氧烷 DB-35
G35 聚乙二醇硝基对苯二甲酸酯双环氧化物 FFAP
G36 1%乙烯基-5％苯甲基聚硅氧烷 DB-5
G38 G1固定相，加拖尾抑制剂 DB-1
USP固定相
USP 固定相组成 推荐
G36 1%乙烯基-5％苯甲基聚硅氧烷 DB-5
G38 G1固定相，加拖尾抑制剂 DB-1
G39 聚乙二醇（平均分子量1500） Wax
G41 苯甲基二甲基聚硅氧烷(10％苯取代) DB-5
G42 35％苯基-65％二甲基乙烯基硅烷 DB-35
G43 6％氰丙基苯-94％二甲基聚硅氧烷 1301 624
G45 二乙烯基苯-乙二醇-二丙烯酸酯 PLOT U
G46 14％氰丙基苯基-86％甲基聚硅氧烷 DB-1701
5选择色谱柱和检测器

„如何提高柱效和分离度(毛细管柱)
1.使用内径更小的柱子。
2. 减小固定相百分组成或固定相液膜厚度。
3.减小进样量。
4.选用更长的柱子。
5.使用程序升温改善后流出组分峰形。
5选择色谱柱和检测器

„色谱柱保存
‡保存柱子切勿划伤。划伤后的柱子可能由于高
温加热而足以使之从划痕处断裂。
‡堵上柱子两端以保护柱子中的固定液不被氧气
和其它污染物所污染。
5选择色谱柱和检测器

„ 检测器的选择
‡FID
‡ECD
‡NPD
‡TCD
5选择色谱柱和检测器
„检测器的选择
检测器 样品类型 灵敏度范围 气体流量 (mL/min.)
载气+尾吹气 氢气 空气
FID 碳氢化合物 10-100pg 20-60 30-40 200- 500
TCD 除载气外的 5-100ng 15-30 n.a n.a.
其它所有物质
ECD 有机卤化物 0.05-1pg 30-60 n.a. n.a.
氯化溶剂 50 ppt-1ppm
&农药残留

NPD 有机氮化合物& 0.1-10 pg 20-40 1-5 70-100

有机磷化合物
5选择色谱柱和检测器

‡FID
¾ 是一种高灵敏度、线性范围广、适用于含碳有
机物分析的质量型检测器。
¾ 工作原理：当有机物进入氢火焰时发生离解，
生成正负离子；然后对在电场作用下的定向离
子流进行检测。
¾ 特点：灵敏度高，通用，线性范围宽，但检测
时样品被破坏，一般只能测定含碳化合物。
¾ N2：H2：Air=1：1~1.5：10
 氢火焰离子化检测FID
CO H0
2
+ 2 CHO +
CHO
H0 + CO
2 CHO 2
+ +
CO
CHO CHO
FID是一个破坏性、质量型检测器。
2
H0
2 火焰中生成大量碳正离子，被收集
H0
2 计算后形成检测器信号。含低氧化
态的碳数目最多的被分析物将会产
H H 生最大信号。
2 2
H
CH
4
H
特点：高灵敏度，比TCD高100～
2 2

H
CH 4
H
10000倍；线性范围宽；尤适于配合
2 CH
4 2
毛细管色谱柱进行快速痕量检测。
H CH H
2 4 2

H CH H
色谱柱
2 4 2
H CH
4 H
喷
2
2
嘴

<150ºC，无法点燃检测器,温度应高于炉温20ºC
氢火焰离子化检测器FID示意图

FID 检测器
空气 组件
入口

毛细管柱末端位置
(距喷嘴顶端1-2 mm) 喷嘴
H2 入口
+
尾吹气

柱末端
 FID响应

苯
10

醇 醇
8

已
醇
丁
酸
相对 6

醇
响应

乙
酸
丙
4
(by wt.)

醇
酸

甲
乙
2
酸
甲

H H H H H H H

H C OH H C C OH H C C C C OH

H H H H H H H

甲醇 乙醇 丁醇

响应值与化合物中含有的碳-氢键个数成正比
 对FID没有响应的物质

稀有气体 NH 3 CS2
氮的氧化物 H2 COS
卤化硅 CO O2
H2 O CO 2 N2
杂环化合物 HCOH HCOOH
5选择色谱柱和检测器
‡ECD
¾ 高灵敏度、高选择性检测器。只对含电负性
强的元素化合物如含卤素、硫、氮、羰基、
氰基等的化合物有响应。特别适合含卤素的
组分的测定，如：三氯甲烷、四氯化碳（必
须）。
¾ 可用氮气或氩气作载气，若含少量氧气或水
等电负性成分,对检测器的基线和响应值会有
很大的影响,可用脱氧管等除去。
¾ 检测室温度：高于柱温30℃
5选择色谱柱和检测器

‡TCD
¾ 基于各种物质有不同的导热系数原理而设
计。它是浓度型的总体性质，即通用检测
器。
 热导池检测器TCD
TCD是一个非破坏性的浓度型
检测器。
载气通过热灯丝时带走一定
热量使之冷却。

气流

当载气中携带有样品时，冷却的量会
发生变化。这个差异就被用来做检测
器的信号。
5选择色谱柱和检测器

‡NPD
¾ 高灵敏度、高选择性的检测器。
¾ 特点：在FID的喷嘴和收集极之间放置一个含
有硅酸铷的玻璃珠。这样含氮磷化合物受热分
解在铷珠的作用下会产生多量电子， 使信号
值比没有铷珠时大大增加，因而提高了检测器
的灵敏度。
¾ 范围：用于微量氮磷化合物分析。
6制备供试品和对照品溶液
„ 溶剂选择要求
‡能同时溶解供试品和待检残留溶剂；当样
品在溶解介质中未完全溶解时，结果通常
偏低且精密度差。
‡溶剂自身及其杂质不干扰待检残留溶剂的
测定；DMSO、DMF
‡和待检残留溶剂保持相对稳定；
‡避免使用污染性大、毒性大的溶剂。
‡水是首选溶剂，特别是顶空进样系统。
6制备供试品和对照品溶液
„ 溶剂的选择
‡水溶性药物：水
‡非水溶性药物：不挥发的酸、碱液；DMF或
DMSO等，不可使用盐酸液和氨水。
‡可以单独使用，也可以混合使用
‡顶空进样可选择在80~90℃加热能溶解样品
的溶剂。
6制备供试品和对照品溶液
„ 样品的制备
¾ 不可研磨样品，必须原态取样；
¾ 不可超声、不能加热溶解样品（直接进样
法）；
¾ 样品置顶空瓶中压盖后可以超声、加热；
¾ 测定酯类溶剂时不能采用酸或碱溶液，以
免发生水解 。
6制备供试品和对照品溶液
„ 样品的制备
¾ 测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不
呈酸性，以免被测物与酸反应不易汽化；
¾ 测定含羧基的酸性溶剂时，供试品溶液应
不呈碱性，以免被测物与碱反应不易汽化。
• 如：测定氟伐他汀钠(pH8.0～10.0)中乙酸
残留量，不出峰，需对其甲酯化后测定。
6制备供试品和对照品溶液

„ 对照品溶液的制备
‡对照品溶液：必须与供试品溶液相同溶剂。
‡苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶
剂，可先用少量DMF等溶解待查溶剂，再用
水稀释。
☆2010版新增：…采用与制备供试品溶液相同的溶
剂制备对照品溶液。如用水作溶剂，应先将待测
有机溶剂溶解在50％二甲亚砜或N,N-二甲基甲酰
胺溶液中，再用水逐步稀释。
6制备供试品和对照品溶液

„ 供试品和对照品溶液浓度确定
‡根据残留溶剂的限度规定配制供试品溶
液，浓度应能满足系统定量测定的需要
‡一般供试品取样量为0.1～1g
¾ 限度试验：对照品溶液的浓度可按残留溶
剂规定的限度配置；
¾ 定量测定：按实际残留量配置，浓度相差
最好不超过2倍为宜。必要时应重新调整 。
6制备供试品和对照品溶液
„ 顶空进样基质效应
¾ 顶空气体中单个组分的含量既与其本身的挥发
性有关，又与样品基质有关。特别是那些在样
品基质中溶解度大（分配系数大）的组分，基
质效应更为明显。
¾ 标准溶液必须有与原样品相同或相似的基
质，否则可能导致定量误差将会很大。
¾ 标准加入法可以有效地排除基质效应的影响；
当标准加入法结果与内标法结果系统偏差约
10%时，可以认为方法存在明显的基质效应。
6制备供试品和对照品溶液
☆盐酸克林霉素棕榈酸酯举例
• 直接进样(吡啶与DMF):样品在甲醇和乙醇中溶
解性均较好，考虑在极性柱中甲醇出峰较快，
干扰较少，故采用甲醇为溶解样品的溶剂。
• 顶空进样:样品在水中溶解性较好，故首选。同
时考虑三氯甲烷在水中溶解性较差，最后采用
5%DMF水溶液作为顶空测定溶解样品溶剂。
7测定条件的优化

„ 顶空条件优化
„ 柱温优化
„ 进样口温度优化
„ 进样衬管
„ 气路优化
7测定条件的优化

„ 顶空条件优化
‡对照品与供试品溶液必须使用相同顶空条件
‡平衡温度
¾ 与蒸气压直接相关，影响分配系数。
温度越高，蒸气压越高，顶空气体的浓度
越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越
低，对温度越敏感。
7测定条件的优化

„ 顶空条件优化
‡平衡温度
¾ 对沸点较高残留溶剂，必须较高的顶空温度，
兼顾供试品热分解，避免产生挥发性热分解产
物干扰。
¾ 溶剂的沸点，一般应比溶解用溶剂沸点低10℃
以上。在灵敏度能满足的条件下，尽量采用较
低的平衡温度。
7测定条件的优化
‡平衡温度

☆水中溶解性越好,平衡温度越敏感。
7测定条件的优化
„ 顶空条件优化
‡常用平衡温度
¾ 水：顶空温度不宜超过85℃
EP/USP规定为80℃
顶空温度为100℃(柱温低于顶空温度)，大量的水被蒸
发,随着水蒸汽的凝结，水中溶解度大溶剂灵敏度明显下
降(如:乙腈)
¾ DMSO/DMF：顶空温度不宜超过115℃
EP/USP规定为105℃。
7测定条件的优化
„ 顶空条件优化
‡平衡时间
¾ 取决于组分分子从样品基质到气相的扩散速度。
扩散速度越快所需时间越短。扩散系数与分子
大小、介质黏度及温度有关。温度越高，黏度
越低，扩散系数越大。提高温度可以缩短平衡
时间。
¾ 顶空时间一般15～45min(药典30～45min)。
• 过长可能引起顶空瓶的气密性变差。
• 过短不能保证气-液两相达到平衡。
7测定条件的优化
‡顶空进样提高灵敏度方法
¾ 盐析作用(基质效应)
• 在水溶液中 加入无机盐（如无水硫酸钠）来
改变挥发性组分的分配系数。
• 但当盐浓度小于5%时几乎没有作用，故常用
高浓度(甚至饱和)。
• 盐析作用对极性组分的影响大于非极性组分的
影响。
• 在水溶液中加入盐之后，溶液体积会变化，定
量线性范围可能变窄。
7测定条件的优化
‡顶空进样提高灵敏度方法
¾ 有机溶液中加入水：水要与有机溶剂相溶，
减少有机物在有机溶剂中的溶解度，增大其
在顶空气体的含量。
☆氯仿在DMF顶空法中由于二者结合能力强，
致使其检测灵敏度降低，当加入等量的水
后，检测灵敏度显著增加。即使加水后样品
重新析出，不影响氯仿从样品中转移至溶剂
中的转移率（必须经回收考察）。
7测定条件的优化
‡顶空进样提高灵敏度方法
¾ 调节溶液的pH：对于碱和酸，通过控制pH
可使其解离度改变，或使其待测物的挥发性
变的更大，从而有利于分析。
7测定条件的优化
„ 柱温优化
‡提高柱温：各组分的挥发加快，分配系数减
少，不利于分离。
‡降低柱温：各组分在两相中的传质速度下
降，使峰形扩张，甚至引起拖尾，延长分析
时间。
‡选择原则：在使难分离物质能得到良好的分
离、分析时间适宜、峰形不拖尾的前提下，
尽量采用低柱温。
‡注意：不得超过色谱柱的最高使用温度
7测定条件的优化
„ 柱温优化
‡对于一个分析样品, 各组分都有一个最佳柱温
¾ 填充柱: 约在组分的沸点左右；
¾ 毛细管柱: 约比沸点低50℃左右。
‡当样品组分较少,且极性、沸点差异较小时, 一般采
用恒温操作。当样品组分较多,而且极性、沸点(组
分最高、低沸点差大于80~100℃, 需程序升温)差
异较大时,可选择程序升温法。

‡程序升温:冷阱
7测定条件的优化

„ 进样口温度优化
‡由待测组分挥发性、沸点、稳定性、进样量
决定。一般应高于组分沸点保证迅速气化。
‡ 测定热不稳定的样品时要降低进样口温度以
免样品分解。
‡对挥发性不好的样品则要增加进样口温度使
其完全气化。
7测定条件的优化
„ 进样衬管处理
‡市售玻璃衬管上硅羟基(Si-OH) 已DMCS（二甲
基氯硅烷）硅烷化去活化处理。
‡不能用洗液浸泡(导致脱活层溶解),对直接进样或
分析有极性化合物时影响较大。
‡更换玻璃棉时注意工具将衬管内壁表层划伤。
7测定条件的优化
„ 进样衬管处理(此部件须非常清洁)
‡ 试验室常规的未去活性的衬管清洗步骤：
1移去玻璃毛
2在溶剂或酸液中超声处理
3清洗并干燥
4更换去活性的玻璃毛
5硅烷化去活性(可从柱供应商处获取硅烷化试剂)
6干燥
‡ 工厂去活性衬清洗步骤管
1移去玻璃毛
2在溶剂中超声处理
3干燥
4精心处理避免划伤衬管的内表面。
7测定条件的优化
„ 进样衬管处理
‡衬管容积（Agilent 5187：870μl）
‡进样气化体积必须小于衬管容积，如大于
衬管容积导致反冲隔垫吹扫和分流排放
口，影响重复性和灵敏度。
‡体积膨胀系数
溶剂 250℃膨胀系数
水 1261:1
甲醇 563:1
二氯甲烷 356:1
乙酸乙酯 233:1
7测定条件的优化

„气路优化
‡载气流速
¾考虑毛细管柱内径大小；
¾考虑载气性质
•重载气（氮气、氩气）有利于降低纵向扩散；
•轻载气（氢气、氦气）有利于降低气相的传质阻
力。TCD应用轻载气。
¾流速对柱效、保留时间和检测器响应均有影响。
稳定性）在GC分析中非常重要。
7测定条件的优化
„气路优化
可使用下列推荐值来确定不同类型柱的最佳流量
填充柱
内径 流量(ml/min) 线速度(cm/sec)
1/4“ 50-60 2.6-3.2
1/8“ 20-30 4.2-6.3
毛细管柱
0.53(大孔径) 3-5 22-38
0.32mm(粗径) 1-3 20-41
0.20mm(细径) 0.5-1 21-32
0.10mm(快速) 0.2-0.5 42-106
7测定条件的优化
„气路优化 吹扫气
‡进样分流比选择
载气
¾作用:毛细管柱载气流量比填
分流气
充柱低，样品从气化室冲洗到
色谱柱需要较长时间，导致进
样器内色谱区带扩张。常规进
样方式，无法控制小进样量，
故需分流进样。
¾比列:直接进样10:1以上,顶
空可不分流,常用1:1。
7测定条件的优化

„气路优化
‡尾吹气路调节
¾毛细管柱载气体积流量很小，进入检测器后发生
突然减速，引起色谱峰扩张,为减少谱带扩展，同
时调节氢氮比达到1左右,提高FID灵敏度，在色谱
柱出口增加辅助尾吹气。
¾常用:35～45ml/min
 载气种类对柱效和分离度的影响
HETP
(mm) 氮气 氦气 氢气
1.2 N2

1.0
.8 He

.6
H2
.4

.2

10 20 30 40 50 60 70 80 90

平均线速度 (cm/sec) R = 1.17 R = 1.37

25 m x 0.25 mm x 0.4 um 载气种类 n-十七烷和姥鲛
OV-101 WCOT 柱效曲线 烷分离度影响(58cm/sec)
8方法学验证
总则：
首先明确将其归为定量检查或限度检查
验证内容
„ 系统适用性
„ 专属性
„ 准确度（回收率）
„ 线性
„ 灵敏度（检测限、定量限 ）
„ 耐用性
8方法学验证
„系统适用性
‡柱效
¾填充柱法的理论板数应大于1000。
¾毛细管色谱柱的理论板数应大于5000。
‡重复性
¾内标法：对照品溶液连续进样5次，所得被
测物与内标物峰面积之比RSD≤5%。
¾外标法：所得被测物峰面积RSD≤10%。
8方法学验证

„ 专属性
¾ 对各种残留溶剂定位和进行混合溶剂的分离
度试验。
¾ 考察溶解溶剂、可能残留其他溶剂、主成分、
其他杂质等对测定溶剂是否干扰。
¾ 各组分色谱峰与其相邻色谱峰的 分离度应大
于1.5 。
¾ 使用ECD进行分离度试验应考虑非卤代烃！
8方法学验证

„ 专属性验证中干扰确定和排除
‡共出峰干扰
‡热降解干扰
‡溶剂介质干扰
8方法学验证

‡共出峰干扰
¾ 共出峰：在相同的色谱条件下具有相同保
留值的组分不一定是同一物质。不同的物
质在某一色谱条件下具有相同保留值。
¾ 排除：对测定不符合规定残留溶剂，采用
极性不同的色谱系统进行验证，排除共出
峰干扰（双系统）。
吡柔比星中正己烷共出峰的排除

样品批号
色谱柱 A B C
DB-624 5.45% 6.21% 4.79%
SPB-1 0.57% 0.63% 0.58%

☆不同物质（极性或氢键形成能力等）在不同极
性色谱柱中具有完全相同保留行为几率很小。
8方法学验证
‡热降解干扰
¾ 顶空法测定残留溶剂时，如药品对热不稳
定，则可能会在顶空加热过程中发生热降
解，降解产物可能与待测有机溶剂共出
锋，或就是某种有机溶剂，导致把降解产
物当作残留溶剂检测。
¾ 改变顶空温度可以确定顶空条件下样品是
否能产生热降解干扰物。
¾ 分子结构中有烷氧基的药品可能热解产生
相应的醇。
8方法学验证
„ 专属性验证中干扰峰(未知峰)确认
‡RRT法（2005版药典）
使用SPB-1和HP-FFAP毛细管柱，测定未知峰
相对于丁酮相对保留时间(RRT)选择出数据相近
（相对误差＜5%）；两个系统中均出现的有机溶
剂即可初步判定为药品中可能存在的残留溶剂。
‡调整相对保留时间法（RART）
2010版药典
‡GC-MS法
对确认的物质还需双系统进一步的确认。
8方法学验证
„ 专属性验证中干扰峰(未知峰)确认—RART法
‡RRT法:当色谱柱膜厚或口径改变, RRT值没
有可比性。
„ RART法:扣除t0影响,只受柱温和固定相性质
的影响。
RART= [tR-t0]/[tR (丁酮)- t0]
[tR 为组分的保留时间]
[甲烷测定色谱系统的死体积（t0）]
8方法学验证

„ 专属性验证—未知有机挥发物
检测时，有时可能会出现一些未知的色
谱峰，建议对这些未知色谱峰尽量进行定
性研究，并进行定量控制。有时候定性研
究是比较困难的，建议可参考对未知杂质
限量控制的方法，控制未知有机挥发物的
总限度。
8方法学验证

„ 准确度（回收率）
‡考察检测结果是否能够代表产品的实际情况。
‡规定范围内，至少9个测定结果，设计三个不同
浓度进行测定，计算回收率和相对标准偏差。
‡采用标准加入法验证。
‡范围：QL附近、限度浓度、150%限度浓度
☆可接受标准：80～120%（98.0～102.0%）
RSD≤10%(2.0%)(n=9)
8方法学验证

„ 准确度（回收率）
‡当方法回收率超出80～120%时，提示溶解介
质不宜作为该药品残留溶剂测定的溶剂，应改
换其它介质重新实验。
8方法学验证
线性一般要求5个浓度以上
☆可接受标准(常量):R≥0.990(0.998),Y轴截距在
100％响应值25%(2%)以内,响应因子RSD≤10%(2.0%)。
8方法学验证

„ 灵敏度
‡检测限DL：考察能否将残留的少量或微量的
有机溶剂检出，信噪比3：1或2：1时相应浓
度或注入仪器的量 。
‡定量限QL：考察能否将残留的少量或微量的
有机溶剂定量检出，为信噪比10：1时相应
浓度或注入仪器的量 。
☆盐酸克林霉素棕榈酸酯直接进样方法验证资料
（1）溶剂的选择
（2）仪器
（3）色谱条件
（4）专属性试验
定位
空白溶剂试验
顶空测定残留溶剂干扰试验
（5）精密度试验
（6）线性试验
（7）回收率试验 :20%、100%、150%
（8）最低检测量
（9）样品中吡啶和DMF残留量测定
（10）讨论：未知峰
（11）结论
9质量标准建立
质量标准制定一般原则及阶段性要求
实验室规模生产 工艺放大 中试、工业化生产
工艺 规模工艺
样品 样品
临床前研究 临床期间研究
制订 制订
修 订
临床用质量标准 试行标准
修订
正式标准
9质量标准建立

„ 第1类溶剂
‡均需订入标准
‡1，1，1－三氯乙烷可参照第二类溶剂要求
‡第1类溶剂替代研究会在临床研究前、临床研
究期间、产品上市后等不同阶段进行，质量标
准需随替代研究结果的不断进行而修订。
9质量标准建立

„ 第2类溶剂：
‡临床用质量标准：订入质量标准。
‡生产用质量标准：根据临床期间研究结果
进一步修订，无残留可不订入标准， 有残
留订入质量标准 。
‡试行、正式标准：根据多批中试和工业化
生产规模产品研究结果，在临床用质量标
准基础上完善、修订后形成。
9质量标准建立

„ 第3类溶剂：
‡临床用质量标准：根据临床研究结果，需
将有残留或精制溶剂订入标准。
‡试行/正式标准：根据多批中试和工业化生
产规模研究结果，在临床用质量标准基础
上进一步完善、修订后形成。
9质量标准建立

„ 建议：
‡第一类溶剂：无论任何步骤使用，均需进
行检测。
‡第二类溶剂：无论任何步骤使用，均需进
行检测。
‡第三类溶剂：建议进行研究，对用于最终
产品精制的此类溶剂必需进行检测。
9质量标准建立

„ 第4类溶剂
‡若结构与毒性大的溶剂非常接近，建议尽量不
使用。
‡注意中间体的处理，尽量除尽。
‡根据结构和理化性质，参考其他的有机溶剂的
检测方法进行检测和控制。
‡注意检测图谱中未知峰的情况，尽量进行归
属，若无法归属，可以控制挥发性杂质总量。
9质量标准建立

„ 若国家标准中未控制残留溶剂，建议根据
起始原料的制备工艺，对可能存在的残
留溶剂一并在终产品中进行控制。
„ 如果采用尚未批准的原料药、化工中间体
等作为起始原料，建议根据起始原料的制
备工艺，对可能存在的残留溶剂一并在终
产品中进行控制。
9质量标准建立

„ 附录中无限度规定和未收载的有机溶剂:
如在药物的制备过程中使用到了这类溶剂，
建议药物研发者尽量检索有关的毒性等研
究资料，关注其对临床用药安全性和药物
质量的影响。
10其他
2010版药典安全性：残留溶剂

第一步 第二步 第三步

同品种 凡例 同品种 凡例 所有品种

明确溶剂 所有溶剂 所有溶剂
附录

„凡例：…除已明确列有“残留溶剂”检查的正文品种必须依
法进行该项检查外，其他未在“残留溶剂”项下明确列出的有
机溶剂与未在标准中列有此项检查的品种，如生产过程中引
入或产品中残留有机溶剂，均应按本版药典附录“残留溶剂
测定法”检查并应符合相应溶剂的限度规定。
10其他
大孔吸附树脂残留量控制及检查
„ 对于大孔吸附树脂残留物的控制，应关注树脂质量、
树脂处理，并建立经树脂处理后的原料或中间体、
制剂的残留物测定方法与限度标准等。
„ 化药大孔吸附树脂残留物检查项目暂订为：苯（＜
2ppm）、甲苯（＜890ppm）、二甲苯（＜
2170ppm）、苯乙烯、烷烃类、二乙基苯类（二乙
烯基）及树脂残留物总量检查；其限量不能高于国
家标准或国际通用标准。
„ 中药对残留物的限量要求，苯、甲苯、二甲苯、苯
乙烯、烷烃类、二乙基苯类（二乙烯基）等残留物
的限度定为苯小于2ppm、其他小于20ppm。
„ 制订合理的限量（新药可仅控制原料），并列入质量
标准正文。
EP残留量测定介绍
„样品制备
‡根据样品的溶解性选择合适的溶剂
¾水溶性样品用水作溶剂，非水溶性样品用二甲基
甲酰胺作溶剂。
¾测定DMA或DMAC用1、3-dimethyl-2-dimethyl-
2-imidazolidinone(DMI)作溶剂。
• 供试液制备： 取0.2g样品，用上述溶剂溶解，稀
释至20ml。
• 测定溶液: 取供试液5.0ml，加1.0ml空白溶剂。
EP残留量测定介绍
„ 对照溶液的制备
‡对照储备液：取待测溶剂，溶于适量二甲亚砜
中，加水稀释至100ml，取适量用水稀释至一
定浓度。
‡测试用对照溶液：取样品溶液5.0ml，置顶空
瓶中，加1.0ml对照储备液，加盖，密封。
EP残留量测定介绍
„顶空进样器参数
参数 1 2 3
平衡温度（℃） 80 105 80
平衡时间（min) 60 45 45
转移管温度（℃） 85 110 105
加压时间（s） 30 30 30
进样体积（ml） 1 1 1
EP残留量测定介绍
„ 系统A
‡色谱柱：30m×0.32（0.53）mm×1.8（3.0）
μm 6%氰丙基苯-94％二甲基聚硅氧烷（HP-
624）
‡载气：N2 或He 线速度:35cm/s
‡ 分流比：5：1
‡进样口温度：140℃ 检测器温度：250℃
‡柱温：40℃（20min），20 ℃/min升温至240
℃，维持20min。
‡系统要求：乙腈与二氯甲烷的分离度>1.0，信噪
比：>5, RSD<15%
系统A-1类溶剂
系统A-2类溶剂
EP残留量测定介绍
„系统B
‡色谱柱：30m×0.32（0.53）mm×0.25μm 固
定液macrogol 20，000（HP-Wax）
‡载气：N2 或He 线速度:35cm/s
‡ 分流比：5：1
‡进样口温度：140℃ 检测器温度：FID 250℃
‡柱温：50℃（20min），6 ℃/min升温至165
℃，维持20min。
‡系统要求：乙腈与三氯乙烯的分离度>1.0，信
噪比：>5，RSD<15%
系统B-1类溶剂
系统B-2类溶剂
EP残留量测定介绍

„ 结果判断
‡测定溶液色谱峰面积小于对照溶液峰面积的50
％，结果符合规定。
‡如需定量测定，可采用标准加入法测定。
USP残留量测定介绍
„1类2类残留溶剂
–方法A-定性检测Identification and
Limit Test
–方法B-确认检测Confirmatory Test
–方法C-定量检测Quantitative Test
„3类溶剂：
–检测限（LOD）,必要可使用GC分析，在某些
情况下, 可以检查干燥失重。
USP残留量测定介绍

‡两种方法的原理
9 方法A和B是正交处理方法。
9 在两种方法中都有共流出现象，但是方法A中
的共流出峰在方法B中得到了解决，反之亦然。
9 最终通过方法C进行定量分析。
USP:方法A
操作条件
水溶性物质方法A的制备
方法A系统适用性
方法A- 1类溶剂
方法A- 二类溶剂，混合液A
方法A- 二类溶剂，混合液B
方法A- 3类溶剂
方法B
方法B
方法B：系统适用性
方法B－1类
方法B-2类
方法B-2类
方法B-3类溶剂
方法C
方法C

与方法A相同再加上：
‡标准溶液:
在方法A和B中已定性的峰用USP溶剂标准品来稀释
‡增敏溶液
供试品与标准品的混合液
方法C:系统适用性

‡1类标准溶液
–信噪比S/N: 1,1,1 –三氯乙烷>5
‡1类系统适用性溶液
–信噪比S/N: 所有的峰>3
‡2类Mixture A Standard Solution
–分离度: 乙腈与二氯甲烷>1.0

如果用方法B的话，按照它的系统适用性要求。
方法C:计算

计算每个残留溶剂的量
ppm=5(C/W)[ru/(rst-ru)]

C=浓度,ppm,标准溶液的相关美国对照品浓度
W=质量,g,为供试品贮备液中供试品的重量
r=供试品溶液的残留溶剂的峰响应
rst=加入标准溶液供试品溶液的残留溶剂的峰响应
非水溶性物质检测准备
„ 方法A和B
‡供试品溶液储备液:转移500mg的待测物质,精确称
取,至一个10ml量瓶,用二甲基甲酰胺稀释至刻
度，混匀。
‡供试品溶液:转移供试品储备液1.0ml至一合适的
顶空进样瓶中，包含有5.0ml的水，加塞，压盖，
混匀。
„ 方法C
‡增敏溶液:转移1.0ml供试品储备液到一合适的顶
空进样瓶中，再加入1ml的标准储备液和4.0ml的
水，加塞，压盖，混匀(制备在方法A和方法B中已
经定性的各峰的增敏溶液)
可选的方法
„ USP-NF总要求: 也可选用别的在准确度、
灵敏度、精密度、选择性或适用性方面有一定
优势的方法，以满足自动化或减少数据处理或
其它特殊的要求。这种方法应该得到验证……
当出现不同或争议时，只有按药典方法获得的
结果为决定性结果

USP-NF:General Chapter <1225>

谢谢大家！