FACULTAD DE

BROMATOLOGÍA Y NUTRICIÓN
ESCUELA DE BROMATOLOGÍA Y NUTRICIÓN

CURSO

ANALISIS POR INSTRUMENTACIÓN

TEMA

PRINCIPALES METODOS DE MACRO Y

MICRONUTRIENTES EN ALIMENTOS

ALUMNA

TORRES CENDER STEPHANNY SAOURI

DOCENTE

Lic. Mejía Domínguez Cecilia

HUACHO, 2018
 PRINCIPALES MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
PROTEÍNA EN ALIMENTOS
I. Fundamentos Teóricos

Las razones para su determinación son las siguientes:

- Las proteínas son un grupo de biopolímeros constituidos de aminoácidos que exhiben

una amplia gama de estructuras y funciones.
- Las proteínas tienen un grande valor comercial al enriquecer los productos
alimentarios.
- Mayor contenido de proteínas en un producto beneficia en la demanda de su venta.
- Contribuye a la necesidad de la población.

II. Principales métodos

Métodos no extractivos

- Método Kjeldahl
- Determinación de Nitrógeno básico volátil- Índice de putrefacción
- Determinación de Nitrógeno no proteico
- Determinación de nitrógeno álcali lábil.

Métodos extractivos colorimétricos

- Absorción a 280 nm
- Método de Biuret
- Método de Bradford
- Método de Lowry
- Determinación de Nitrógeno amínico: Método de Sorensen
- Determinación de aminoácidos aromáticos: método de Hull

2.1. Método Kjeldahl

Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintas

Directivas Comunitarias.

FUNDAMENTO

Involucra la conversión del nitrógeno presente a sulfato de amonio por digestión, destrucción
oxidativa o mineralización con ácido sulfúrico. Posteriormente el sulfato de amonio se
descompone por alcalinización con hidróxido de sodio y destilación del amoníaco liberado
captándolo en una solución ácida.

El ácido sulfúrico oxida la materia orgánica y se combina con el amonio formado, los
elementos carbono e hidrógeno se convierten en dióxido de carbono y agua.

Durante la digestión se libera el nitrógeno proteico para formar iones de amonio.

Esta determinación incluye todo el nitrógeno reducido presente (-NH 2 y =NH), de modo que
los compuestos amoniacales, urea y aminoácidos libres son también valorados. El uso de
perlas de vidrio sirve de núcleo para la formación de burbujas.

PROCEDIMIENTO
Determinación:

a) Digestión: Colocar la cantidad adecuada de muestra (de acuerdo al contenido estimado de

nitrógeno) entre 0,1 y 4 g con una precisión de  1 mg, en un balón Kjeldahl de 500 ml. Agregar
1 cucharadita de catalizador, perlas de vidrio y 15-20 ml de H2SO4 conc. Todo el material debe
estar sumergido en el ácido para que no haya pérdidas de nitrógeno. Conectar el balón a la
trampa de agua y calentar la mezcla suavemente hasta que cese el desprendimiento de
espuma; luego calentar enérgicamente hasta completar la digestión de la materia orgánica (no
se observan partículas carbonosas sin oxidar y el líquido queda translúcido y de color débilmente
verdoso o azul-verdoso). La digestión demanda entre 1 y 2 hrs. Enfriar y agregar
cuidadosamente al menos 100 -200ml de agua.

b) Destilación: Presentar el balón con la muestra digerida a un refrigerante por medio de una
trampa adecuada. Preparar un Erlenmeyer con 25-50 ml de H3BO3 4% (sobre el cual se va a
recoger el NH3 destilado) y gotas de indicador Mortimer (color rojo), y colocarlo a la salida del
refrigerante cuidando que el extremo del mismo quede sumergido en la solución ácida. Antes
de conectar completamente el balón se va agregando con cuidado la cantidad necesaria de
solución de NaOH 40% como para neutralizar el ácido sulfúrico, primero sin agitar para que se
ubique en el fondo, y una vez agregado todo, conectar bien el balón, agitar para lograr la mezcla
(el medio se hace fuertemente alcalino que se detecta por formación de un precipitado pardo
oscuro, dispersado por efecto de la ebullición) y simultáneamente se comienza el calentamiento
a ebullición del contenido del balón. El indicador vira a azul cuando empieza a destilarse el NH3
por arrastre en corriente de vapor. Se sigue destilando hasta llegar a aproximadamente 200 ml
en el Erlenmeyer colector (los primeros 150 ml de destilado contienen generalmente la totalidad
del NH3). Una vez alcanzado dicho volumen, se retira el Erlenmeyer enjuagando dentro del
mismo el extremo del refrigerante con AD, para no perder nitrógeno y luego se apaga el
calentamiento.

c) Valoración: El destilado se valora con solución de H2SO4 0.2 N, hasta lograr el viraje del
indicador Mortimer al color inicial rojo

d) Blanco: Se debe realizar un blanco de reactivos, siguiendo las mismas indicaciones, pero sin
colocar muestra en el balón.
ETAPAS

a) Digestión Proteína + H2SO4 → CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

b) Destilación (NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + NH3 ↑+ H2O

(recibiendo en HCl)

(recibiendo en H3BO3) NH3 + H3BO3 → NH4H2BO3

c) Titulación

(si se recibió en HCl) NH4Cl + HCl + NaOH → NH4Cl + NaCl + H2O

(si se recibió en H3BO3) NH4H2BO3 + HCl → H3BO3 + NH4Cl

FACTOR DE CONVERSIÓN

El contenido porcentual promedio de N en las proteínas de

diversos alimentos es de 16%. El factor para convertir N en
proteínas sería entonces 100/16 = 6,25. Este factor general
de conversión no es sin embargo exacto, ya que las
proteínas de origen animal contienen generalmente menos
nitrógeno y las de origen vegetal más.

CÁLCULOS

Proteína total % = (VMuestra - VBlanco) x NAcido x 0.014 x F x

100/gMuestra

Siendo:
VMuestra ml de ácido gastados en la valoración de la muestra
VBlanco ml de ácido gastados en la valoración del blanco
NAciodo normalidad del ácido sulfúrico
0.014 peso del meq de nitrógeno, en g
F factor de conversión de nitrógeno a proteína
gmuestra peso en g de la muestra

En los cálculos para convertir nitrógeno a proteínas, usar el factor 6,25 para carnes, 5,7 para
cereales y soja y 6,38 para leche y derivados.
Las modificaciones del método que han resultado más útiles emplean:
 óxido de mercurio como catalizador de oxidación (Wilfoth): Los catalizadores permiten acortar
el tiempo de digestión y actúan como transportadores de O 2. Cuando se usa Hg como
catalizador, éste debe ser precipitado mediante el agregado de tiosulfato de sodio para liberar
el NH 3.
CuSO 4 también como catalizador de oxidación (Arnold).
K 2SO 4 para aumentar el punto de ebullición del ácido sulfúrico (Gunning): Otra modificación
ampliamente aceptada es la introducida en la etapa de destilación propuesta por Winkler: 
originalmente se utilizaba ácido sulfúrico valorado para captar el amoníaco,  titulando
posteriormente su exceso con NaOH valorado.

VENTAJAS DEL MÉTODO

o Apropiado para varios tipos de pro ductos. Alta confiabilidad.

o Usado como método de referencia.

DESVENTAJAS DEL MÉTODO

o Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos. Uso de catalizadores tóxicos o

caros.
o Elección del factor de conversión.

2.2. Determinación de Nitrógeno básico volátil- Índice de putrefacción

APLICACIÓN: carne vacuna, pescado

FUNDAMENTO: El pH de músculo de pescado fresco está entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el
momento de la muerte). Después de muerto se acumula ácido láctico, provocando caída de pH,
pero como en el músculo hay compuestos con carácter buffer, no permiten que se vea ese
descenso. Por descomposición del músculo se acumulan amoníaco, dimetilamina y trimetilamina.
Si en ese momento se produce contaminación bacteriana, entonces comenzará a subir el pH
(primero lentamente y rápido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0.
Ocurre un proceso de autolisis que lleva al aminoácido:

R-CH-NH2-COOH CO2 + R-CH2-CH2-NH2

Decarboxilasas

Aminooxidasas

NH3 + R-CH2-COOH

(algunos son
volátiles y

arrastrables por
agua)
Hay acción sobre el óxido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada. El láctico
en el músculo es reductor y actúa sobre el O=N(CH3)3 (precursor).

CH3 CH3
I Enzimas I
H-C-OH + 2 O=N(CH3)3 2 N(CH3)3 + COOH + CO2 + H2O
I microbianas básico volátil
COOH volátil

Se sabe que se produce la HN(CH3)2 pero no se conoce el precursor.

Reactivos:
MgO puro
Agente antiespumante (puede ser alcohol octílico o un antiespumante siliconado)
Acido bórico 2%
Indicador Mortimer: 0,016% rojo de metilo, 0,083% verde de bromocresol en etanol
H2SO4 0,02N "standarizado" (preparado por dilución de H2SO4 0,1 N)

Determinación: Colocar en un balón Kjeldahl 10 a 15 g de muestra preparada exactamente pesada

y agregar 2 g de MgO, 300 ml de agua destilada, unas gotas de antiespumante y unos trozos de
porcelana porosa o piedra pómez. Instalar el balón en el aparato de destilación.
Poner en un erlenmeyer de 500 ml, 50 ml de solución de ácido bórico al 2% y 4 gotas de
indicador. Conectar el aparato y colocar el erlenmeyer de manera que el extremo del refrigerante
quede sumergido en la solución de ácido bórico. Calentar el balón Kjeldahl de modo tal que el líquido
contenido entre en ebullición en exactamente 10 min. Destilar durante 25 min exactos, manteniendo
la misma intensidad de calentamiento. Enjuagar el refrigerante con agua destilada recogiendo
también en el erlenmeyer. Titular el destilado con H2SO4 0,02 N.
Expresar el resultado como mg de nitrógeno básico volátil por 100 g de muestra.
2.3. Determinación de Nitrógeno no proteico
Pesar con exactitud 0,5-1 gr de muestra y dispersarla en 10 ml de agua destilada. Agregar 10 ml de ácido
tricloroacético 24%, homogeneizar y centrifugar. Tomar una alícuota de sobrenadante límpido y
determinar N por el método de Kjeldahl.
2.4. Determinación de Nitrógeno álcali lábil: Método de Kofranyi (1950.
Milchwissenschafts, 51-54 Vol. 2). Determinación de proteínas en leche por
destilación directa.

FUNDAMENTO: Es un método rápido basado en la liberación de amoníaco cuando la leche es

calentada a ebullición en solución alcalina. La mayor parte del amoníaco liberado proviene de
la rápida hidrólisis de glutamina y asparagina.
DETERMINACIÓN: colocar en un balón Kjeldahl 10 ml de leche, 20 ml de BaCl 2 10 % (usar
propipeta) y 70 ml de NaOH 32%. Destilar durante 6 min (exactamente medidos a partir del inicio
de la ebullición), recogiendo sobre 100 ml de BO 3H3 2 %. Titular el destilado con SO4H2 0.1N,
usando como indicador 6 a 8 gotas de una solución 0.016 % de rojo de metilo y 0.083 % de verde
de bromocresol en alcohol. Calcular el porcentaje de proteína (p/p) utilizando una curva de
calibración que relaciona el % proteínas con los ml de SO4H2 0.1N gastados.
CURVA DE CALIBRACIÓN: se obtiene siguiendo el procedimiento anterior pero con muestras
de leche con contenidos de proteína conocidos. Para obtener las distintas muestras de leche se
parte de una leche entera a la que se le midió el % de proteínas por el método de Kjeldhal; con
esta leche se hacen diluciones o se agrega caseína para obtener las concentraciones proteicas
deseadas. El contenido de proteínas que cubra el rango de la curva de calibración, debe ser de
1 a 4 % (p/v).

NOTA: Actualmente los análisis en leche se realizan siguiendo la metodología especificada en

las normas IDF, de la Federación Internacional de Lechería (FIL). Para la determinación del
contenido de proteínas se utiliza el método de Kjeldhal, utilizando ácido bórico para recoger el
destilado.

2.5. Absorción a 280 nm

La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm., la cual se atribuye al grupo
fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano. La cuantificación de proteínas basada
en la absorción en la región de UV, tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y
la muestra no se daña o destruye durante la determinación. Se toma en cuenta la absorción del
disolvente, ya que este puede absorber en la misma región. Este método sufre interferencias
de compuestos que contengan anillos de purina y pirimida. Se realiza una comparación con
una proteína estándar, de la que se debe conocer su composición.

o La solución debe ser clara e incolora, la turbidez puede afectar los resultados.
o El contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente entre las distintas
proteinas. Los ácidos nucleicos interfieren (anillos de purina y pirimida), no así el
amonio.

2.6. Método de Biuret

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de

un complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta
característico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación
de un átomo de cobre con cuatro átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la
desprotonación de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II) o por el
establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones libres de los
átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido.
Después de la adición del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una
coloración de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres
que forman buffer en configuración tris y amoniaco.

2.7. Método de Bradford

RANGO: 0.01-0.5 mg/ml

REACTIVOS: Solución colorante: Disolver 100 mg de Serva Blue G (Serva, Westbury, NY) o
Coomassie Brilliant Blue G-250 en una mezcla de 100 ml de ácido fosfórico 85% y 50 ml de etanol
95%. Una vez que el colorante se disolvió completamente, llevar a 1 litro con agua destilada fría.

PROCEDIMIENTO: Prender el espectrofotómetro 15 min antes de usarlo. Poner 20l de muestra

en un tubo de hemólisis. Agregar 50l de NaOH 1N (alternativamente, el NaOH puede agregarse al
reactivo de color en la relación 50l/ml). Agregar 1 ml de reactivo de color e incubar 5 min. Medir la
absorbancia a 590 nm en cubetas de vidrio o poliestireno.

2.8. Método de lowry

El método de Lowry et al, 1951 combina la reacción de Biuret con la reducción del reactivo de
Folin-Ciocalteu (ácidos fosfomolíbdico y fosfotúngstico) por la oxidación de tirosina, triptofano,
cisteína, cistina de las cadenas polipeptídicas (Nielsen, 1988). El proceso de oxido-reducción
se acompaña de la formación de un color azul característico. Los quelatos de cobre en la
estructura del péptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales amino al
cromóforo ácido. Este método es útil para determinar pequeñas cantidades de proteína en una
disolución. El
desarrollo de color
es dependiente en
gran cantidad del
pH, que se debe
mantener entre 10
y 10.5.
VENTAJA

o Tiene mayor sensibilidad que el método del Biuret. La respuesta del color varía de acuerdo al
tipo de proteína.

2.9. Determinación de Nitrógeno amínico: Método de Sorensen

Aplicación: Sirve para determinar N amínico en muestras líquidas o extractos. La finalidad es poder
determinar la concentración de amoníaco o grupos amino libres de aminoácidos, péptidos y
proteínas. Es útil para dosar aminoácidos libres en jugos de fruta, el grado de hidrólisis de una
proteína, o amonio después de la destrucción de materia orgánica en el método de Kjeldahl, etc.

DETERMINACIÓN: Neutralizar 10 ml de muestra con NaOH 0,1 N usando fenolftaleína como

INDICADOR. Es importante no excederse en el agregado de NaOH, detenerse en el punto en que
aparece una débil coloración rosada que persiste por 30 seg. Otra posibilidad es utilizar un pHmetro
y llegar a pH 8.

Agregar 10 ml de formol neutralizado recientemente con fenolftaleína y titular de inmediato

la acidez liberada con NaOH 0,1 N hasta ver el punto final. Tomar este último valor para el cálculo
de N amínico y el primero para el cálculo de la acidez.

CÁLCULO:

g %N = VNaOH NNaOH 0,014 x 100/peso de muestra

2.10. Determinación de aminoácidos aromáticos: método de Hull

REACTIVOS: todos los reactivos deben estar a una T° > 30°C

DETERMINACIÓN: Mezclar 0.5 ml de muestra con 1 ml de CO 3Na2-Hexametafosfato y esperar

5 min. Luego agregar 0.3 ml de Rvo FC. Esperar 5 min y leer la absorbancia a 650 nm.

CURVA DE CALIBRACIÓN: Con tirosina como patrón preparar soluciones de diferente

concentración y agregar el volumen necesario de TCA 12% como para tener una concentración
final de 8%. Centrifugar y sobre los sobrenadantes aplicar la técnica descripta anteriormente.
 PRINCIPALES MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
CARBOHIDRATO EN ALIMENTOS
1. CARBOHIDRATOS TOTALES

Método de fenol-sulfúrico Este método propuesto por Dubois et al en 1956 se fundamenta en

que los carbohidratos son particularmente sensible a ácidos fuertes y altas temperaturas. Bajo
estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar empezando con una
deshidratación simple, si se continúa el calentamiento y la catálisis ácida se producen varios
derivados del furano que condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir
compuestos coloridos producto de la condensación de compuestos fenólicos y con heterociclos
con el nitrógeno como heteroátomo. La condensación más común es con fenol. Este método es
fácil, eficaz y rápido. Todos los azúcares como oligosacáridos y polisacáridos pueden ser
determinados, recordando que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. La forma
en que procede la reacción no es estequiométrica y depende de la estructura del azúcar, por lo
tanto se realiza una curva patrón.

2. ANALISIS DE POLISACARIDOS

Extracción selectiva de almidón Los dos tipos de moléculas que se pueden encontrar en el
almidón difieren apreciablemente en sus solubilidades en disolventes acuosos, por ejemplo, la
extracción en agua caliente removerá una parte considerable de amilosa y dextrinas, dejando
una parte de amilopectina. (Southgate, 1991)

Con cloruro de calcio La extracción con cloruro de calcio ha sido utilizada ampliamente en el
análisis de almidones en cereales por métodos polarimetritos, dando resultados reproducibles.
Otros polisacáridos son solubles en este reactivo y es necesario tener cuidado en la aplicación
de este método a otros tipos de alimentos. (Southgate, 1991)

Con ácido perclórico El almidón se extrae de una muestra seca con ácido perclórico y se
precipita como complejo yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el
almidón.

Con etanol y ácido perclórico El método se diseñó originalmente para cereales y envuelve la
extracción de azucares libres con etanol acuoso y la extracción del almidón con ácido
perclórico del residuo, con métodos como el de antrona. (Southgate, 1991)

Con dimetil sulfóxido (DMSO) El almidón se dispersa en DMSO y luego se convierte

cuantitativamente en D-glucosa con α-amilasa termoestable, llevando a cabo la polimerización
y de polimerización del almidón. Una glucoamilasa completa la acción de la α-amilasa para
determinar la D-glucosa usando un reactivo contiene una parte incolora que se oxida a un
compuesto colorido por medio del peroxido de hidrogeno proveniente de la glucosa.

3. CUANTIFICACIÓN DE ALMIDÓN

3.1. Por hidrólisis ácida directa

La hidrólisis ácida del almidón da un rendimiento casi teórico de glucosa y este proceso ha sido
el principio de varios métodos analíticos. La fuerza del ácido utilizado para la hidrólisis puede
variar pero se sabe que una disolución 0.2 M de ácido sulfúrico por 4 horas en reflujo convierte
el almidón en glucosa de tal suerte que el uso de ácidos más fuertes es innecesario. La
limitante del proceso es el contenido de proteínas y ácidos grasos en el alimento ya que dan
productos de condensación en estas condiciones.
3.2Por reacción colorida con yodo

La configuración de la molécula de almidón parece ser helicoidal con un núcleo relativamente

largo. La molécula tiene dos tipos de moléculas: amilosa y amilopectina, las amilosas son
moléculas lineales, en las cuales la glucosa está unida por enlaces α-1,4, la amilosa se
dispersa rápidamente en agua pero las cadenas se recombinan y sufren un proceso de
retrogradación. La amilosa forma complejos con el yodo y es responsable del color azul
característico del complejo almidón-yodo. El complejo con yodo es del tipo de inclusión. La
molécula de amilopectina ha dado evidencia de no formar complejos estables con yodo pero
dan un color rojo pálido en su presencia. La proporción de amilosa y amilopectina en el almidón
tiene efectos importantes en las propiedades físicas del almidón. La determinación de amilosa
en el almidón normalmente envuelve la formación de complejos con yodo y la titulación
potenciométrica de yoduro.

3.3. Por precipitación de complejos con yodo

El almidón se extrae de una muestra seca con ácido perclórico y se precipita como complejo
yodurado el cual, se descompone antes de que se hidrolice el almidón.

4. ANÁLISIS DE PECTINAS

Las soluciones pécticas son solubles en agua con una alta proporción de galacturonanos o
galacturonorhamnanos, aunque también arabinanos, galactanos y arabinogalactanos han sido
aislados de la fracción péctica de varias plantas. Las soluciones pécticas incluyen polisacáridos
que pueden ser extraídos con agua caliente. Es usual añadir un agente quelante como EDTA u
oxalato de amonio al medio de extracción para liberar aquellas pectinas que están presentes
como sales de calcio.

5. DETERMINACIÓN DE FIBRA DIETÉTICA

La fibra dietética se define como los polisacáridos y lignina que no son digeridos por enzimas
humanas (Lee y Prosky, 1995). Los métodos (AOAC 985.29, 993.21, Horwitz, 2005) se
fundamentan en aislar la fracción del interés con la precipitación selectiva y después
determinar su peso. Una muestra gelatinizada de alimento seco, desengrasado se digiere
enzimáticamente con alfaamilasa, amiloglucosidasa y proteasa para hidrolizar al almidón y la
proteína. El contenido total de la fibra de la muestra se determina agregando etanol al 95% a la
solución para precipitar toda la fibra. La solución entonces se filtra, se recupera, se seca y se
pesa, el residuo se reporta como fibra. (Prosky et al, 1984, Prosky et al, 1985)
Alternativamente, los componentes solubles e insolubles en agua de la fibra pueden ser
determinados filtrando la muestra enzimático-digerida (Método 991.43, Horwitz, 2005). La fibra
soluble se encuentra en la solución del líquido filtrado, y la fibra insoluble en el residuo. El
componente insoluble se recoge del filtro, se seca y se pesa. El componente soluble es
precipitado de la solución agregando el alcohol del 95% al líquido filtrado, y entonces
recuperado por la filtración, secado y pesado. Ambas metodologías se corrigen determinando
proteína y de ceniza de las fracciones. Estos métodos han sido reportados oficialmente por el
AOAC y son ampliamente utilizados en la industria alimentaria para determinar el contenido de
la fibra de una variedad de alimentos. Su desventaja principal es que tiende a sobrestimar el
contenido de la fibra de los alimentos que contienen altas concentraciones de azúcares
simples, por ejemplo, frutas deshidratadas, posiblemente porque estos carbohidratos son
atrapados en los precipitados formados cuando se agrega el etanol.

6. AZÚCARES EN SOLUCIÓN

Se requiere que al tratar estas muestras se remuevan sustancias que puedan interferir. Los
pigmentos y otras sustancias coloridas interfieren con procedimientos colorimétricos y otros
métodos, particularmente con los métodos de reducción. Para decolorar se han utilizado una
gran variedad de métodos como el uso carbón activado y tratamientos con sales de plomo.
Cuando se usan sales de plomo se debe de evitar el uso de acetato de plomo básico para
medidas polarimétricas, en cuyo caso se prefiere acetato de plomo neutro, este se usa con una
solución acuosa saturada y el exceso se elimina con oxalato de plomo u oxalato de sodio

7. CARBOHIDRATOS SOLUBLES TOTALES

Índice de refracción Cuando la radiación electromagnética pasa de un medio a otro, cambia de

dirección, se dobla o se refracta. La relación entre el ángulo de incidencia al seno del ángulo de
refracción se llama índice de refracción (RI).

El RI varía con la naturaleza del compuesto, la temperatura, la longitud de onda de la luz y la

concentración del compuesto. Si las tres primeras variables se hacen constantes la
concentración del compuesto se puede determinar midiendo el RI, de tal forma que el RI se
utiliza para determinar sólidos totales en disolución. El uso del RI para determinar
concentraciones es preciso solamente para sacarosa pura u otras disoluciones puras, también
se utiliza para obtener concentraciones aproximadas de azucares para productos líquidos en
cuyo caso la solución debe ser clara. Los refractómetros pueden leer directamente en unidades
de sacarosa.

8. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES

8.1 Método ácido dinitrosalicílico (D S)

En disolución alcalina el azúcar se hidroliza produciendo un compuesto que se reduce a un

grupo nitro del DNS, para dar el producto monoamino correspondiente. Esta reacción da un
producto colorido en solución alcalina. El original procedimiento de Dahlquist ha sido
modificado en un proceso automatizado para análisis de azucares totales producidos por la
hidrólisis de polisacáridos que no contengan almidón. Para este se requiere tener estándares
similares a la muestra. (Southgate, 1991) La reacción que se lleva acabo es la siguiente:

8.2. Método de Fehling

Cuando un azúcar reductor se calienta en condiciones básicas se degrada y algunos de los

productos de degradación reducen los iones cúpricos para formar oxido cuproso.

Una amplia variedad de métodos se ha utilizado para determinar azucares reductores, todos
estos han sido variaciones del método de Fehling. Estas variaciones han sido para cada tipo de
alimento, en cualquier caso el principal logro de modificaciones ha sido mejorar la precisión de
reducción y eliminar cualquier factor que interfiera con la producción de oxido de cobre, de los
factores estudiados, la alcalinidad del reactivo, la proporción, el tiempo de calentamiento, la
concentración del azúcar, parecen ser los mas importantes. A partir de esto, diferentes técnicas
han sido utilizadas para determinar el oxido cuproso que se forma y se han obtenido datos de
calibración; de estos métodos los mas usados son el método de Lane-Eynon y el método
Munson y Walker. En el método Lane-Eynon se titula con el reactivo de Fehling caliente en dos
etapas, primero se añade una cantidad de reactivo de Fehling tal que se lleve a cabo la total
reducción y después se determina el punto final con azul de metileno por goteo, es necesario
un control de la temperatura y se sugieren dos titulaciones
 PRINCIPALES MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
LIPIDOS EN ALIMENTO
I. Fundamento Teórico

- Atribuye a los alimentos mejorando la característica organoléptica como ahora y textura.

- Atribuye muchas propiedades nutritivas al ser humano
- Conlleva al enranciamiento del alimento
- Su extracción también se utiliza para fines de nutrición terapéutico

II. Métodos

2.1 Método de Soxhlet

El método consiste en una extracción de lípidos semi-continua con el solvente o mezcla de solventes
orgánicos adecuado según el tipo de grasa a extraer.
Preparación de la muestra y extracción de los lípidos: En un cartucho de papel de filtro colocar la
muestra seca y pesada (conviene utilizar lo proveniente de la determinación de humedad por el
método indirecto), y ponerla en el tubo extractor. Tarar el balón del aparato y conectarlo al mismo.
Por la parte superior del tubo extractor agregar el solvente adecuado (éter etílico, éter de petróleo,
mezcla de ambos, etc.) hasta que descargue el sifón, agregando además alrededor de la mitad del
contenido del tubo extractor. Calentar para que se produzcan al menos 7 ciclos de llenado y sifonado
del tubo extractor (durante 2 horas aproximadamente).
Recuperación y eliminación del solvente: Quitar el cartucho del tubo extractor con el resto de la
muestra. Volver a armar el equipo y recuperar el solvente limpio que se va acumulando en el tubo
extractor. Una vez que queda un pequeño volumen en el balón separar el solvente de los lípidos
por evaporación a baño María o en baño de arena caliente. Colocar el balón con los lípidos unos 10
minutos en estufa y pesar.
Cálculos: una vez conocida la masa de lípidos libre de solvente orgánico, calcular el porcentaje de
grasa en la muestra teniendo en cuanta la masa inicial de muestra colocada en el cartucho de
extracción.

Nota: Esta determinación suele denominarse extracto etéreo (si se utiliza éter), pues además de los
lípidos se extraen otros compuestos solubles en el solvente.

Ventajas: método rápido, el equipo no es caro,

Desventajas: se afecta la gravedad especifica de la grasa a separarse, perdida de analito con la

solución de ácido.

2.2 Método de Schmid-Bondzynski-Ratzlaff

Es un método muy empleado para determinar los lípidos en queso y en leche en polvo. En vaso de
precipitado de 100 ml colocar la cantidad adecuada de muestra, agregar 10 ml de HCl ( 1,19) y
calentar a BM hasta que las proteínas se hayan disuelto. Dejar enfriar, transferir el contenido a una
probeta graduada con tapa esmerilada, lavando el vaso de precipitado con unos 10 ml de alcohol
etílico en dos porciones y luego agregar 50-60 ml de éter. Dejar en reposo 24 horas y leer el volumen
de la fase etérea. Tomar una alícuota exactamente medida y evaporar el éter en un vaso de
precipitado pequeño previamente tarado. Una vez evaporado el éter pesar nuevamente y determinar
el contenido de lípidos por diferencia, teniendo en cuenta la alícuota tomada para realizar los
cálculos.
 2.3 Método de Gerber
Materia grasa en leche fluida
Se utilizará un butirómetro para leche y ácido sulfúrico Gerber. El H2SO4 Gerber (90% p/p, = 1,82).
Medir con pipeta 10 ml de H2SO4 Gerber e introducirlos en un butirómetro para leche, cuidando no
mojar las paredes internas del cuello. Agregar con rapidez 11 ml de leche medidos con pipeta de
doble aforo, de manera que forme una capa sobre el ácido sin mezclarse con éste. Agregar
inmediatamente 1 ml de alcohol amílico y tapar con el tapón correspondiente. Tomar el butirómetro
con un paño seco sujetando el tapón y agitar por inversión suave pero efectiva. Verificar que esté
bien tapado y colocarlo en un baño de agua a 65-70 °C durante 5 a 10 minutos con el tapón hacia
abajo. Retirar del baño, secarlo y centrifugarlo en la centrífuga especial con los tapones hacia afuera.
Llevar nuevamente a baño de agua durante aproximadamente 5 minutos hasta que alcance la
temperatura del agua (65-70 °C) y leer de inmediato el volumen de fase grasa separada en la parte
superior graduada del butirómetro. El volumen leído corresponde directamente al porcentaje de
grasa en la leche.
Materia grasa en crema o manteca
Se utiliza un butirómetro similar al utilizado para leche, pero abierto en sus dos extremos y con una
copita de vidrio en el tapón que obtura la base, en la que se pesa la muestra. La graduación del
vástago es de 0 a 70.
Se pesan en la copita 4 a 5 g de muestra (algo menos en el caso de la manteca), se la coloca en el
butirómetro, se ajusta bien el tapón y por la otra boca se agregan 10 ml de agua destilada, 10 ml de
H2SO4 Gerber (90% p/p, = 1,82) y 1 ml de alcohol amílico, se tapa, se toma con un repasador y
sujetando el tapón se agita hasta disolución total. Se coloca luego durante 5 min en baño María a
60-70 °C con el bulbo hacia abajo. Conviene atar los tapones, pues sino se corre el riesgo de que
salten y se pierda la determinación. Una vez cumplido el tiempo de calentamiento, se centrifuga 5
min en la centrífuga Gerber con el ápice hacia adentro. Volver al baño María 5 min y leer
inmediatamente el volumen que ocupa la fase grasa.
Cálculo: Se aplica la fórmula siguiente:
Lx5
materia grasa = --------- - 0,5 = g%
p
L: lectura en el butirómetro
5: porque el butirómetro está graduado para 5 gr de muestra.
p: gramos de muestra pesados.
0,5: factor de corrección.

2.4. Método de Rose Gottlieb- Método de referencia.

APLICACIONES
Leche, leche semidescremada, leche en polvo
Leche condensada azucarada y sin azucarar
Nata y nata batida
Lactosuero

REACTIVOS:
Solución de NaCl 0,5% p/v
NH4OH (densidad 0.91)
Etanol 96°
Eter etílico
Eter de petróleo: intervalo de ebullición 30-60°C

DETERMINACIÓN:
Se seca un matraz Erlenmeyer con boca esmerilada de 200 ml con algunas perlas de vidrio
durante 1h a 103 +/- 2°C, e coloca en desecador y se pesa con una precisión de +/- 1mg.
La muestra se pesa también al mg, de acuerdo a los valores recomendado en la tabla, en el tubo
de extracción de Mojonnier, diluyéndose con agua destilada si fuera necesario hasta un volumen
de 10 ml (en el caso de la nata debe utilizarse la solución de NaCl) y se agita hasta que el
producto se haya dispersado totalmente (para la leche en polvo es conveniente calentar el tubo
de extracción y su contenido durante 15 minutos en un baño de agua a 60-70°C agitando
ocasionalmente). A continuación, se añaden 2 ml de amoníaco, se mezcla y tras enfriar se
añaden 10ml de etanol. Después de añadir 25 ml de éter etílico, se tapa el tubo de extracción y
se agita durante 1 minuto invirtiéndolo sujetando el tapón. Finalmente se añaden 25 ml de éter
de petróleo y se vuelve a agitar durante 30 segundos. Una vez que las fases se han separado
completamente, lo que sucede después de dejar reposar el tubo de extracción o centrifugándolo
durante 5 minutos a 500-600 r.p.m., se pasa tanta fase orgánica (superior) como sea posible al
erlenmeyer previamente pesado. Se repite una segunda vez la extracción del residuo acuoso
con otros 15 ml de éter dietílico y éter de petróleo como se detalló más arriba. A continuación se
reúnen las fase orgánicas, se destilan los solventes (también el etanol) y se seca el residuo que
queda en el matraz erlenmeyer durante 1h a 103 +/- 2°C. Se enfría en desecador y se pesa con
una precisión de +/- 1mg. El secado se repite hasta obtener peso constante.

Pesos recomendados de muestra

Producto lácteo Peso en gramos

Leche entera en polvo 1-1,1
Leche descremada en polvo 1,5-1,6
Nata, nata batida 2-3
Leche condensada azucarada 3-3,5
Leche condensada sin azucarar 4-5
Leche entera, leche desnatada 10-11

CÁLCULO
El porcentaje de grasa G se calcula de acuerdo con la siguiente igualdad:

G [%]= [(m2-m1) . 100]/M

m1: masa en gramos del matraz erlenmeyer con las perlas.

m2: masa en gramos del matraz erlenmeyer con las perlas con grasa tras el secado
M: peso de la muestra en gramos

2.5. Materia grasa en dulce de leche. Método de Rose Gottlieb

REACTIVOS:
NH4OH conc.
Etanol
Eter etílico
Eter de petróleo

Pesar un gramo de muestra en papel satinado previamente tarado. Encerrar parcialmente el dulce
de leche (debe entrar en contacto con los reactivos) e introducir hasta el fondo en una probeta de
50 ml con tapa. Agregar 5 ml de agua destilada y agitar hasta que se disuelva el dulce de leche (si
es necesario calentar a B.M. a 60 °C). Enfriar y agregar 1 ml de NH4OH conc. Agitar y agregar 5 ml
de etanol. Agitar y agregar con pipeta aforada 10 ml de éter etílico. Agitar 30 seg. y agregar con
pipeta aforada 10 ml de éter de petróleo. Volver a agitar y leer bien el volumen total de la mezcla.
Dejar reposar entre 4 y 24 hs. en lugar fresco (hay que evitar la evaporación de solventes; si esto
ocurriera se notará una disminución en el volumen leído). Con pipeta aforada tomar 10 ml de la fase
superior etérea y evaporarlos en un pequeño cristalizador tarado. Dejar enfriar en desecador, pesar
y expresar en % de grasas
2.6. Métodos de extracción de lípidos totales
Para la obtención de lípidos totales, especialmente a partir de tejidos animales, vegetales o
bacterias, las mezclas de cloroformo/metanol (2:1 v/v) (método de Folch) o cloroformo/metanol/agua
(2:1:1 v/v/v) (método de Bigh and Dyer) logran una extracción más exhaustiva que los sistemas de
solventes simples.

2.7. Método de Folch (Folch et al., J Biol Chem 1957, 226, 497)
Pesar la masa deseada de muestra. Agregar 10 volúmenes (ml/g muestra) de metanol y
homogeneizar. Agregar 20 volúmenes de cloroformo y agitar. Agregar agua o solución salina (NaCl
0,73 %) (2 % del volumen de los solventes). Centrifugar para separar las fases. Separar la fase
orgánica (inferior), filtrándola a través de filtro de papel conteniendo Na2SO4 anhidro a fin de eliminar
restos de agua. Evaporar el cloroformo y pesar la masa de lípidos obtenida.
 PRINCIPALES MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE
MINERALES EN ALIMENTOS
]I. FUNDAMENTO TEORICO

-Minerales ayudan al mantenimiento del cuerpo

-El contenido de cenizas representa el contenido total de minerales dentro de un alimento.

-Se determina porque, es una parte importante del análisis proximal para la evaluación
nutricional de un alimento debido a que ciertos alimentos llegan a tener un contenido alto
de un mineral en particular, el contenido de cenizas llega a ser importante.

¿De qué depende la elección del método?

La elección del método analítico, por lo general, depende de la instrumentación disponible, la

experiencia del laboratorio y los niveles de concentración del analito

II. METODOS

2.1. Determinación de cenizas

Se entiende por cenizas como el residuo inorgánico que queda tras eliminar totalmente los
compuestos orgánicos existentes en la muestra, si bien hay que tener en cuenta que en él no
se encuentran los mismos elementos que en la muestra intacta, ya que hay pérdidas por
volatilización y por conversión e interacción entre los constituyentes químicos. A pesar de estas
limitaciones, el sistema es útil para concretar la calidad de algunos alimentos cuyo contenido
en cenizas totales, o sus determinaciones derivadas, que son cenizas solubles en agua y
cenizas insolubles en ácido,

está bien definido. Facilita en parte, su identificación o permite clasificar el alimento examinado
en función de su contenido en cenizas. La determinación consiste en incinerar la muestra en
horno mufla, hasta ceniza blanca en una cápsula. Los resultados se suelen expresar
porcentualmente tras aplicar la siguiente relación:
𝑃1−𝑃2 𝑥100
% cenizas =
𝑃−𝑃2

P es el peso en gramos de la cápsula más el de la muestra; P1 es el peso en gramos de la

cápsula más las cenizas; P2 es el peso en gramos de la cápsula en vacío. Los recipientes más
empleados para la obtención de cenizas son cápsulas
de porcelana
 2.2 Espectrofotometría

Hace tres décadas era la técnica más común para el análisis de metales en los alimentos. Sin
embargo ha perdido importancia en años recientes debido al desarrollo de nuevas técnicas
tales como la espectrometría de absorción atómica. Se basa en la relación entre la absorción
de la radiación visible o ultravioleta cercana de una solución y la concentración de las especies
coloreadas en la solución. El analito tiene que ser convertido a un complejo coloreado antes del
análisis.

La instrumentación básica es todavía relativamente simple y de bajo costo en comparación con

los instrumentos que se requieren para las otras técnicas de análisis de metales. El método
puede automatizarse fácilmente para el análisis rutinario y da resultados con una buena
sensibilidad y precisión. Las desventajas de esta técnica son que a menudo se requiere un
control estricto del pH y un estado de oxidación específico y también pueden haber problemas
con la interferencia de otros metales. Sin embargo, puede predecirse que se utilizará por
muchos años especialmente en laboratorios pequeños o en condiciones de terreno.

2.3 Fluorometría

Ciertos metales pueden ser transformados en complejos orgánicos asociados con iones o
quelatos fluorecentes que tienen la característica de absorber luz de una longitud de onda y en
su lugar emitir luz de otra longitud de onda. La luz emitida o fluorescencia es proporcional a la
concentración del analito. El método es relativamente barato y es muy sensible, varios órdenes
de magnitud mejor que la espectrofotometría. Se utiliza frecuentemente para la determinación
de elementos traza en muestras biológicas y en alimentos que son más difíciles de analizar con
otras técnicas como por ejemplo Se.

2.4 Espectrometría de absorción atómica (AAS)

Los átomos libres producidos en un atomizador a partir de una muestra (llama u horno de
grafito calentado eléctricamente) pueden absorber radiación de su longitud de onda específica
de resonancia generada por una fuente externa (por ejemplo, un cátodo hueco o una lámpara
de descarga sin electrodos. Si la luz de esta longitud de onda específica pasa a través del
atomizador que contiene el vapor atómico del elemento, parte de la luz será absorbida, y el
grado de absorción será proporcional a la densidad de átomos en el paso de la luz.

Más de 60 elementos metálicos pueden determinarse, en un amplio rango de concentraciones

mediante este método con una buena sensibilidad y precisión.

Diferentes formas de introducción de la muestra y atomización han sido desarrolladas para esta
técnica la cual puede automatizarse fácilmente para el análisis rutinario.

2.5. Espectrometría de absorción atómica de llama (FAAS)

La llama se utilizó exclusivamente como fuente de atomización en los primeros años del
desarrollo de la AAS. La solución de la muestra se aspira vía un nebulizador dentro de la llama
de aire/acetileno o N2O/acetileno donde se evapora el solvente y los sólidos remanentes se
separan en átomos. La FAAS no es muy susceptible a los efectos de la matriz, aunque pueden
encontrarse interferencias. Las interferencias físicas pueden ocurrir debido a cambios en la
viscosidad de la solución, lo que influye en su velocidad de aspiración dentro de la llama y, por
lo tanto, en la cantidad de analito en la llama.

Los errores debido a interferencias físicas se pueden reducir mediante la compatibilización de

la matriz. Las interferencias de ionización se encuentran cuando el grado de ionización del
analito en la llamarada es diferente para las muestras que para los estándares debido a que los
átomos e iones no absorben en la misma línea espectral. Los elementos alcalinos y alcalino
térreos se ven especialmente afectados por esta interferencia. Las interferencias de ionización
pueden ser reducidas al agregar un supresor de la ionización, el cual proporciona una alta
concentración de electrones para suprimir la ionización del analito (por ejemplo, adición de Cs
para el análisis de Na). Las interferencias químicas en la FAAS son causadas a menudo por
aniones que forman compuestos de baja volatibilidad como por ejemplo óxidos refractarios (B,
Al, Fe o V), fosfatos y sulfates (Mg, Ca). En algunos casos, tales interferencias pueden
eliminarse al agregar un agente liberador que reacciona de preferencia con las especies que
interfieren y evita su reacción con el analito. Por ejemplo, se puede agregar La como agente
liberador en la determinación de Ca para reducir la interferencia del sulfato o fosfato. En casos
donde no pueda eliminarse la interferencia, deberá emplearse la técnica de adición de estándar
para obtener resultados exactos. La FAAS es probablemente la técnica más ampliamente
utilizada para el análisis de metales en alimentos debido a su simplicidad, alto rendimiento de
muestras y el costo relativamente bajo de su instrumentación. Permite la determinación de la
mayoría de los elementos traza en los alimentos en el rango de mg/kg con una precisión de
0,3-1% (a absorbancias > 0,1-0,2) y una exactitud de aproximadamente 0,5-5%.

2.6. Espectrometría de absorción atómica por generación de hidruros (HGAAS)

La HGAAS puede determinar elementos que forman hidruros volátiles como por ejemplo As, Bi,
Sn y Te. En esta técnica, el analito es reducido a su hidruro volátil, transferido mediante un
chorro de gas a una célula de cuarzo caliente, descompuesto y atomizado. La separación del
analito reduce en gran medida las interferencias de la matriz de tal modo que pueden
determinarse niveles de concentración de μ.g/kg. Si el tamaño de la muestra es un problema,
puede emplearse inyección de flujo que permite analizar volúmenes de muestra tan pequeños
como 100 μl. Sin embargo, el método tiene sus desventajas. Se requiere de un tratamiento
especial después de la digestión de la muestra para generar un estado de oxidación específico
(e.g. Se+4) para la formación del hidruro y ciertos metales (por ejemplo Cu, Fe) pueden interferir
con la formación del hidruro.

2.7. Elección del instrumental

Con la amplia variedad de técnicas analíticas modernas disponibles, los jefes de laboratorio
deben decidir cual técnica es la más adecuada para su laboratorio. La nueva instrumentación
adquirida debería corresponder a las características de los problemas analíticos que se van a
resolver. Los parámetros que se deben considerar para la selección de una técnica análitica
incluyen: el límite de detección y de sensibilidad, la precisión analítica, el rango de trabajo
analítico, los problemas con las interferencias, el costo del instrumento, el rendimiento de
muestras, la posibilidad de automatización y los conocimientos y aptitudes del operador a
cargo.

En la actualidad la mayoría de los laboratorios utiliza principalmente las técnicas

espectrométricas atómicas, para el análisis de elementos traza. La espectrofotometría y
fluorometría se emplean principalmente donde no se dispone de medios suficientes para otros
métodos o bajo condiciones de terreno donde es difícil de utilizar instrumental complejo. A
continuación, se dará una breve revisión de los méritos de las principales técnicas
espectrométricas atómicas.

Los límites de detección típicos para las principales técnicas espectrométricas atómicas se
muestran en el Gráfico 6.
 2.8. Determinación de hierro (Método AOAC 944.02)

La ortofenantrolina reacciona con el Fe 2+, originando un complejo de color rojo característico

(ferroína) que absorbe notablemente en las regiones del espectro visible de alrededor de 505
nm. El Fe 3+ no presenta absorción a esa longitud de onda y debe ser reducido a Fe 2+
mediante un agente reductor apropiado, como la hidroxilamina, (en forma de clorato para
incrementar su solubilidad). (Boumans et al, 1997)

La reducción cuantitativa de Fe 3+ a Fe 2+ ocurre en pocos minutos en un medio ácido (pH 3-

4) de acuerdo a la siguiente ecuación:

4 Fe 3+ + 2 NH2OH → 4 Fe 2+ +N2O + 4 H+ + H2O

Después de la reducción del Fe 3+ a Fe 2+, se da la formación de un complejo con la adición

de ortofenantrolina. En un medio acido la ortofenantrolina se encuentra en su forma protonada
como ion 1,10-fenantrolin (FenH+).

La reacción de complejación puede ser descrita por la siguiente ecuación: (La estructura
química del complejo se muestra en la figura 2)

Fe 2+ + 3 FenH+ → Fe(Fen)3 3+ + 3 H+

Estructura química de la ferroína. Consiste en 3 moléculas de OP (ortofenantrolina) alrededor

de un átomo central de Fe. Los átomos de carbono de la ferroína están representados con
sombras grises. Los átomos de N están representados en blanco
 2.9. Determinación de calcio (Método AOAC 944.03). Titulación con
permanganato

El Calcio se precipita a pH 4 como oxalato (si hay fosfato presente se puede eliminar con ácido
acético), posteriormente el oxalato se disuelve en ácido sulfúrico liberando ácido oxálico el cual
se titula con una solución valorada de permanganato de potasio. (James, 1999) Las
reacciones involucradas son:

1. Precipitación del Calcio con Oxalato de Amonio.

CaCl2 + (NH4)2C2O4 → 2NH4Cl + CaC2O4

2. Liberación del ácido oxálico por la acción del ácido sulfúrico sobre el oxalato de calcio
CaC2O4 + H2SO4 → CaSO4 + H2C2O4

3. Titulación del ácido oxálico con permanganato de potasio

5H2C2O4 + 2KmnO4 + 3H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 + 8H2O + 10CO2

 BLIBLIOGRAFIA

Analisis de contenido de proteínas, 2017, química de los alimentos, licenciatura

en ciencia y tecnología de los alimentos.

Analisis de alimentos, fundamentos y técnicas.

Determinacion de nitrógeno y proteínas, 2014.

Determinación de lípidos, facultad de ciencias exactas, análisis de alimentos,

ppt.

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http://www.analizacalidad.com/docftp/fi1441ene2007.pdf

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Analisis de alimentos, fundamentos y técnicas, Facultad de Química, de la

UNAM