GUIA BIOQUIMICA Abril 2014

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
GUÍA DE PRÁCTICAS
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I
CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y PROTEÍNAS
Dra. Guadalupe Jibaja
SEPTIEMBRE 2014
1
CONTENIDO
CAPITULO I.............................................................................................................................................................................................................. 5
1. CARBOHIDRATOS .................................................................................................................................................................................... 5
1.1 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO .............................................................. 5
1.1.1 Reacción con α-Naftol o Prueba de Molisch ................................................................................................................... 5

1.1.2 Reacción de Antrona .............................................................................................................................................................. 6
1.1.3 Prueba con Naftorresorcina ................................................................................................................................................. 6
1.2 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES ............................................. 7
1.2.1 Prueba con el hidróxido cúprico (II), Reacción de Trommer ..................................................................................... 7
1.2.2 Reacción con el licor de Fehling ......................................................................................................................................... 8
1.2.3 Reacción con sales de bismuto, Nylander ......................................................................................................................... 8
1.2.4 Reacción con Fenilhidrazina ................................................................................................................................................ 9
1.2.5 Reconocimiento de la fructosa en disolución (Reacción de A. F. Selivánov) ........................................................ 11
1.2.6 Reacción de reconocimiento de las pentosas con Orcina (Prueba del bial) .......................................................... 12
1.2.7 Reacción con Floroglucina ................................................................................................................................................. 13
1.2.8 Reacción de Barfoed.............................................................................................................................................................. 14
1.2.9 Prueba de Benedict. .............................................................................................................................................................. 14
1.3 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE DISACÁRIDOS .................................................................................... 15
1.3.1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa .................................................................................................................... 15
1.3.2 Hidrólisis ácida de la sacarosa ........................................................................................................................................... 16
1.3.3 Hidrólisis enzimática de la sacarosa ................................................................................................................................. 16
1.3.4 Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa ............................................................................................... 17
1.3.5 Reacciones de reducción de iones metálicos ................................................................................................................. 17
1.4 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE POLISACÁRIDOS ............................................................................... 17
1.4.1 ALMIDÓN: Reacciones coloreadas del almidón.......................................................................................................... 17
1.4.2 Hidrólisis ácida escalonada del almidón ......................................................................................................................... 18
1.4.3 Hidrólisis enzimática del almidón .................................................................................................................................... 19
1.5 IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES ................................... 20
1.5.1 Preparación de las muestras a analizar: extracción de carbohidratos .................................................................... 20
1.5.2 Reacciones de identificación ............................................................................................................................................... 20
1.6 PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA CARBOHIDRATOS.................................................................................... 22
CAPITULO II .......................................................................................................................................................................................................... 24
2. LIPIDOS ....................................................................................................................................................................................................... 24
2.1 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS.................................................................................................................................. 24
2.2 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS GRASAS ........................................................................................ 24
2.2.1 Reacción de la grasa y el aceite con el reactivo de Sudán III.................................................................................... 24
2.2.2 Determinación de la glicerina en las grasas .................................................................................................................. 25
2.2.3 Solubilidad de las grasas ..................................................................................................................................................... 25
2.2.4 Determinación de la temperatura de fusión ................................................................................................................... 26
2.3 DETERMINACION DE LOS INDICES (CONSTANTES) DE LAS GRASAS Y ACEITES ............................... 28
2.3.1 Determinación del número acídico ................................................................................................................................... 28
2.3.2 Determinación del índice de iodo...................................................................................................................................... 29
2.3.3 Determinación del número (índice) de saponificación ................................................................................................ 30
2.3.4 Determinación del índice (número) de éster .................................................................................................................. 31
2.4 EMULSIFICACIÓN DE LAS GRASAS .................................................................................................................................. 32
2
2.5 HIDRÓLISIS DE LOS GLICÉRIDOS CON LIPASA......................................................................................................... 32
2.6 FOSFOLÍPIDOS .............................................................................................................................................................................. 34
2.6.1 Aislamiento de los fosfolípidos .......................................................................................................................................... 34
2.6.2 Aislamiento de los fosfolípidos del tejido nervioso ...................................................................................................... 35
2.6.3 Aislamiento del colesterol del tejido nervioso .............................................................................................................. 36
2.6.4 Reacciones coloreadas del colesterol ............................................................................................................................... 36
2.7 PREPARACION DE REACTIVOS PARA LIPIDOS ......................................................................................................... 38
CAPÍTULO III ........................................................................................................................................................................................................ 43

3. PROTEINAS ............................................................................................................................................................................................... 43
3.1 ENZIMAS .......................................................................................................................................................................................... 43
3.2 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS....................................................................................................................................... 44
3.2.1 Labilidad térmica de las enzimas ...................................................................................................................................... 44
3.2.2 Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas .................................................................................................... 45
3.2.3 Especificidad de las enzimas ............................................................................................................................................... 46
3.2.4 Influencia de los activadores e inhibidores..................................................................................................................... 47
3.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS .................................................................................... 48
3.3.1 Determinación de la actividad de la dehidrogenasa de ácido succínico. ............................................................... 48
3.3.2 Determinación de la actividad de la catalasa en la sangre ......................................................................................... 49
3.3.3 Cuantificación de Amilasa Pancreática............................................................................................................................ 50
3.3.4 Actividad de anhidrasa carbónica ..................................................................................................................................... 51
3.4 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTEÍNAS ............................................................................... 53
3.5 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS ...................................................................................... 53
3.5.1 Salificación de las proteínas ................................................................................................................................................ 53
3.5.2 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico. .................................................................................................... 54
3.5.3 Precipitación reversible de las proteínas con sulfato amónico ................................................................................. 55
3.5.4 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio .............................................................. 55
3.5.5 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados. ................................................................................... 55
3.5.6 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales................................................................................................... 56
3.5.7 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos. ................................................................................................... 57
3.5.8 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona .................................................................................................. 58
3.6 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTEÍNAS ............................................................................... 58
3.6.1 Descubrimiento de los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas (reacción del Biuret) ...................... 59
3.6.2 Ensayo de la ninhidrina ....................................................................................................................................................... 60
3.6.3 Reacción con el ácido pícrico.............................................................................................................................................. 61
3.7 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS AMINOACIDOS ................................................................... 62
3.7.1 Ensayo xantoproteico ......................................................................................................................................................... 62
3.7.2 Reacción de la tirosina ......................................................................................................................................................... 63
3.7.3 Reacción del triptófano ........................................................................................................................................................ 64
3.7.4 Reacción de la arginina ........................................................................................................................................................ 64
3.7.5 Reacción de los aminoácidos que contienen azufre ...................................................................................................... 65
3.7.6 Reacción de reconocimiento del glutatión ..................................................................................................................... 65
3.7.7 Diazorreacción de reconocimiento de la tirosina, el triptófano y la histidina ...................................................... 67
3.8 DESCUBRIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO EN LAS PROTEÍNAS ...................................................... 67
3.9 PROTEINAS CONJUGADAS .................................................................................................................................................... 68
3.9.1 NUCLEOPROTEINAS ...................................................................................................................................................... 68
3
3.9.2 Aislamiento de la desoxirribonucleoproteína ................................................................................................................ 68
3.9.3 Reacciones de Reconocimiento del ADN ....................................................................................................................... 69
3.9.4 Obtención de la nucleoproteína a partir de levadura .................................................................................................. 70
3.9.5 Hidrólisis de la nucleoproteína .......................................................................................................................................... 70
3.9.6 Detección de las proteínas sencillas ................................................................................................................................. 71
3.9.7 Detección de las pentosas ................................................................................................................................................... 71
3.9.8 Detección de las bases púricas ........................................................................................................................................... 72
3.9.9 Detección del ácido fosfórico.............................................................................................................................................. 72
3.10 GLICOPROTEÍNAS ...................................................................................................................................................................... 73
3.10.1 Aislamiento de la mucina de la saliva .............................................................................................................................. 73
3.11 PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA ENZIMAS ...................................................................................................... 74
3.12 PREPARACION DE REACTIVOS PARA RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS ............................................ 74
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................................................................................................... 76
4
CAPITULO I
1. CARBOHIDRATOS
1.1 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO
1.1.1 Reacción con α-Naftol o Prueba de Molisch

Esta reacción es general para hidratos de carbono y se aplica para detectar la presencia de estos en
los materiales biológicos. El quimismo de la reacción se reduce al hecho de que mediante la acción
del ácido sulfúrico concentrado se forma furfural a partir de las pentosas; 5-hidroximetilfurfural a partir
de las hexosas
C C C C
O O
C C C C
C HO H2C C
O C
H H
Furfural (Pentosas) 5-Hidroximetilfurfural (Hexosas)
Al combinarse los últimos con α-naftol surge una coloración violeta característica y al combinarse con
timol, una coloración roja.
Instrumentos:
 Soporte con tubos de ensayo
Reactivos:
 α-naftol, disolución al 0,2%
 Timol, disolución al 1% en alcohol etílico
 Ácido sulfúrico concentrado
 Sacarosa, disolución al 1%
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 2 mL de disolución de sacarosa en cada uno. En el primer tubo de
ensayo se añaden de 4 a 6 gotas de disolución de α-naftol y en el segundo tubo, igual cantidad de
disolución de timol. En ambos tubos de ensayo se vierten con cuidado, por la pared, 1 ó 2 mL de
ácido sulfúrico concentrado sin mezclarlo con la capa acuosa.
En el contacto con las capas aparece:

una coloración violeta, en el caso de α-naftol y,
una roja, en el caso de timol.
5
1.1.2 Reacción de Antrona
La presencia de carbohidratos se pone de manifiesto por la reacción de la antrona. Esta se basa en la
reacción hidrolizante y deshidratante de los hidratos de carbono que posee el ácido sulfúrico
concentrado.
Instrumentos:
Reactivos:
 Antrona, disolución al 0,2% en ácido sulfúrico concentrado
 Disoluciones de carbohidratos
Procedimiento:
A dos 2 mL de disolución de antrona al 0.2% en ácido sulfúrico concentrado añadir 0.2 mL de la
solución problema de carbohidratos, mezclar fuertemente y observar el cambio de color. La aparición
de un color verde o azul verdoso indica la presencia de carbohidratos.
1.1.3 Prueba con Naftorresorcina

La reacción se basa en la capacidad de los hidratos de carbono de condensarse con los sistemas
aromáticos, formando sustancias coloreadas. Así, al ácido glucurónico al condensarse con
naftorresorcina, forma derivados de dinaftilmetano o xantina:
OH O OH HO
HO OH
HC
CH
2 + (CHOH) 4 (CHOH) 4
O
OH C
C HO O
OH
O
HO OH
CH
(CHOH) 4
C
HO O
Instrumentos:
Reactivos:
 Glucosa, disolución al 5%
 Naftorresorcina, disolución alcohólica al 1%
 Acido clorhídrico concentrado
 Éter o benceno
6
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 5 a 6 mL de disolución de glucosa, se añade 1 mL de disolución
de naftorresorcina y 1 mL de ácido clorhídrico concentrado. La mezcla se calienta con cuidado y se
hierve durante 1 min. Luego se enfría, se añade de 1 a 2 mL de éter o benceno y se agita. La capa
etérica (bencénica) se tiñe de color verde azulado. Igual coloración dan la galactosa y la manosa,
mientras que la xilosa y la arabinosa proporcionan una coloración azul oscura y los ácidos urónicos,
una coloración violeta.
1.2 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES
FUNDAMENTO: Los hidratos de carbono cuya molécula contiene un grupo carbonilo libre, se
denominan reductores. Estos azúcares en medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse,
reduciendo a su vez las sales de óxido cúprico (valencia +2) a sales de óxido cuproso (valencia +1);
las sales de plata, hasta plata metálica; las sales de óxido de bismuto, hasta bismuto metálico. En
esto se basa una serie de métodos de determinación cualitativa y cuantitativa de los carbohidratos.
1.2.1 Prueba con el hidróxido cúprico (II), Reacción de Trommer

En disolución alcalina los mono y disacáridos reductores reducen el hidróxido cúprico (II) a óxido
cuproso (I):
O O
ºt
H11C5 C + 2 Cu(OH) 2 H11C5 C + 2 CuOH + H2O
H OH
- H 2O
Glucosa Ácido Glucónico
Cu 2O
Instrumentos:
Reactivos:
 Hidróxido sódico, disolución al 10%
 Sulfato cúprico, disolución al 1%
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de disolución de glucosa, un volumen igual de
disolución de hidróxido de sodio y, agitándolo, se añade, gota a gota, la disolución de sulfato cúprico.
En presencia de la glucosa, el precipitado de hidróxido cúprico (II) formado se disuelve, coloreando el
líquido de color azul claro. La capa superior del líquido se calienta hasta ebullición. La aparición de un
precipitado amarillo (hidróxido cuproso (I)) y luego rojo (óxido cuproso) indica que la reacción de
Trommer es positiva.
7
En otro tubo de ensayo se mezclan de 2 a 3 mL de disolución de hidróxido de sodio con varias gotas
de disolución de sulfato cúprico. Disolución de glucosa no se añade. Se forma un precipitado de
hidróxido cúprico de color azul claro. Al calentar esta disolución, se forma un precipitado negro de
óxido cúprico.
Por lo tanto, en la reacción de Trommer debe evitarse el exceso de sulfato cúprico, ya que la reacción
entre el hidrato de carbono reductor y el hidróxido cúprico transcurre cuantitativamente. El exceso del
último durante el calentamiento pierde agua y se transforma en óxido cúprico negro, los que oscurece
la reacción principal y constituye un defecto del método: Cu (OH) 2  CuO + H2O.
1.2.2 Reacción con el licor de Fehling

La reacción con el licor o reactivo de Fehling se basa en el mismo principio que la reacción de
Trommer. La diferencia consiste en que en las reacciones no se emplea hidróxido cúprico libre. Este
último se encuentra en estado combinado y forma parte del reactivo de Fehling.
El licor de Fehling representa un compuesto complejo de cobre con tartrato de sodio y potasio de
color azul. En su composición el ion cobre en estado de oxidación «+2» se encuentra en forma de un
compuesto complejo con tartratos. Por eso durante el calentamiento, incluso con exceso de reactivo
dado, no se forma el precipitado negro CuO y no oscurece la reacción con pequeñas cantidades de
glucosa.
Instrumentos:
 Baño María
Reactivos:
 Reactivo de Fehling: A y B
Procedimiento:
A 1 ó 2 mL de disolución de glucosa se añaden igual volumen de reactivo de Fehling y se agita. La
capa superior del líquido se calienta hasta la ebullición. Aparece, al igual que en la reacción de
Trommer, un precipitado amarillo de hidróxido cuproso (CuOH) o bien un precipitado rojo de óxido
cuproso (Cu2O).
1.2.3 Reacción con sales de bismuto, Nylander

Para detectar los azúcares reductores se emplean frecuentemente las sales de bismuto. En la
composición del reactivo de Nylander, análogo al de Fehling, entra nitrato dibásico de bismuto que,
en presencia de hidróxido de sodio, forma hidróxido de bismuto. Este último se encuentra en estado
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combinado con el tartrato de sodio y potasio. Al reaccionar con la glucosa, el hidróxido de bismuto se
reduce a bismuto metálico y el líquido adquiere un color negro.
Bi(OH) 2NO 3 + NaOH Bi(OH) 3 + NaNO 3
O O
ºt
H11C5 C + 2 Bi(OH) 3 H11C5 C + 2 Bi + 3 H 2O
H OH
Glucosa Ácido Glucónico
Instrumentos:
Reactivos:
 Reactivo de Nylander
Procedimiento:
A 2 mL de disolución de glucosa se añade 1 mL de reactivo de Nylander y se hierve durante 2 ó 3
min. El líquido oscurece debido a la formación de un precipitado negro de bismuto metálico.
1.2.4 Reacción con Fenilhidrazina

Una particularidad importante de los monosacáridos consiste en su capacidad de entrar en reacción
con la fenilhidrazina y formar fenilhidrazonas y osazonas.
La reacción de formación de osazonas transcurre en 3 etapas. Al reaccionar los monosacáridos con

fenilhidrazina, en la primera etapa se forman fenilhidrazonas solubles en agua (reacción de
sustitución). En la segunda etapa, con la fenilhidrazona formada reacciona otra molécula de
fenilhidrazina y, oxidándola, transforma el grupo hidroxilo en grupo carbonilo. La tercera molécula de
fenilhidrazina entra en reacción de sustitución con el grupo carbonilo recién formado, lo que conduce
a la formación de compuestos poco solubles en agua: osazonas, que producen cristales de color
amarillo, de forma característica. La forma de los cristales de osazonas es variable y depende de la
estructura de los monosacáridos, de los cuales se forman las osazonas.
Las osazonas de diferentes monosacáridos se distinguen por la forma de los cristales, punto de
fusión, solubilidad y actividad óptica. Por eso, estas propiedades se utilizan para aislar los
monosacáridos de la disolución, como también para distinguir unos azúcares de otros. (Ver figura 1)
Instrumentos:
 Baño María
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 Vaso con hielo
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Pipeta
 Microscopio
Reactivos:
 Mezcla de clorhidrato de fenilhidrazina cristalino y acetato de sodio anhidro (2:3)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de disolución de glucosa, se añade 0,5 g de mezcla de
clorhidrato de fenilhidrazina y acetato de sodio, se agita y se calienta durante 5 min en el baño María
hirviendo. Luego se coloca el tubo de ensayo en el vaso con hielo. Al enfriarse lentamente, de la
disolución precipitan cristales de osazona. Estos últimos se observan bajo el microscopio.
Figura 1 Cristales de osazonas de mono y disacáridos

Fila superior: Glucosa, galactosa, arabinosa:
Fila inferior: Lactosa, maltosa, xilosa
10
I
O
C
N NH
H
C
H C OH H2N NH H
H C OH
HO C H
+ HO C H
H C OH + H2O
H C OH
H C OH
H C OH
CH 2OH
CH 2OH
Glucosa Fenilhidrazina Fenilhidrazona de la Glucosa
II
N NH
N NH
C
C
H
H
H C OH H2N NH NH2
H C O
HO C H
HO C H
+ NH 3
+ +
H C OH
H C OH
H C OH
H C OH
Anilina
CH 2OH
CH 2OH
III
N NH
C N NH
H C
H C O H
H C N NH
H2N NH
HO C H
HO C H
H C OH + +
H C OH H2O
H C OH
H C OH
CH 2OH
CH 2OH
Osazona de la Glucosa
1.2.5 Reconocimiento de la fructosa en disolución (Reacción de A. F. Selivánov)

Esta reacción se aplica especialmente para el reconocimiento de las cetosas; sobre todo va bien con
la fructosa y con aquellos azúcares complejos que por hidrólisis dan fructosa (sacarosa, inulina). La
reacción se basa en la formulación del 5-hidroximetilfurfural, mediante el calentamiento de la fructosa
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con un ácido. El 5-hidroximetilfurfural da con la resorcina (meta-dihidroxibenceno) un producto de
condensación de color rojo.
- 3 H 2O OH
C6H12O6 HCl
Producto de condensación
O
+ de color rojo
Fructosa O
HOH 2C C OH
H
5-Hidroximetilfurfural Resorcina
Las aldohexosas también dan esta reacción, pero transcurre más lentamente y en condiciones
especiales (temperatura y acidez del medio).
Instrumentos:
 Baño María
Reactivos:
 Fructosa, disolución al 1%
 Reactivo de Selivánov
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de reactivo de Selivánov, se añaden 2 ó 3 gotas de
disolución, de fructosa y se calienta de 1 a 2 min en el baño María hirviendo. Se observa la
coloración roja del líquido. En el caso de ebullición prolongada, esta reacción tiene lugar también con
la glucosa, maltosa y sacarosa. Por eso, si en la disolución a investigar están presentes dichos
hidratos de carbono, la concentración del ácido clorhídrico no deberá sobrepasar el 12%. En el
proceso de la reacción el precipitado y la coloración deberán aparecer no más tarde que a los 20 ó 30
segundos desde el inicio de la ebullición.
1.2.6 Reacción de reconocimiento de las pentosas con Orcina (Prueba del bial)
Bajo la acción del ácido clorhídrico concentrado las pentosas, al calentarse, se deshidratan y se
transforman en furfural. Este último se condensa con la orcina (metildihidroxibenceno) en presencia
de trazas de cloruro férrico (+3) y forma un compuesto que da coloración verde.
H H
CH3
HO C C OH
- 3 H 2O Producto de
HCl
condensación
H C C H
O C
O +
H OH O de color verde
OH C HO OH
H
H Orcina
Pentosa Furfural
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Instrumentos:
Reactivos:
 Pentosa (arabinosa o xilosa), disolución al 1%
 Reactivo de orcina
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierte 1 mL de disolución de pentosa e igual volumen de reactivo de orcina.
La mezcla se calienta en el baño María hirviendo durante 20 min. Aparece coloración verde de la
disolución. La coloración verde la proporciona también los ácidos urónicos, pero después de un
calentamiento más prolongado.
1.2.7 Reacción con Floroglucina

Durante el calentamiento de las pentosas con HCl, éstas se transforman en furfural, el cual al
condensarse con la floroglucina (trihidroxibenceno), da color rojo guinda.
H H
OH
HO C C OH
- 3 H 2O Producto de
HCl, º t
condensación
H C C H
O C
O +
H OH O de color rojo
OH C HO OH
H
H Floroglucina
Pentosa Furfural
Instrumentos:
 Pipeta
 Espátula
 Baño María
Reactivos:
 Pentosa (arabinosa o xilosa), disolución al 1%
 Floroglucina cristalina
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 1 a 2 mL de disolución de pentosa o una pequeña cantidad de
serrín de madera, se añade igual volumen de ácido clorhídrico concentrado y varios cristales de
floroglucina. El tubo de ensayo se coloca en el baño María caliente. Durante el calentamiento
aparece una coloración roja.
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1.2.8 Reacción de Barfoed
El reactivo de Barfoed es débilmente ácido y solamente puede ser reducido por monosacáridos. Si se
deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar disacáridos dando así reacciones
falsamente positivas. El fundamento radica en la reducción del acetato cúprico a óxido cuproso. El
precipitado de óxido cuproso es menos denso que en los métodos previos y se recomienda dejar el
tubo hasta que el precipitado sedimente. El color del óxido cuproso es también diferente, tendiendo
más a rojo ladrillo que al pardo naranja obtenido en la prueba de Benedict.
Instrumentos:
Reactivos:
 Disoluciones de carbohidratos
 Reactivo de Barfoed
Procedimiento:
A 2 mL del reactivo de Barfoed añadir 1 mL de la solución problema, hervir durante 5 min y dejar
reposar. La aparición de un precipitado rojo, antes de los 6 min indica la presencia de un
monosacárido. La aparición de un escaso precipitado rojo, entre 9 y 12 min indica la presencia de
lactosa o maltosa.
1.2.9 Prueba de Benedict.

Una de las reacciones más comunes en la identificación de carbohidratos, es la reacción de Benedict.
Esta reacción es especifica para azúcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los
monosacáridos poseen un grupo reductor libre. Los disacáridos maltosa y lactosa tienen grupos
reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus
componentes cuando ésta es formada. Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu
(2+) en un medio alcalino. Este Cu (1+) se oxida y precipita en forma de Cu 2O, lo que proporciona la
coloración positiva de la reacción. La coloración dependerá de la concentración de óxido de cobre y
ésta a su vez de la reducción del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo
de la coloración.
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Instrumentos:
 Pipetas de varios volúmenes
 Baño María en ebullición
Reactivos:
 Reactivo de Benedict
 Soluciones de carbohidratos
Procedimiento:
Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de reactivo de Benedict y 4 ó 5 gotas de solución del azúcar.
Caliente a ebullición por 5 min y observe el cambio producido durante el calentamiento. Deje enfriar a
temperatura ambiente. Un precipitado cuya coloración varía entre amarillo, anaranjado, rojo o
verdoso, con decoloración de la solución, indica prueba positiva.
1.3 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE DISACÁRIDOS
1.3.1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa

La sacarosa es un disacárido no reductor y durante la hidrólisis (ácida o enzimática) su molécula se
descompone en glucosa y fructosa:
β
α
β
H H OH
C CH2OH C CH 2OH
O
H C OH C H C OH HO C
HO C H HO C H HO C H HO C H
H C OH O H C OH O +HOH H C OH O + H C OH O
H C H C H C H C
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
Sacarosa -D- glucosa -D-fructosa

1,2- -D-glucosido- -D-fructósido
La sacarosa da con el sulfato de cobalto en un medio alcalino un complejo de color violeta.
Instrumentos:
Reactivos:
 Sulfato de cobalto, disolución al 2%
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Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 2 a 3 mL de disolución de sacarosa, se añaden varias gotas de
disolución de sulfato de cobalto. Al añadir exceso de hidróxido sódico (1 mL), el líquido adquiere un
color violeta.
1.3.2 Hidrólisis ácida de la sacarosa

La sacarosa puede ser hidrolizada por un ácido o su enzima sacarasa.
Instrumentos:
 Soporte de tubos de ensayo
 Baño de agua
Reactivos:
 Disolución de sacarosa al 2 %
 Ácido clorhídrico concentrado
 NaOH, disolución al 10 %
 Reactivo de Fehling
Procedimiento:
A 2 mL de disolución de sacarosa al 2 %, añadir 3 a 6 gotas de HCl concentrado. Calentar a
ebullición durante 5 minutos en Baño María, neutralizar con NaOH al 10 %. Realizar la reacción de
Fehling, observar la aparición de un precipitado rojo ladrillo debido a la presencia de azúcares
reductores (glucosa y fructosa).
1.3.3 Hidrólisis enzimática de la sacarosa
Instrumentos:
 Soporte de tubos de ensayo
 Baño de agua
Reactivos:
 Disolución de sacarosa al 2 %
 Sacarasa, disolución al 10%
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 a 3 mL de sacarosa y se añaden de 2 a 3 mL de sacarasa. El
contenido del tubo se mezcla y se lleva a incubación durante 10 min en el baño de agua a 37ºC.
Colocar al tubo 2 mL de Fehling y se calienta a ebullición en Baño María. Observar la aparición de un
precipitado rojo ladrillo debido a la presencia de azúcares reductores (glucosa y fructosa).
16
1.3.4 Reacciones de reconocimiento de la maltosa y lactosa
La maltosa y lactosa son disacáridos reductores:
α
β
H OH
H C H OH H
C H C OH C C
H C OH OH C H H C OH H C OH
HO C H HO C H HO C H
H C OH O O H C O H C O O HO C H O
H C H C H C H C
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
Maltosa Lactosa
(1,4- -D-glucosido- -D-glucosa) (1.4- -D-galactosido- -D-glucosa)
1.3.5 Reacciones de reducción de iones metálicos

La reacción positiva con el hidróxido cúprico, con el licor de Fehling y las sales de bismuto se explica
por la presencia en las moléculas de maltosa y lactosa del grupo aldehído libre. Las reacciones de
reducción de los iones metálicos transcurren con los disacáridos algo más lentamente que con los
monosacáridos.
Reactivos:
 Maltosa, disolución al 1%
 Lactosa, disolución al 1%
 Lo demás, igual que para el análisis de los monosacáridos
1.4 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE POLISACÁRIDOS
1.4.1 ALMIDÓN: Reacciones coloreadas del almidón

Una reacción característica para reconocer el almidón es la aparición de una coloración azul al
combinarse con la disolución de iodo en ioduro potásico. La reacción de los polisacáridos, en
particular del almidón, con iodo es un proceso complejo. La coloración que aparece depende de la
estructura de polisacárido. En el curso de la reacción se forma un complejo de polisacárido con yodo.
Este proceso es bien expresado en el caso de la amilosa.
En el caso de polisacáridos de cadenas ramificadas, por ejemplo, la amilopectina y el glicógeno, junto

con el proceso de formación del complejo, tiene gran importancia también el proceso de adsorción de
iodo sobre la superficie de las moléculas ramificadas. Se ha demostrado la relación entre la longitud
de las cadenas laterales y la coloración resultante de la reacción con iodo (B. N. Stepanenko).
Instrumentos:
17
Reactivos:
 Almidón, disolución al 1%
 Disolución de lugol
 Alcohol etílico
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 mL de disolución de almidón y se añade 1 gota de disolución
de Lugol. El líquido se colorea de azul.
El contenido del tubo de ensayo se divide en tres partes:

 a la primera parte se añade 1 ó 2 mL de disolución de hidróxido sódico,
 a la segunda, 2 ó 3 mL de alcohol etílico y
 la tercera parte se calienta.
La coloración desaparece siempre. En la tercera muestra la coloración vuelve a aparecer después del
enfriamiento. Esto indica que la prueba con iodo debe realizarse sólo con disolución de almidón fría.
Debido a la inestabilidad del complejo de adsorción entre iodo y almidón, esta reacción es sensible a
la presencia de alcohol, al calentamiento y a la acción de los álcalis con los cuales el iodo forma
hipoioditos.
1.4.2 Hidrólisis ácida escalonada del almidón

En el curso del calentamiento del almidón con ácido clorhídrico diluido, él se descompone con la
formación de los fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas. Éstas se distinguen entre sí en
cuanto a la masa molecular y al carácter de la coloración que surge al tratarlas con la disolución de
iodo. Más abajo se da el esquema de la hidrólisis ácida del almidón:
Almidón
 HCl diluido, t = 100 °C 1 ó 2 min
Amilodextrinas + I2  coloración violeta azul

Eritrodextrinas + I2  coloración rojiparda

Acrodextrinas  no dan coloración

Maltodextrinas  no dan coloración

Maltosa  no da coloración

Glucosa  no da coloración
Instrumentos:
 Pipetas
18
Reactivos:
 Ácido clorhídrico concentrado
 Disolución de Lugol
 Papel de tornasol
 Licor de Fehling
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten de 8 a 10 mL de disolución de almidón y se añaden 8 gotas de HCl
concentrado. Se mezcla cuidadosamente y se hierve a fuego abierto. Luego de 1 ó 2 minutos iniciada
la ebullición se toma una muestra para la reacción con yodo. Para esto se extraen varias gotas de
disolución con una pipeta y se vierten en un tubo de ensayo que contenga 5 ó 6 mL de agua
destilada, se añaden 1 ó 2 gotitas de disolución de Lugol. La coloración violeta azul aparecida indica
la presencia de las amilodextrinas en la disolución. El tubo de ensayo con la disolución de almidón se
hierve 1 ó 2 minutos más y se repite la misma prueba con yodo; aparece una coloración rojiparda
condicionada por la presencia de las eritrodextrinas. Se hierve nuevamente la disolución y pasado los
2 ó 3 minutos se repiten las pruebas con iodo. El almidón se desintegra al final hasta glucosa,
produciendo como productos intermedios acrodextrinas, maldodextrinas y maltosa. La reacción con
iodo será negativa: cuando el líquido adquiere un color amarillo a cuenta de la coloración de la
disolución de Lugol.
El hidrolizado de almidón se neutraliza, según un papel de tornasol, con disolución de hidróxido
sódico, se añade el licor se Fehling y se calienta. Se forma un precipitado amarillo de hidróxido
cuproso, o rojo, de óxido cuproso, lo que indica la presencia en la disolución de productos de la
hidrólisis que poseen propiedades reductoras.
1.4.3 Hidrólisis enzimática del almidón

Bajo la influencia de la enzima amilasa el almidón se desdobla con la formación de un disacárido, la
maltosa, que luego se descompone por la maltasa hasta la glucosa.
Instrumentos:
 Pipetas
 Baño María con termómetro
Reactivos:
 Preparado de saliva (1 ó 2 mL de saliva se coloca en un vaso y se diluyen 5 veces con agua
destilada, se mezclan cuidadosamente)
 Amilasa comercial
 Los demás reactivos son los mismos que en el experimento anterior
19
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten de 1 mL de disolución de almidón, al primer tubo se añade 2 mL
de saliva, se mezcla cuidadosamente, al tubo dos se añade 1 mL de amilasa comercial. Ambos tubos
se llevan a baño María durante 10 o 15 minutos a una temperatura de 37 a 40° C.
Se hacen repetidamente las pruebas con yodo, la ausencia de la coloración característica demuestra
que la hidrólisis ha finalizado. La presencia de la glucosa se confirma por la reacción positiva con el
color de Fehling.
1.5 IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES
1.5.1 Preparación de las muestras a analizar: extracción de carbohidratos
1.5.1.1 A partir de frutas

Quitar la corteza de una manzana, licuar con 50 mL de agua destilada, filtrar y conservar el extracto
para reacciones de identificación de carbohidratos.
1.5.1.2 A partir de leche

A 20 mL de leche añadir gotas de limón o 1/8 de pastilla de cuajo, dejar reposar hasta que se
produzca separe el suero de la leche por acción del ácido o de la enzima que contiene la pastilla de
cuajo, centrifugar, el suero sirve para las reacciones de identificación de carbohidratos.
1.5.1.3 A partir de tusa de maíz

Rallar finamente la tusa de maíz, y suspenderla en 10 mL de agua.
1.5.1.4 Jarabe de maíz

Licuar los granos de un choclo tierno con 250 mL de agua destilada.
1.5.2 Reacciones de identificación
Instrumentos:
 Baño de agua
 Pipetas
Reactivos:
 α-naftol o timol
 Reactivo de Selivánov
 Reactivo de Benedict
20
1.5.2.1 Reacción de Molisch
Esta es una reacción cualitativa que sirve para determinar la presencia de carbohidratos en una
muestra desconocida.
En 9 tubos de ensayo correctamente identificados, colocar 2 mL de las siguientes sustancias:
glucosa, lactosa, sacarosa, filtrado de manzana, arabinosa, suero de leche, jarabe de maíz y almidón.
Se añade 1 ó 2 mL de α-naftol o timol y luego se adiciona ácido sulfúrico concentrado. La presencia
de carbohidratos se detecta por la aparición de un anillo de color violeta en el caso del α-naftol y rojo
en el caso del timol. El anillo aparece en la interfase.
1.5.2.2 Reacción de Benedict

Mezclar 1 mL de muestra (todos los extractos y las soluciones indicadas para la reacción de Molisch)
más 1 mL de reactivo de Benedict, calentar el tubo en baño de agua hirviente, si se produce un
precipitado rojo ladrillo, la reacción es positiva para azúcares reductores.
1.5.2.3 Reacción de Selivánov

En 6 tubos de ensayo colocar 2 mL de Selivánov añadir 5 gotas de distintas soluciones a cada uno.
Calentar por 2 minutos en baño de agua hirviente y observar la coloración roja del líquido. Las
cetosas dan positivo máximo hasta los 2 minutos. Las aldosas necesitan mayor tiempo para que se
produzca la reacción.
21
1.6 PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA CARBOHIDRATOS
α-NAFTOL 0.2 %
Disolver 0.5 g de α-naftol en 50 mL de alcohol etílico.
TIMOL 1 %
Disolver 1 g de timol en 100 mL de alcohol etílico.
NAFTORRESORCINA 1 %
Disolver 1 g de naftorresorcina en 100 mL de alcohol etílico.
REACTIVO DE LA ANTRONA 0.2 % y H2SO4

Disolver 0.1 g de antrona en 2.5 mL de etanol absoluto y llevar a un volumen final de 50 mL con
H2SO4 al 75 % agitar con mucho cuidado. Preparar en el momento y conservar a 4 °C en frasco
ámbar.
REACTIVO DE FEHLING
FEHLING A: Disolver 34.65 g de cristales no aireados de CuSO 4.5H2O en una porción de agua
destilada y llevar este volumen a 500 mL.
FEHLING B: Disolver 173 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) en una porción de agua
destilada, se añaden 62.5 g de sosa cáustica disuelta en 100 mL de agua destilada; mezclar bien
estas dos soluciones y llevar a 500 mL.
REACTIVO DE NYLANDER
Disolver 2 g de nitrato dibásico de bismuto y 4 g de tartrato de sodio y potasio (sal de Rochelle) en
100 mL de sosa cáustica al 10% y se hierven hasta disolver la mayor parte de la sal de bismuto. El
precipitado formado se enfría y se separa por filtración.
REACTIVO DE SELIVÁNOV
Se disuelven 0.05 g de resorcina en 100 ml de ácido clorhídrico al 20%, conservar en un frasco
ámbar.
REACTIVO DEL BIAL

Disolver 1.5 g de orcinol en 500 mL de HCl concentrado, agregar a esta solución 20 a 30 gotas de
FeCl3 al 10 %. Guardar el reactivo en frasco ámbar.
REACTIVO DE ORCINA
Se prepara disolviendo 0,2 g de orcina en 100 mL de ácido clorhídrico al 30% y añadiendo 0,1 g de
cloruro férrico.
22
REACTIVO DE BARFOED
Disolver 13.3 g de acetato de cobre en aproximadamente 200 mL de agua destilada y agregar 1.8 mL
de ácido acético glacial. Filtrar si es necesario. Este reactivo no se lo debe guardar.
REACTIVO DE BENEDICT
Consta de 3 soluciones:
Solución 1: pesar 100 g de NaCO3 anhidro y disolver en 200 mL de agua destilada hervida.
Solución 2: pesar 175 g citrato de sodio y disolverlo en 200 mL de agua destilada hervida.
Solución 3: Pesar 17.3 g de CuSO4.5H2O y disolverlo en 300 mL de agua destilada hervida.
Mezclar las tres soluciones cuando estén frías. Aforar a 1 L con agua destilada hervida.
REACTIVO DE LUGOL
En 100 mL de agua destilada se disuelven 20 g de yoduro de potasio y 10 g de yodo. Para le reacción
con el almidón, la disolución obtenida se diluye con agua destilada en proporción 1:5.
23
CAPITULO II
2. LIPIDOS
2.1 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS

Se denomina lípidos un grupo numeroso de sustancias constituidas como los ésteres y
caracterizadas por su solubilidad en disolventes orgánicos y por su insolubilidad en agua. A ellos
pertenecen los glicéridos (grasas), las ceras, los esteroles (estearinas), fosfolípidos y glicolípidos
(cerebrósidos, gangliósidos).
Los lípidos desempeñan un papel muy importante en calidad de componentes estructurales de las
membranas celulares, como fuente de energía, disolvente para las sustancias orgánicas y como
precursores de otros componentes de la célula (vitaminas del grupo D, ácidos biliares y hormonas de
naturaleza de esteroides).
En el organismo de los animales casi todos los lípidos se encuentran en complejo con las proteínas,
los hidratos de carbono y otras sustancias.
2.2 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS GRASAS
2.2.1 Reacción de la grasa y el aceite con el reactivo de Sudán III

Las grasas se colorean en rojo anaranjado por el colorante denominado Sudán III. El colorante Sudán
III se aplica en las investigaciones histológicas para localizar las grasas en los tejidos.
Instrumentos:
 Vidrio reloj o placas de vidrio
Reactivos:
 Sudán III, disolución al 0,2%
 Aceite vegetal
Procedimiento:
PARTE 1: Sobre el vidrio de reloj se aplica una gota de aceite, se añade una gota se Sudán III y se
mezcla. Se observa la aparición de una coloración naranja de la mezcla.
PARTE 2: En un tubo de ensayo colocar 2 mL del aceite, añadir 4 a 5 gotas del reactivo de Sudán III,
agitar el tubo y dejar reposar. Se observa que todo el aceite aparece teñido cuya coloración es rojo-
anaranjado.
24
2.2.2 Determinación de la glicerina en las grasas
En el curso del calentamiento de una grasa en presencia de agentes deshidratantes, en particular, de
hidrosulfatos de potasio o sodio se desprenden fácilmente de la glicerina dos moléculas de agua, y
ella se convierte en acroleína, que es un aldehído no saturado.
H OH H O
H C C C H H2C CH C H + 2H2O
OH Acroleína
OH H
Glicerina
La reacción de formación de la acroleína se hace con el propósito de reconocer la glicerina libre o

ligada en la molécula de grasa. Los lípidos que no contienen glicerina (ceras, esterinas,
inositolfosfolípidos y esfingolípidos) dan reacción de acroleína negativa.
Instrumentos:
 Mechero de gas o infernilla
Reactivos:
 Grasa o aceite vegetal
 Cera de abeja
 Hidrosulfato potásico (sódico), cristalino
Procedimiento:
El experimento debe realizarse en la campana de humos. En un tubo de ensayo se vierten 8 a 10
gotas de aceite, en el otro se pone de 0,3 a 0,5 g de cera. En ambos tubos se añade
aproximadamente 1 g de hidrosulfato potásico. La mezcla en los tubos de ensayo se calienta, con
cuidado pero fuertemente. La formación de la acroleína en el tubo de ensayo con la grasa se
reconoce por la aparición de un olor característico, acre intenso. En el otro tubo de ensayo no se
forma acroleína.
2.2.3 Solubilidad de las grasas

Las grasas son insolubles en agua; cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequeñísimas
gotitas formando una “emulsión” de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece por
reposo. Por el contario las grasas son solubles en disolventes orgánicos como éter, benceno, xilol,
cloroformo, etc.
Instrumentos:
25
Reactivos:
 Aceite de girasol
 Alcohol etílico
 Compuestos orgánicos: benceno, cloroformo, acetona ó hexano
Procedimiento:
En 6 tubos de ensayo se vierten 5 a 7 gotas de aceite de girasol. En el primer tubo se añaden 2 mL
de agua, en el segundo 2mL de alcohol, en el tercero 2 mL de benceno, en el cuarto 2 mL de
cloroformo, en el quinto 2 mL de acetona y en el sexto 2 mL de hexano. La mezcla de los tubos de
ensayo se agita enérgicamente. Se observan los siguientes cambios: en el primer tubo se forma una
emulsión inestable que se separara rápidamente; en el segundo, una disolución turbia, que indica la
mala solubilidad del aceite en alcohol; en el tercero, cuarto, quinto y sexto tubos de ensayo se forman
disoluciones transparentes debido a una buena solubilidad del aceite en estos disolventes.
Tabla 2-1 Solubilidad de los lípidos

Solvente
Lípido
2.2.4 Determinación de la temperatura de fusión

La temperatura de fusión de una grasa es uno de los indicadores que permite, en cierta medida,
juzgar sobre su asimilamiento. Las grasas que funden a baja temperatura se emulsifican más
fácilmente y, en consecuencia, se asimilan con mayor facilidad.
La temperatura de fusión de los glicéridos es condicionada por sus ácidos grasos constituyentes.
Como regla, el punto de fusión de la grasa es tanto más bajo, cuanto más alto es el contenido de los
ácidos de cadena corta o no saturados.
A la temperatura ambiente las grasas de origen vegetal son líquidos, puesto que en su composición la
cantidad de ácidos grasos no saturados alcanza un 95 ó 97%. En la composición de las grasas
sólidas poco fusibles de origen animal prevalecen los ácidos grasos de cadenas de carbono largas.
Las grasas naturales no poseen un punto de fusión determinado, ya que no son sustancias químicas
individuales, sino mezcla de diferentes glicéridos, ácidos grasos libres, pigmentos, vitaminas y otras
sustancias.
La temperatura de fusión de las grasas depende de la especie del animal y oscila dentro de los
límites siguientes:
26
Especie Temperatura de fusión (ºC)
Ovejas 49 – 54
Venados 48 – 52
Ganado vacuno 48 – 50
Cabras 46 – 48
Camellos 36 – 48
Cerdos 37 – 45
Caballos 28 – 32
Perros 23 – 27
Conejos 22--25
Instrumentos:
 Capilar de vidrio de 1,5 ó 2 mm en diámetro
 Termómetro
 Tubo de ensayo
 Vaso de precipitación
 Lupa
Reactivos:
 Grasa de origen animal (fundida y filtrada)
 Manteca de cacao
 Cera de abeja
 Mantequilla o margarina
Procedimiento:
El capilar limpio y seco se llena de grasa a una altura de unos 2 cm y se mantiene durante 1h sobre
hielo o en agua corriente fría. Terminando el enfriamiento, la parte del capilar llenada de grasa se
corta, dejando la columna de grasa de 0,5 cm de altura. El capilar se ajusta mediante un anillo de
goma en la parte inferior del termómetro de tal manera que su punta llena de grasa sea dirigida hacia
arriba y su otro extremo libre de grasa, hacia abajo. El termómetro con capilar se mete en el tubo de
ensayo donde se ajusta con ayuda de un tapón. El tubo de ensayo se sumerge en el vaso con agua y
se sujeta en la patilla del soporte en posición vertical. El nivel de agua en el vaso debe ser más alto
que el término superior del capilar. El agua se calienta poco a poco, removiéndola frecuentemente, y
a través de la lupa se observa el aumento de la temperatura y el estado de la columna de grasa en
los capilares. La indicación del termómetro en el momento cuando la grasa empiece a fluir por el
capilar y en la parte superior de este último se forme un espacio libre, se anota como la temperatura
de fusión.
Entre el inicio y el final de la transición de la grasa desde el estado sólido al líquido transcurre cierto
tiempo. Por lo tanto, para evitar errores, la temperatura de fusión de la grasa se determina por lo
menos dos veces, y el resultado se calcula como promedio.
27
2.3 DETERMINACION DE LOS INDICES (CONSTANTES) DE LAS GRASAS Y ACEITES
Sobre la naturaleza y la calidad de una grasa se puede juzgar a partir de sus constantes físicas y
químicas o sus números (índices), las constantes físicas de las grasas más importantes son sus
temperaturas de fusión y de endurecimiento y la viscosidad; entre las químicas se destacan:
 número acídico o índice de acidez
 índice de yodo
 número o índice de acetilo (índice de éster) y
 número o índice de saponificación.
2.3.1 Determinación del número acídico

El número acídico caracteriza la presencia de ácidos grasos libres en la grasa. El número acídico se
expresa en cantidad de mg de hidróxido de potasio necesarios para neutralizar los ácidos grasos
libres contenidos en 1 g de grasa o aceite.
El índice es uno de los indicadores más importantes de la calidad de la grasa. El número acídico de la
grasa fresca de distintos tipos no sobrepasa, comúnmente, una magnitud de 1,2 a 3,5. En el curso de
almacenaje de la grasa tiene lugar la hidrólisis de los glicéridos y acumulación de los ácidos grasos
libres. Una elevada acidez de una grasa indica la pérdida de su calidad.
Instrumentos:
 Balanza analítica
 Matraz Erlenmeyer 250 mL
 Bureta
 Pipetas de 1 y 10 mL
Reactivos:
 Mezcla neutralizada de alcohol con éter
 Hidróxido potásico, 0,1 N
 Fenolftaleína, disolución 0,1%
Procedimiento:
En el matraz erlenmeyer se vierte 1 g de aceite de girasol, se añaden 10 mL de mezcla de alcohol
con éter, el contenido se agita cuidadosamente. Se agregan 2 ó 3 gotas de fenolftaleína, y la
disolución se valora rápidamente con la disolución de hidróxido potásico 0,1 N, con agitación
vigorosa, hasta la aparición de una coloración rosa que persista más de 1 minuto.
El número acídico se calcula según la fórmula:

a ∗ 5,6 ∗ K
𝑥=
c
28
Donde: x  es el número acídico, en mg
a  es el volumen de KOH 0,1 N consumido para la valoración de la muestra, en mL
5,6  es la cantidad de hidróxido potásico (mg) que contiene 1 mL de disolución de KOH;
K  es el coeficiente de corrección de la disolución KOH 0.1 N
c  es la muestra pesada de aceite, en g
2.3.2 Determinación del índice de iodo

Se denomina índice de iodo la cantidad de g de iodo que pueden combinarse con 100 g de grasa.
Este número permite evaluar el grado de no saturación de la grasa provocada por la presencia de
glicéridos con ácidos grasos de dobles enlaces, la capacidad de la grasa para la oxidación, para la
reducción y otras reacciones. Cuando mayor es el contenido de ácidos grasos no saturados en la
grasa, tanto mayor es su índice de iodo.
El índice de iodo de algunas grasas y aceite oscila dentro de los siguientes límites:
Grasa/Aceite Índice de iodo
Res 27 - 47
Carnero 31 - 46
Cerdo 46 - 66
Aceite de girasol 129 - 136
Aceite de cáñamo 145 - 162
Aceite de linaza 175 - 201
Principio del método: La determinación del índice del iodo se basa en la reacción de adición del
iodo al lugar de ruptura de los dobles enlaces en las moléculas de ácidos grasos, que se verifican
cuantitativamente según el esquema:
R CH CH R I2 HOH R CH HC R HI
I OH
El iodo que no ha reaccionado se valora con tiosulfato.
Instrumentos:
 Matraces erlenmeyer de 50 mL con tapones
 Bureta
 Pipeta volumétrica de 10 mL
Reactivos:
 Cloroformo
29
 Iodo, disolución 0,1 N en alcohol
 Tiosulfato sódico, disolución 0,1 N
Procedimiento:
En un matraz (prueba experimental) se pone 0,1 de aceite de girasol (se pesa en una balanza
analítica), en el otro (prueba de control) 0,1 mL de agua, y se añaden de la bureta 5 mL de cloroformo
en cada uno. Cuando la muestra de aceite se disuelta, en los matraces se añaden 10 mL con la
pipeta (¡Exactamente!) de disolución 0,1 N de iodo en alcohol, los matraces se cierran con tapones, el
contenido se remueve agitándolo, y los matraces se dejan en la oscuridad.
Al cabo de 5 min las pruebas se evalúan, valorando con disolución de tiosulfato sódico 0,1 N, primero
hasta que la coloración se ponga amarilla clara, y luego, al añadir 1 mL de disolución de almidón al
1%, hasta la fase incolora.
El índice de yodo (x, g) se calcula según la fórmula.

(b − a) ∗ K ∗ 0.01269
𝑥= ∗ 100
c
Donde:
b  volumen de tiosulfato sódico 0,1 N, consumidos en la valoración de la prueba de control,
en mL
a  volumen de tiosulfato sódico 0,1 N consumidos en la valoración de la prueba
experimental, en mL
K  es el coeficiente de corrección del título de la disolución 0,1 N de tiosulfato sódico
0,01269  es la cantidad de iodo (g) equivalente a 1 mL de tiosulfato sódico 0,1 N
100  es el coeficiente de recuento para los 100 g de grasa
c  es la muestra pesada de grasa, g.
2.3.3 Determinación del número (índice) de saponificación

Número de saponificación se denomina el número de mg de hidróxido potásico que se necesitan para
neutralizar todos los ácidos grasos (libres y ligados en forma de glicéridos) que se contienen en 1 g
de grasa o aceite.
El número de saponificación de algunos aceites y grasas de buena calidad tiene los valores
siguientes:
Grasa Índice de saponificación
Grasa de buey 190 - 200
Grasa de carnero 192 - 198
Manteca de cerdo 193 - 200
Manteca de vaca 212 - 247
Aceite de linaza 187 - 195
30
Instrumentos:
 Baño María
 Matraces Erlenmeyer de 50 mL con refrigerantes de reflujo
 Bureta
 Pipetas graduadas de 1 mL
Reactivos:
 Hidróxido potásico, disolución alcohólica 0,5 N
 Ácido clorhídrico, disolución 0,5 N
 Fenolftaleína, disolución al 0,1%
Procedimiento:
En un matraz (prueba experimental) se pone 0,5 g aceite de girasol, en el otro (prueba de control) 0,5
mL de agua, y en cada uno se añaden con la bureta 15 mL de disolución alcohólica de hidróxido
potásico 0,5 N.
A los matraces se conectan los refrigerantes de reflujo, y la mezcla se calienta con agitación gentil en
el baño María hasta la ebullición débil durante 30 ó 40 min.
Terminada la saponificación, a cada matraz se le añaden 4 gotas de fenolftaleína en cada uno, y su
contenido se valora con disolución de ácido clorhídrico 0,5 N hasta la desaparición de la coloración de
rosa.
El número de saponificación se determina según la fórmula:

(b − a) ∗ K ∗ 28.05
𝑥=
c
Donde: x  es el número de saponificación, g

b  volumen de HCl 0,5 N consumido en la valoración de la prueba de control, mL
a  volumen de HCl 0,5 N consumido en la valoración de la prueba experimental, mL
28,05  es la cantidad de KOH en mg que corresponde a 1 mL de HCl 0,5 N
K  el coeficiente de corrección del título de la disolución de HCl 0,5 N
c  es la muestra pesada de grasa, g
2.3.4 Determinación del índice (número) de éster

Se denomina número de éster el número de miligramos de hidróxido potásico que se necesita para
neutralizar los ácidos grasos formados en el curso de la saponificación de 1 g de grasa.
Este número se determina por la diferencia entre el número de saponificación de la grasa y su
número acídico.
31
2.4 EMULSIFICACIÓN DE LAS GRASAS
A la acción de las enzimas del tracto gastrointestinal y de los tejidos son accesibles las grasas que se
encuentran en estado emulsificado. En el tacto gastrointestinal existen las condiciones para
transformar las grasas en emulsión, y los estabilizadores (emulsionantes) principales de ésta son las
sales de ácidos biliares, las proteínas, los fosfolípidos, jabones e hidrocarbonatos de metales
alcalinos. Las moléculas de los emulsionantes se adsorben en la capa exterior de las gotitas de grasa
y disminuyen bruscamente la tensión superficial en el contacto de las fases, lo que se traduce en un
aumento de la estabilidad de la emulsión. Cuando ocurre esto, los grupos hidrófobos se disuelven en
la grasa, favoreciendo a su atomización en gotas menudas, esto es, a la emulsificación.
Instrumentos:
Reactivos:
 Bilis diluida dos veces
 Disolución de proteína
 Jabón, disolución al 1%
 Hidrocarbonato sódico disolución al 1%
 Lecitina
Procedimiento:
Se toma 6 tubos de ensayo. En los dos primeros tubos se vierte 1 mL de agua, en el tercero 1 mL de
bilis, en el cuarto 1 mL de disolución de proteína, en el quinto 1 mL de disolución de jabón, en el sexto
1 mL de disolución de hidrocarbonato sódico. En el segundo tubo de ensayo se introduce un pedacito
de lecitina. En cada tubo de ensayo se añaden 5 gotas de aceite de girasol, los tubos se agitan
enérgicamente y se dejan en reposo durante 5 min. En todos los tubos, menos en el primero, se
forman emulsiones estables.
2.5 HIDRÓLISIS DE LOS GLICÉRIDOS CON LIPASA

En el organismo las grasas se digieren bajo la acción de una enzima, la lipasa, que se contiene en los
jugos gástricos, del páncreas y de los intestinos. La lipasa cataliza el desdoblamiento hidrolítico de las
grasas en glicerina y ácidos grasos libres:
O
R1 C
O
OH
H2C O R1 H2C OH
O O
3 HOH HC OH R2 C
HC O R2
OH
O
O
H2C OH
H2C O R3
R3 C
OH
32
En éste proceso desempeñan un papel importante los ácidos biliares que no sólo participan en la
emulsificación y adsorción de las grasas, sino que también activan la lipasa.
El principio del método. Sobre la actividad de la enzima se juzga por el incremento en el medio de
incubación de los ácidos grasos libres que se liberan en el curso de la descomposición de la grasa
por la lipasa pancreática. La concentración de los ácidos grasos libres se determina mediante la
valoración con hidróxido sódico por la fenolftaleína.
Instrumentos:
 Vasos químicos de 50 mL
 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
 Pipetas de 1, 2 y 10 mL
 Termostato ajustado a 38ºC
 Bureta
Reactivos:
 Leche hervida y diluida dos veces
 Extracto de páncreas (lipasa)
 Bilis diluida dos veces
 Fenolftaleína, disolución al 0.1%
 Hidróxido sódico, disolución 0,01 N.
Procedimiento:
En dos vasos se pone 10 mL de leche y 1 mL de extracto de lipasa en cada uno. En uno de ellos se
añade 1 mL de agua, en el otro 1 mL de bilis (para activar la lipasa), y el líquido se mezcla
rápidamente aspirándolo con la pipeta y dejándolo derramarse. De cada vaso se toman 2 mL de
mezcla y se traslada en matraces para valoración, se añaden 2 gotas de fenolftaleína y se valora con
la disolución de hidróxido sódico 0,01 N hasta la aparición de una coloración rosada débil. La mezcla
que se quedó en los vasos se incuba en el termostato a 38ºC. Tras cada 15 min, de los vasos se
toman 2 mL de mezcla y se valoran del modo descrito anteriormente.
Resultado de las valoraciones pueden anotarse en la tabla.

Tiempo de Cantidad de hidróxido sódico 0.01 N, mL
toma de las Prueba sin bilis Prueba con bilis
pruebas para Consumida en la Neutralizada por Consumida en la Neutralizada por
la valoración valoración los ácido grasos valoración los ácido grasos
33
La cantidad de álcali consumida para la neutralización de los ácidos grasos libres formados en el
curso de la hidrólisis de la grasa se determina por la diferencia entre los resultados de la primera y las
siguientes valoraciones.
Basándose en los datos obtenidos se traza el gráfico de la acción de la lipasa en el tiempo, con y sin
bilis. En el eje de abscisas del gráfico se pone el tiempo y en el eje de ordenadas el número de mL de
disolución de NaOH 0,01 N consumida en la valoración de los ácidos grasos libres formados
mediante un intervalo de tiempo determinado.
2.6 FOSFOLÍPIDOS
Los fosfolípidos componen uno de los grupos importantes de sustancias semejantes a las grasas
ampliamente distribuidas en las células de los tejidos en el organismo animal. Son esteres complejos
de alto peso molecular en cuya composición entran alcoholes de distintas clases, ácidos grasos
saturados y no saturados, acido fosfórico y una base nitrogenada.
Su fórmula general es la siguiente:

O
H2C O C R1
O
HC O C R2
O
H2C O P O X X  Base nitrogenada
OH
Los fosfolípidos, junto con las proteínas, son los principales componentes de las membranas de las
células y de sus organelas. Los fosfolípidos se distinguen por su capacidad de disolverse en
solventes orgánicos.
2.6.1 Aislamiento de los fosfolípidos

Unos objetos cómodos para el aislamiento y el estudio de la composición química de los fosfolípidos
son el tejido nervioso, la yema de huevo, el hígado, la leche, donde ellos se encuentran en
considerable cantidad.
2.6.1.1 Aislamiento de las lecitinas de la yema de huevo
Instrumentos:
 Vaso químico
 Soporte con tubos do ensayo
 Embudos
 Filtros de papel
 Varilla de vidrio
34
Reactivos:
 Yema de huevo
 Alcohol etílico, al 96%
 Acetona.
Procedimiento:
En el vaso se pone la mitad de una yema, se añaden 20 mL de alcohol caliente y se mezcla con una
varilla de vidrio. La mezcla se enfría y se filtra en un tubo de ensayo seco. Al ser turbio el extracto, la
filtración se repite.
Para detectar la lecitina en el filtrado, en un tubo de ensayo seco se vierten 5 rnL de acetona y se le
añade, gota a gota, el filtrado obtenido. La aparición de turbidez indica precipitación de lecitina. En el
otro tubo de ensayo seco se vierten 3 mL de filtrado y se añade, gota a gota, "agua”. Se forma una
emulsión estable. El filtrado que queda se utiliza para otras reacciones de reconocimientos de las
lecitinas.
2.6.2 Aislamiento de los fosfolípidos del tejido nervioso
Instrumentos:
 Balanza de torsión
 Mortero de porcelana
 Arena de cuarzo
 Matraz erlenmeyer
 Embudos
 Desecador
Reactivos:
 Cerebro de animal
 Éter dietílico
 Acetona
Procedimiento:
El tejido cerebral (de 3 a 4 g) se homogeniza en el mortero con arena de cuarzo, se le añade volumen
5 veces mayor de éter y se extraen en frio los fosfolípidos durante un tiempo de 24 a 48 h. Luego la
disolución etérica se filtra en un matraz erlenmeyer y al filtrado transparente se le añade un volumen
triple de acetona. La lecitina precipitada se separa por filtración, se lava con acetona y se seca en el
desecador sobre ácido sulfúrico. La lecitina obtenida se protege de la oxidación en tubos de ensayo
soldados.
35
2.6.3 Aislamiento del colesterol del tejido nervioso
Instrumentos:
 Estufa
 Mortero de porcelana
 Placa de vidrio
 Espátula
 Embudos
Reactivos:
 Sesos de un animal, desmenuzados en una picadora de carne
 Cloroformo
 Yeso
Procedimiento:
3 g de cerebro desmenuzados se trituran cuidadosamente en el mortero con 6 g de yeso. La masa
espesa obtenida se aplica con la ayuda de la espátula sobre la placa de vidrio en una capa fina y se
seca en el armario secador a 40ºC. La masa reseca se separa de la placa en un mortero seco y se
tritura convirtiéndola en polvo. El polvo se traslada a un tubo de ensayo, se le vierten 6 mL de
cloroformo, se agita cuidadosamente durante 5 min y se filtra. El filtrado obtenido se utiliza para las
reacciones coloreadas de reconocimiento del colesterol.
2.6.4 Reacciones coloreadas del colesterol
El principio del método. Bajo la acción de los agentes deshidratantes el colesterol se transforma en
un hidrocarburo con dobles enlaces conjugados: el colesterileno, que al interaccionar con el ácido
sulfúrico y el anhídrido acético, da compuestos complejos intensivamente coloreados. Reacciones
semejantes son características también para otros esteroles.
Instrumentos:
Reactivos:
 Colesterol: extracto en cloroformo
 Ácido acético glacial
 Anhídrido acético
36
2.6.4.1 Reacción con el ácido sulfúrico (Reacción de Schiff)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo seco se vierte 1 mL de extracto de colesterol en cloroformo y con cuidado, por
la pared, se hace deslizar 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. En el contacto de los líquidos se
observa la aparición de un anillo de color rojo.
2.6.4.2 Reacción con el ácido sulfúrico (Reacción de Salkovsky)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo seco se vierten 1 mL de extracto de colesterol en cloroformo y 1 mL de ácido
sulfúrico, los líquidos se mezclan agitando el tubo de ensayo. Al separarse las capas, el estrato
superior de cloroformo resulta coloreado de rojo y el inferior de un color amarillento con fluorescencia
verde. Si al estrato inferior de líquido se le añade 1 mL de ácido acético glacial, aparece una
coloración roja rosada, mientras que la fluorescencia se mantiene.
2.6.4.3 Reacción con el anhídrido acético y ácido sulfúrico (Reacción de Liebermann

Burkhardt)
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de extracto de colesterol en cloroformo, se añaden 10 gotas de
anhídrido acético, 2 gotas de ácido sulfúrico, y se mezcla todo cuidadosamente. El líquido adquiere
primero una coloración roja, luego una violeta, azul y, por último, verde.
37
2.7 PREPARACION DE REACTIVOS PARA LIPIDOS
REACTIVO SUDAN III

Disolver 200 mg del reactivo Sudán III en 100 mL de alcohol etílico al 70 % calentado en baño María,
mezclar y dejar en reposo durante 24 horas.
MEZCLA NEUTRALIZADA DE ALCOHOL CON ETER

Mezcla de alcohol con éter 1:2 que se neutraliza con disolución 0.1 N de hidróxido de potasio según
la fenolftaleína, hasta la aparición de una coloración rosa pálida que persista 30 segundos.
HIDROXIDO DE POTASIO 0.1 N

Cálculo del peso de KOH p.a. necesario para preparar 1 litro de solución 0.1 N:
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑁=
𝑝𝑒𝑞 𝐾𝑂𝐻 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁 ∗ 𝑝𝑒𝑞 𝐾𝑂𝐻 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 0.1 ∗ 56.11 ∗ 1
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 5.611
Pesar 5.611 g de KOH p.a y aforar a 1 L con agua descarbonatada.
NORMALIZACION DEL KOH

Para valorar el hidróxido de potasio (sodio) se emplea ftalato ácido de potasio.
Cálculo del peso de KHF p.p. necesario para que reaccione con 15 mL de KOH 0.1 N:
# 𝑚𝑒𝑞 𝐾𝐻𝐹 = # 𝑚𝑒𝑞 𝐾𝑂𝐻

# 𝑚𝑒𝑞 𝐾𝐻𝐹 = 15 𝑚𝐿 ∗ (0.1 𝑁)
# 𝑚𝑒𝑞 𝐾𝐻𝐹 = 1.5 𝑚𝑒𝑞
𝑔 𝐾𝐻𝐹 = 𝑚𝑒𝑞 𝐾𝐻𝐹 ∗ 𝑝𝑓𝑔 𝐾𝐻𝐹

204.23
𝑔 𝐾𝐻𝐹 = 1.5 ∗
1000
𝑔 𝐾𝐻𝐹 = 0.3063
PROCEDIMIENTO:
Se procede a secar una cantidad suficiente de ftalato ácido de potasio grado patrón primario durante
2 horas a 110 ºC, después de transcurrido este tiempo enfriar en el desecador.
Pesar varias muestras de 0.7 a 0.8 g en erlenmeyers y disolver en 50–75 mL de agua destilada.
Añadir dos gotas de fenolftaleína, valorar con el KOH hasta que el color rosa del indicador persista
durante 30 segundos. Calcular la normalidad de la base.
38
CALCULO DE LA NORMALIDAD DEL KOH A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS.
𝑔 𝐾𝐻𝐹
𝑁=
𝑝𝑒𝑞 𝐾𝐻𝐹 ∗ 𝑉(𝐿)𝐾𝑂𝐻 𝑒𝑚𝑝𝑙𝑒𝑎𝑑𝑎
𝑝𝑒𝑞 𝐾𝐻𝐹 = 204.23 𝑔
HIDROXIDO DE POTASIO ALCOHÓLICA 0.5 N

Cálculo del peso de KOH p.a. necesario para preparar 1 litro de solución 0.5 N:
𝑁=
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁 ∗ 𝑝𝑒𝑞 𝐾𝑂𝐻 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 0.5 ∗ 56.11 ∗ 1
Pesar 30 g de KOH p.a, disolver en 30 mL de agua destilada, aforar a 1 L con alcohol etílico al 96 %;
al cabo de 24 horas la solución se filtra.
ACIDO CLORHIDRICO 0.1 N

Cálculo del volumen de HCl al 36 % P/P y δ= 1.18 g/cm 3 necesario para preparar 1 L de HCl 0.1 N
𝑁=
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁 ∗ 𝑝𝑒𝑞 𝐻𝐶𝑙 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 0.1 ∗ 36.45 ∗ 1
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 3.645 𝑔 𝐻𝐶𝑙 𝑝𝑢𝑟𝑜
36 g HCl puro  100 g solución HCl concentrado

3.645 g HCl X= 10.125 g
𝑚
𝛿=
𝑉
10.125
𝑉=
1.18
𝑉 = 8.58 𝑚𝐿
Tomar con una pipeta 8.6 mL de HCl concentrado y llevar a volumen de 1 L.
VALORACION DEL HCl 0.1 N

Los ácidos se valoran con cantidades conocidas de Na2CO3.
39
Cálculo del peso de Na2CO3 patrón primario necesario para que reaccione con 23 mL de HCL 0.1 N
# 𝑚𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = # 𝑚𝑒𝑞 𝐻𝐶𝑙

# 𝑚𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = 23 𝑚𝐿 ∗ (0.1 𝑁)
# 𝑚𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = 2.3 𝑚𝑒𝑞
𝑔 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = 𝑚𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 ∗ 𝑝𝑓𝑔 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3

106
𝑔 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = 2.3 ∗
2000
𝑔 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = 0.1219
PROCEDIMIENTO:
Se procede a secar una cantidad suficiente de carbonato de sodio grado patrón primario durante 2
horas a 110 ºC, después de transcurrido este tiempo enfriar en el desecador.
Pesar varias muestras de 0.20 a 0.25 g en erlenmeyers y disolver en 50 mL de agua destilada.
Añadir en cada erlenmeyer 3 gotas de indicador verde de bromocresol, valorar con el HCl hasta que
la solución comience a cambiar de color, de azul a verde.
Hervir la solución por 2 a 3 minutos, enfriar a la temperatura ambiente y completar la titulación.
Calcular la normalidad del ácido.
CALCULO DE LA NORMALIDAD DEL HCl A PARTIR DE LOS DATOS OBTENIDOS.
𝑔 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3
𝑁=
𝑝𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 ∗ 𝑉(𝐿)𝐻𝐶𝑙 𝑒𝑚𝑝𝑙𝑒𝑎𝑑𝑎
𝑝𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝐶𝑂3 = 53 𝑔
ACIDO CLORHIDRICO 0.5 N

Cálculo del volumen de HCl al 36 % P/P y δ= 1.18 g/cm 3 necesario para preparar 1 L de HCl 0.5 N
𝑁=
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁 ∗ 𝑝𝑒𝑞 𝐻𝐶𝑙 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 0.5 ∗ 36.45 ∗ 1

18.225 g HCl X= 50.625 g
𝑚
𝛿=
𝑉
40
50.625
𝑉=
1.18
𝑉 = 42.90 𝑚𝐿
Tomar con una pipeta 43.0 mL de HCl concentrado y llevar a volumen de 1 L. Para realizar la
valoración del ácido, se procede de la misma forma que se realizada para el HCl 0.1 N.
FENOLFTALEÍNA 0.1 %
Se pesan 0.1 g de fenolftaleína y se lleva a 100 mL con alcohol etílico 96%.
IODO 0.1 N EN ALCOHOL

Se pesan 12.691 g de iodo recién sublimado y se disuelven en 1 L de alcohol etílico al 96 %.
TIOSULFATO SÓDICO 0.1 N

Cálculo del peso de Tiosulfato de sodio p.a. necesario para preparar 1 L de Na 2S2O3 0.1 N:
𝑁=
𝑝𝑒𝑞 Na 2 S2 O3 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑁 ∗ 𝑝𝑒𝑞 𝑁𝑎2 𝑆2 𝑂3 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 0.1 ∗ 248.18 ∗ 1
Se pesan 25.0 g de tiosulfato de sodio y se aforan a 1 L, la solución preparada se la conserva en un

frasco ámbar.
NORMALIZACIÓN DEL TIOSULFATO DE SODIO FRENTE A DICROMATO DE POTASIO.

Desecar una cantidad adecuada de dicromato de potasio, a 110 ºC durante dos horas.
Dejar enfriar en el desecador.
Pesar varias muestras de 0.2 a 0.23 g de dicromato de potasio en erlenmeyers, y disolverlos en 80
mL de agua que contiene 2 g de KI.
Añadir 20 mL de HCl 1 M y colocar en un lugar oscuro durante 10 minutos.
Al terminar este tiempo proceder a titular con el Na2S2O3 preparado, en presencia de almidón hasta la
aparición de una coloración blanquecina. Calcular la normalidad de la solución.
CALCULO DE LA NORMALIDAD Na2S2O3 CON LOS DATOS OBTENIDOS
𝑔 𝐾2 𝐶𝑟2 𝑂7 ∗ 1000
𝑁=
𝑚𝐿 𝑁𝑎2 𝑆2 𝑂3 ∗ 49.032
41
ACIDO CLORHIDRICO 1 M
Cálculo del volumen de HCl al 36 % P/P y δ= 1.18 g/cm 3 necesario para preparar 1 L de HCl 1 M
# 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑀= # 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 =
𝑉(𝐿)𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑃𝑀 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
𝑀=
𝑃𝑀 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 ∗ 𝑉(𝐿)𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 𝑀 ∗ 𝑃𝑀 𝐻𝐶𝑙 ∗ 𝑉(𝐿)
𝑔 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = 1 ∗ 36.45 ∗ 1

36.45 g HCl X= 100.25 g
𝑚
𝛿=
𝑉
100.25
𝑉=
1.18
𝑉 = 85.80 𝑚𝐿
Tomar con una pipeta 85.80 mL de HCl concentrado y llevar a volumen de 1 L. Para realizar la
valoración del ácido, se procede de la misma forma que se realizada para el HCl 0.1 N.
DISOLUCION DE PROTEÍNA
Disolución de clara de huevo (de tres huevos de gallina) que se prepara mezclando las claras de
huevo con 700 mL de agua destilada y 300 mL de disolución saturada de cloruro de sodio con
posterior filtración a través de varias capas de gasa.
JABON 1%
Se pesa 1 g de jabón y se lleva a 100 mL
HIDROCARBONATO DE SODIO 1 %
Pesar 1 g de hidrocarbonato de sodio y aforar a 100 mL con agua destilada.
LECITINA
En un vaso se pone la mitad de una yema, se le añaden 20 mL de alcohol caliente y se mezcla con
una varilla de vidrio. La mezcla se enfría y se filtra en un tubo de ensayo seco. Al ser turbio el
extracto, la filtración se repite.
EXTRACTO DE PÁNCREAS
1g de pancreatina comercial se disuelve en 100 mL de disolución de hidrocarbonato sódico al 0,4%.
42
CAPÍTULO III
3. PROTEINAS
Las proteínas son polímeros biológicos de alto peso molecular. Ellas se forman de 20 residuos de
aminoácidos, y de 2 amidas de aminoácido dicarboxílico (asparagina y glutamina). Las proteínas son
los componentes más importantes de las células de todos los tejidos animales.
Ellas desempeñan diferentes funciones en el organismo:

 sirven de material estructural fundamental en la célula
 catalizan todas las reacciones del metabolismo en los tejidos (enzimas, hormonas)
 desempañan un papel protector (anticuerpos)
 junto con los ácidos nucleicos participan en la transferencia genética de los indicios, producen
energía al oxidarse los aminoácidos, etc.
3.1 ENZIMAS
Las enzimas son proteínas que catalizan todas las reacciones bioquímicas. Un catalizador es una
sustancia que disminuye la energía de activación de una reacción química. Al disminuir la energía de
activación, se incrementa la velocidad de la reacción.
La mayoría de las reacciones de los sistemas vivos son reversibles, es decir, que en ellas se
establece el equilibrio químico. Por lo tanto, las enzimas aceleran la formación de equilibrio químico,
pero no afectan las concentraciones finales del equilibrio.
Tipo de enzimas Actividad

Catalizan reacciones de hidrólisis. Rompen las biomoléculas con moléculas
Hidrolasas
de agua. A este tipo pertenecen las enzimas digestivas.
Catalizan las reacciones en las cuales un isómero se transforma en
Isomerasas
otro, es decir, reacciones de isomerización.
Ligasas Catalizan la unión de moléculas.
Catalizan las reacciones de adición de enlaces o eliminación, para
Liasas
producir dobles enlaces.
Catalizan reacciones de óxido-reducción. Facilitan la transferencia de
Oxidorreductasas electrones de una molécula a otra. Ejemplo: la glucosa, oxidasa cataliza la
oxidación de glucosa a ácido glucónico.
Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a otra. Ejemplo:
Tansferasas la transmetilasa es una enzima que cataliza la transferencia de un grupo
metilo de una molécula a otra.
43
3.2 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
3.2.1 Labilidad térmica de las enzimas

La temperatura del medio influye mucho en la actividad de las enzimas. La temperatura óptima para
la acción de las enzimas es la temperatura del cuerpo de los animales que oscila en el intervalo de 36
a 41ºC. Con cierto aumento de la temperatura del medio ocurre aceleración de la reacción a
consecuencia de la activación de las moléculas de sustrato. A la vez, incluso un aumento pequeño de
la temperatura conduce al debilitamiento de los enlaces que mantienen la conformación de la
molécula de enzima, necesaria para la manifestación de su actividad catalítica.
Empieza, gradualmente, la desnaturalización de la enzima que se acelera bruscamente a la
temperatura que sobrepase 50ºC. La inactivación de la enzima con aumento de temperatura del
medio es irreversible. Al bajar la temperatura la enzima disminuye su actividad también.
El mecanismo de este proceso no está claro. Sin embargo, el enfriamiento no causa
desnaturalización de la enzima y por lo tanto su inactivación puede ser reversible.
Principio del método.- Se investiga la influencia del cambio de la temperatura del medio exterior
sobre la actividad de la enzima amilasa de la saliva.
Instrumentos:
 Vaso de 50 mL
 Termostato (37ºC)
 Vaso con hielo
Reactivos:
 Saliva diluida (se enjagua la boca con agua destilada y luego, tomar en la boca de 20 a 25
mL de agua, y colectar en un vasito)
 Amilasa comercial, en disolución
 Cloruro sódico, disolución al 0.3%
 Almidón, disolución al 1% en disolución de cloruro sódico al 0.3%
 Reactivo de Lugol
Procedimiento:
En 3 tubos de ensayo se vierten 2 o 3 mL de saliva diluida (amilasa comercial) en cada uno. La saliva
en el tubo 1 se hierve durante 1 ó 2 min. Luego en todos los tubos se añaden de 4 a 5 mL de
disolución de almidón. Los tubos 1 y 2 se colocan en le termostato a 37ºC, donde se mantienen
durante 10 minutos. El tubo 3 se sumerge en hielo y se mantiene durante 10 min.
Al transcurrir este tiempo, en cada tubo se añade 10 lambdas de reactivo de Lugol. Los resultados del
experimento se anotan en la tabla de labilidad térmica de las enzimas y sacar conclusiones.
44
Tabla 1: LABILIDAD TÉRMICA
Condiciones del Coloración
Nº tubo Enzima Sustrato Incubación
experimento con Iodo
1 Amilasa Enzima desnaturalizada Almidón 10 min, 37ºC
2 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37ºC
3 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 0ºC
3.2.2 Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas

Para cada enzima existe un óptimo del pH a que se crean las condiciones más favorables para el
mantenimiento de la conformación funcionalmente activa de la molécula. Los grupos amino y
carboxílico de los restos de aminoácidos, ionizados a una magnitud de pH determinada, participan en
el mantenimiento de la conformación de la molécula proteínica necesaria para la formación de los
centros catalíticos de enzima y favorecen también a su ligación con el sustrato. A una magnitud de pH
distinta se altera la ionización de los grupos correspondientes, y como resultado se rompen los
enlaces que se aseguran la formación de los centros catalíticos, y la enzima se inactiva. A los calores
de pH muy altos o muy bajos las enzimas se desnaturalizan.
Principio del método.- Se investiga la actividad de la enzima amilasa de la saliva a diferentes

magnitudes de pH del medio.
Instrumentos:
 Pipetas
 Termostato 37ºC
Reactivos:
 Disoluciones amortiguadoras: pH 5,0; pH 6,8 y pH 8,0
Procedimiento:
En 3 tubos de ensayo se vierten de 2 a 3 mL de disoluciones amortiguadoras de distintos pH (5,0; 6,8
y 8,0). En todos los tubos se añaden de 2 a 3 mL de amilasa comercial y de 4 a 5 mL de disolución de
almidón, se mezcla y se incuba durante 10 minutos en el baño de agua a 37ºC. Luego, en cada tubo
se añade 10 lambdas de reactivo de Lugol.
Los resultados de la observación se anotan en la tabla que indica la influencia del pH sobre la
actividad de la amilasa.
45
Tabla 2: INFLUENCIA DEL pH
Coloración con
Nº tubo Enzima pH Sustrato Incubación
Iodo
1 Amilasa 5,0 Almidón 10 min, 37ºC
3.2.3 Especificidad de las enzimas

Las enzimas se distinguen de los catalizadores inorgánicos por su especificidad excepcionalmente
alta. La etapa inicial del acto catalítico consiste en la formación del complejo enzima-sustrato, es
decir, la ligación del sustrato con el centro catalítico de la enzima.
La conformación espacial del centro e sustrato debe estar en la correspondencia geométrica exacta
con la estructura de la molécula de sustrato. Solamente en este caso es posible la formación del
complejo enzima-sustrato y el cumplimiento de la función catalítica de la enzima. De tal modo, la
esencia de la especificidad de las enzimas consiste en el hecho que el sustrato le corresponde a la
enzima, como una llave a cerradura.
Principio del método.- Se investiga la influencia de las enzimas amilasa y sacarasa sobre diferentes
sustratos: el almidón y la sacarosa.
Instrumentos:
 Pipetas
Reactivos:
 Sacarasa, disolución 10 %
Procedimiento:
En los tubos de ensayo 1 y 2 se vierten de 4 a 5 mL de disolución de almidón, en tubos de ensayo 3 y
4, de 4 a 5 mL de disolución de sacarosa. En los tubos 1 y 3 se añaden de 2 a 3 mL de amilasa
comercial, y en los tubos 2 y 4, de 2 a 3 mL de disolución de sacarasa. El contenido de los tubos de
ensayo se mezcla y se incuba durante 10 min en el termostato a 37ºC. Luego en los tubos de ensayo
46
1 y 2 se añade 10 lambdas de reactivo de Lugol, en cada uno y en los tubos de ensayo 3 y 4, de 1 a 2
mL de reactivo de Fehling y se calienta.
Las observaciones se anotan en la tabla la especificidad de las enzimas amilasa y sacarasa.
Tabla 3: ESPECIFICIDAD ENZIMATICA

No. de Coloración Reacción de
Sustrato Enzima Incubación
tubo con Iodo Fehling
1 Almidón Amilasa 10 min, 37ºC
2 Almidón Sacarasa 10 min, 37ºC
3 Sacarosa Amilasa 10 min, 37ºC
4 Sacarosa Sacarasa 10 min, 37ºC
3.2.4 Influencia de los activadores e inhibidores

La regulación de la actividad de las enzimas se realiza, tanto en la célula como fuera de ella,
mediante la fijación sobre la molécula de enzima de una serie de sustancias de bajo peso molecular.
Tales sustancias pueden causar efectos positivos o negativos.
Agentes que causan efecto positivo, o activadores, al adicionarse a la molécula de precursor no
activo, son capaces de cambiar su conformación dando lugar a la formación de un compuesto que
posea una actividad catalítica.
La función de activadores se cumple, con frecuencia, por iones de metales y algunos aniones. Acción
depresiva de los agentes que causan efecto negativo (inhibidores) se realiza mediante la alteración
de la conformación nativa de la enzima. Inhibidores pueden ser las sales inorgánicas, los metabolitos,
las hormonas. El lugar de fijación del agente ala molécula de enzima se denomina centro alostérico.
Principio del método.- Se investiga la actividad de la amilasa de saliva en presencia de sustancias

que poseen propiedades de los agentes positivos y negativos.
Instrumentos:
 Pipetas
 Termostato a 37ºC
Reactivos:
 Cloruro sódico, disolución al 1%
47
Procedimiento:
En 2 tubos de ensayo se vierten de 4 a 5 mL de disolución de almidón. En el tubo 1 se añaden de 1 a
2 mL de disolución de cloruro sódico, en el tubo 2 de 1 a 2 mL de disolución de sulfato cúprico. En
ambos tubos se añaden de 1 a 2 mL de saliva diluida (amilasa), el contenido se mezcla y se incuba
durante 10 min en termostato a 37ºC. Luego en cada tubo se añade 10 lambdas de reactivo de Lugol.
En otros 2 tubos de ensayo se vierten de 4 a 5 mL de disolución de sacarosa. En el tubo 1 se añaden
de 1 a 2 mL de disolución de cloruro sódico, en el tubo 2 de 1 a 2 mL de disolución de sulfato cúprico.
En ambos tubos se añaden de 1 a 2 mL de sacarasa, el contenido se mezcla y se incuba durante 10
min en termostato a 37ºC, trascurrido este tiempo se realiza la prueba de azúcares reductores
(Fehling).
Las observaciones se anotan en la tabla que indica la influencia del cloruro sódico y el sulfato cúprico
sobre la actividad de la amilasa y sacarasa:
Tabla 4: INFLUENCIA DE LOS ACTIVADORES E INHIBIDORES

Nº Coloración Prueba azúcares
Enzima Agente Sustrato Incubación
tubo con Iodo reductores
1 Amilasa NaCl Almidón 10 min, 37ºC
2 Amilasa CuSO4 Almidón 10 min, 37ºC
3 Sacarasa NaCl Sacarosa 10 min, 37ºC
4 Sacarasa CuSO4 Sacarosa 10 min, 37ºC
3.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS
3.3.1 Determinación de la actividad de la dehidrogenasa de ácido succínico.

La deshidrogenasa de ácido succínico (succinato deshidrogenasa) es una enzima que cataliza la
oxidación del ácido succínico. De coenzima sirve el dinucleótido de flavin-adenina (FAD). En las
células la enzima está unida establemente con la membrana de mitocondrias. La enzima reducida
devuelve fácilmente el hidrógeno cuyo aceptor pueden ser los colorantes aptos para la reducción.
Principio del Método: El hidrógeno que se desprende del ácido succínico bajo la influencia de la
enzima deshidrogenasa, reduce al azul de metileno (AM) transformándolo en un compuesto incoloro
(AMH2).
O OH O OH
C C
H2C HC
CH2 FAD FAD H 2
CH
C AM C
AMH2
O OH O OH
Ácido succínico Ácido fumárico
48
Instrumentos:
 Mortero con pistilo
 Arena de vidrio
 Pipetas
Reactivos:
 Músculo fresco (desmenuzado en picadora de carne)
 Ácido succínico, disolución al 3%
 Azul de metileno, disolución acuosa al 0.001%
 Aceite de vaselina o aceite vegetal
 Ácido Tricloroacético, disolución al 20%
Procedimiento:
En el mortero se tritura cuidadosamente, con la arena de vidrio, aproximadamente 1 g de tejido de
músculo desmenuzado, añadiendo 3 a 4 mL de disolución de acido succínico. La masa
homogeneizada obtenida se reparte en dos porciones iguales que se ponen en dos tubos de ensayo.
En el tubo de ensayo 1 (de control) se añade 1 mL de disolución de ácido tricloroacético para destruir
la enzima. En el tubo de ensayo 2 (experimental) la enzima es activa. En ambos tubos se añade 1 ó 2
gotas de disolución de azul de metileno, se mezcla y sobre la superficie del líquido se vierte de 0.5 a
1 mL de aceite para aislar del oxígeno del aire. Ambos tubos de ensayo se incuban en el baño María
a 50ºC durante 10 minutos. Al pasar este tiempo, en el tubo de ensayo 2 se observa la decoloración
del azul de metileno.
3.3.2 Determinación de la actividad de la catalasa en la sangre

Cierta parte de hidrógeno transferido por el sistema de enzimas de oxidación-reducción puede
combinarse con el oxígeno directamente, formando el peróxido de hidrógeno, una sustancia
venenosa para las células. La enzima catalasa, descomponiendo el peróxido de hidrógeno, protege
las células de la acción dañina de este compuesto:
catalasa
2 H2O2 2 H2O + O2
Particularmente sensible a la acción oxidante del peróxido de hidrógeno es la hemoglobina, por lo

tanto la catalasa de eritrocitos tiene una importancia especial en el organismo. La variación de la
actividad de la catalasa ocurre durante el embarazo, en la etapa inicial ésta disminuye, en los últimos
meses aumenta.
Principio del método: De índice de actividad de la enzima sirve el desprendimiento del oxígeno
molecular que se forma en la descomposición del peróxido de hidrógeno por la catalasa de la sangre.
49
Instrumentos:
 Pipetas
Reactivos:
 Sangre entera, tratada con citrato
 Peróxido de hidrógeno, disolución al 3 %
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten de 2 a 3 mL de agua destilada, se añade 1 ó 2 gotas de sangre, y
el contenido del tubo de ensayo 1 (de control) se calienta hasta la ebullición para destruir la enzima.
En el tubo de ensayo 2 (experimental) la enzima permanece activa. En ambos tubos de ensayo se
añade 1 mL de disolución de peróxido de hidrógeno. En el tubo de ensayo 2 se observa un
desprendimiento tempestuoso del oxígeno.
3.3.3 Cuantificación de Amilasa Pancreática

La amilasa, enzima del grupo de las hidrolasas, se produce en las glándulas salivales y en la porción
exocrina del páncreas. Su acción es romper los enlaces alfa 1-4 glucosídicos de los polisacáridos
como el almidón y el glucógeno. Se eleva en procesos inflamatorios pancreáticos, en procesos
infecciosos u obstructivos del tracto gastrointestinal, así como en las parotiditis y paperas. Cuando el
páncreas está enfermo o inflamado, se libera amilasa en la sangre.
Fundamento del método: En este método el sustrato, almidón tamponado se incuba con la
muestras, produciéndose la hidrólisis enzimática, esta se detiene al agregar el reactivo de yodo que al
mismo tiempo produce color con el almidón no hidrolizado. La disminución de color respecto al de un
sustrato control (sin muestra) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en Unidades
Amilolíticas (UA/dL), comparables con las Unidades Sacarogénicas (Somogy/dL).
Instrumentos:
 Tubos vacutainer (Tapa roja)
 Jeringuilla 3 cc y torniquete
 Pipetas y micropipetas
 Espectrofotómetro con cubetas de espectrofotómetro
 Baño María 37 °C
 Centrífuga
Reactivos:
 Almidón tamponado: solución de almidón 500 mg/L, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0.1
mol/L en NaCl 0.15 mol/L.
 Solución de iodo: 0.01 eq/L de iodo en ácido clorhídrico 0.02 mol/L.
50
Procedimiento:
Se lo puede realizar en suero u orina, en caso de usar suero se procede de la siguiente manera:
1. Obtener 3 mL de sangre por punción venosa
2. Centrifugar a 10000 r.p.m. por 10 minutos
3. En un tubo limpio separar el suero
4. En dos tubos marcados como Control (C) el uno y Desconocido (D) el otro, coloque 1 mL de
sustrato
5. Deje en reposo durante 5 minutos en baño de agua a 37 °C.
6. Agregue en el tubo Desconocido (D) 20 µL de suero.
7. Mezcle e incube ambos tubos a 37 °C durante 7 minutos y medio exactos.
8. Agregue en ambos tubos 1 mL de reactivo de yodo.
9. Retire los tubos del baño María y mezcle por agitación suave.
10. Agregue 8 mL de agua destilada a cada tubo.
11. Mezcle por inversión.
12. Lea en un fotocolorímetro con filtro rojo o un espectrofotómetro a 640 nm de longitud de onda,
llevando a cero el equipo con agua destilada.
13. Transforme a absorbancia las lecturas obtenidas.
Cálculos:
C−D
Amilasa UA⁄dL = ∗ 1000
C
Valores Referencia:
En Suero (UA/dL) y orina (UA/hora) condición clínica:
 Normal: menos de 120 y menos de 260
 Pancreatitis aguda, de 300 a 1200, y más de 900
 Pancreatitis crónica, hasta 200, y más de 300
 Parotiditis 200 a 350 y de 350 a 750
 Parotiditis y pancreatitis, más de 350 y más de 750
 Procesos abdominales agudos sin pancreatitis, normal y normal.
3.3.4 Actividad de anhidrasa carbónica

La anhidrasa carbónica, una metaloproteína que contiene zinc, es una enzima que permite la
hidratación del CO2 metabólico para formar Acido Carbónico, así como la reversibilidad de este
proceso:
CO 2 + H2O H2CO 3
AHC
La anhidrasa carbónica se encuentra en los eritrocitos, en las células de los túbulos renales, en la
mucosa gástrica, en la corteza suprarrenal, siempre, catalizando el tipo de reacción descrita. El
plasma no contiene anhidrasa carbónica.
51
El papel de esta enzima es fundamental para el transporte de CO2 desde los tejidos hacia los
pulmones, indirectamente la enzima influye en el mantenimiento del pH sanguíneo, ya que las cuotas
necesarias de bicarbonato son promovidas a partir del Acido Carbónico.
La cistina, el glutatión y la histidina, activan la acción enzimática de la Anhidrasa Carbónica. Por
desnaturalización térmica esta enzima se inactiva en forma irreversible; a bajas temperaturas detiene
su actividad, que la recobra a la temperatura del medio. La zona óptima de temperatura oscila entre
25 y 40 °C.
Instrumentos:
 Tubos de ensayo de 20 mL
 Vaso de precipitación con hielo
 Proveedor de CO2
 Cronometro
 Termómetro
 Pipetas de 5 a 10 mL
Reactivos:
 Indicador (azul de bromofenol al 0.04 %)
 Solución de cloruro de sodio al 0.9 % (Solución fisiológica)
 Bicarbonato de sodio al 5 %
 Anticoagulante
 Agua destilada
Procedimiento:
- Extraiga 3 mL de sangre y viértalos en un tubo de ensayo que contenga anticoagulante,
Mezcle por inversión y lleve luego a centrifugar por 10 minutos para separar el plasma.
- Retire cuidadosamente el plasma y deje en el tubo de ensayo la fracción globular, vierta
sobre los glóbulos 5 mL de solución fisiológica y lleve a centrifugación.
- Retire el sobrenadante y añada sobre la fracción globular 10 mL de agua destilada para
conseguir hemólisis (el agua destilada es hipotónica al eritrocito).
- Tome un tubo de ensayo con 15 mL de agua destilada y disponga en el 0.1 mL del
hemolizado. Rotule el tubo problema.
- En otro tubo de ensayo con 15 mL de agua destilada disponga 0.1 mL del plasma inicial.
Rotule el tubo testigo.
- Lleve los dos tubos a baja temperatura (vasos de precipitación con hielo) hasta los 4 °C,
añadiendo antes 1 mL de indicador azul de bromofenol a cada tubo; la solución toma color
azul.
- Saque del baño de hielo los tubos y añada a cada uno de ellos 0.5 mL de solución de
bicarbonato de sodio al 5 %.
- Mezcle por inversión.
52
- Haga burbujear CO2 en el tubo problema controlando cuidadosamente el tiempo en que se
produzca el cambio de color (al verde) en la solución. Anote el tiempo, repita lo mismo con el
tubo testigo.
Fundamento: La hidratación del CO2 por la acción de la enzima, se puede demostrar burbujeando
CO2 en una solución de bicarbonato que contenga un indicador.
NOTA: Como las enzimas se destruyen rápidamente, es necesario extraer y manipular la sangre con
rapidez y cuidado.
Reacción Química:
CaCO 3 + 2 HCl CO 2 + H2O H2CO 3 + CaCl 2
3.4 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTEÍNAS

Todas las reacciones de reconocimiento de las proteínas se basan en la presencia en ellas de ciertos
grupos químicos, de ciertos enlaces o en las propiedades físico-químicas.
Las reacciones de reconocimiento de las proteínas pueden ser divididos en dos grupos
independientes: reacciones de precipitación y reacciones coloreadas.
Las reacciones de precipitación de las proteínas pueden dividirse en dos subgrupos: la precipitación
de las proteínas sin su desnaturalización (sales de los metales pesados, temperatura, ácidos
minerales y orgánicos, reactivos de reconocimiento de los alcaloides).
3.5 REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
3.5.1 Salificación de las proteínas

En el curso de estas reacciones las proteínas precipitadas no se someten a las alteraciones
profundas, y los precipitados de las proteínas obtenidos (gel) pueden ser disueltos de nuevo en el
mismo disolvente de partida (transformación en sol). Las macromoléculas de las proteínas en este
caso, conservan sus propiedades iniciales (nativas) y no sufren variaciones considerables
(desnaturalización).
La precipitación reversible de las proteínas se logra por adición a las disoluciones acuosas, de las
sales neutras de los metales alcalinos o sales amónicas. A tales sales pertenecen las sustancias
siguientes:( NH4)2SO4, NH4 Cl, Na2SO4, NaCl, KCl, etc. El mecanismo de acción de estas sales sobre
la partícula coloidal se reduce a la adsorción, sobre esta última, de los iones con carga opuesta. De
esta manera, la partícula proteínica se vuelve eléctricamente neutra (sucede la anulación de la
carga), lo que resulta en la disminución de su estabilidad en la disolución. Además, las sales de los
metales alcalinos, al disolverse, enlazan grandes cantidades de agua, par concentraciones elevadas,
esto provoca la deshidratación de las partículas coloidales y las priva del segundo factor de la
estabilidad del estado de agregación, su envoltura de hidratación. Las proteínas se precipitan.
53
Este método de precipitación de las proteínas, es decir, la precipitación por iones de las sales de
metales alcalinos, se denomina salificación. Los precipitados de las proteínas (gel) obtenidos por
salificación pueden ser disueltos de nuevo al disminuir la concentración de las sales mediante diálisis
o por disolución en agua. De esta manera, la salificación de las proteínas es un proceso reversible.
Como es sabido, las proteínas de los tejidos son heterogéneas con respecto a su masa molecular, y
esta dispersión de la masa molecular se usa para su separación fraccionada empleando las sales de
diferente concentración.
Las disoluciones concentradas de sulfato amónico salifican casi todas las proteínas. Por ejemplo,
todas las fracciones de globulinas se precipitan anta la semisaturación de la disolución de proteínas
con sulfato amónico, mientras que las albúminas se precipitan con una saturación absoluta.
Los cloruros de sodio y potasio, así como el sulfato de magnesio, precipitan las globulinas en estado
de saturación: con acidulación débil (en punto isoeléctrico) estas sales precipitan también las
albúminas, y en este caso se utilizan disoluciones de más baja concentración.
3.5.2 Precipitación de las proteínas con sulfato amónico.
Instrumentos:
 Embudo con filtro
Reactivos:
 Suero de sangre o disolución de clara de huevo
 Sulfato amónico, disolución saturada
 Sulfato amónico en forma de cristales desmenuzados finamente
 Hidróxido sódico, disolución al 10 %
 Sulfato cúprico, disolución al 1 %
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 mL de suero de la sangre o de disolución diluida de clara de
huevo, se añade igual volumen de disolución saturada de sulfato amónico y se agita. Se precipitan
unas proteínas: las globulinas. Luego de 5 ó 7 min, el contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el
filtrado quedan las albúminas y sobre el filtro, las globulinas.
Para precipitar las albúminas, al filtrado se le añade sulfato amónico cristalino hasta la saturación
completa, es decir, hasta que quede un polvo no soluble. Se precipitan las albúminas que se separan
por filtración.
Con 2 ó 3 mL de filtrado se hace la reacción de Biuret. La reacción negativa indica la ausencia de
proteínas en el filtrado y la plenitud de la precipitación.
El precipitado de albúminas junto con el filtro se traslada a un tubo de ensayo y se disuelve en 4 ó 5
mL de agua, agitando el tubo de ensayo.
La disolución de albúminas se filtra; con ella se hace la reacción de Biuret.
54
3.5.3 Precipitación reversible de las proteínas con sulfato amónico
Los instrumentos y reactivos son los mismos que en el experimento anterior.
Procedimiento:
En el tubo de ensayo se vierten 2 ó 3 mL de suero de la sangre o clara de huevo diluida. Se agregan
2 ó 3 mL de disolución saturada de sulfato amónico y se agita. Se precipitan proteínas. Entonces se
añade igual volumen de agua destilada, se mezcla bien y se observa la desaparición paulatina del
precipitado de proteínas.
3.5.4 Precipitación de las proteínas con cloruro sódico y sulfato de magnesio
Instrumentos:
 Los mismos que en experimento en la precipitación con sulfato amónico.
Reactivos:
 Cloruro sódico cristalino
 Sulfato de magnesio cristalino
 Ácido acético, disolución al 1 %
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 2 ó 3 mL de suero de la sangre o clara de huevo diluida en cada
uno. En uno de los tubos de ensayo se añade, hasta la saturación completa, el cloruro sódico y en el
otro, el sulfato de magnesio. Al cabo de 2 ó 3 min en ambos tubos aparece el precipitado de
globulinas. El contenido de los tubos de ensayo se filtra. En el filtrado quedan las albúminas que en
disoluciones neutras no son precipitadas por dichas sales incluso con saturación completa.
Al filtrado se le añaden 4 ó 6 gotas de disolución de ácido acético al 1 %, entonces, las albúminas se
precipitan. Al pasar 5 min, estas se filtran. Por medio de la reacción del Biuret se comprueba la
ausencia de las proteínas en el filtrado.
3.5.5 Precipitación de las proteínas con iones de metales pesados.

Bajo la influencia de los iones de las sales de metales pesados (Pb, Cu, Ag, Hg, etc.), las proteínas
desde el estado de sal coagulan irreversiblemente en gel. Los iones de las sales de metales pesados
forman con las proteínas compuestos complejos estables. Además, los metales pesados anulan la
carga eléctrica y, por lo visto, cambian profundamente la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria
de la proteína.
Para la precipitación de las proteínas con sales de metales pesados se necesitan bajas
concentraciones y pequeñas cantidades de estas sales, en comparación con la precipitación de las
proteínas con sales neutras de metales alcalinos.
En presencia de un exceso de acetato de plomo y sulfato cúprico el precipitado formado por ellos se
disuelve, lo que se explica por la adsorción de un exceso de iones de metal y la recarga del complejo
55
proteínico; como resultado, a la disolución pasa un complejo de proteínas obtenidos por la acción de
las sales de metales pesados son insolubles en disolvente de partida, es decir, en agua o en
disoluciones débiles de sales, incluso después de la eliminación de las sales por diálisis o después de
la dilución con agua.
La capacidad de las proteínas de enlazar los metales pesados se aprovecha ampliamente en la
práctica medicinal y veterinaria: las proteínas sirven de antídotos en caso de envenenamiento con
sales de mercurio, cobre, plomo, etc.
Las reacciones de precipitación de las proteínas con sales de metales pesados transcurren con
plenitud, y ellas se utilizan no sólo para el aislamiento de las proteínas desde disoluciones y líquidos
biológicos sino también para liberar estos últimos de las proteínas.
Instrumentos:
 Varillas de vidrio
Reactivos:
 Disolución de clara de huevo en 20 volúmenes de agua que se filtra a través de varias capas
de gasa
 Acetato de plomo, disolución al 0.5 %
 Sulfato cúprico, disolución al 5 %
 Nitrato de plata, disolución al 3 %
 Disolución saturada de cloruro sódico
Procedimiento:
En tres tubos de ensayo se vierten en cada uno de 1 a 2 mL de disolución de proteína. En el primer
tubo se añade, gota a gota, la disolución de acetato de plomo; en el segundo la de sulfato cúprico; en
el tercero la de nitrato de plata. En los tres tubos se forman precipitados de proteínas.
En los tubos de ensayo con los precipitado obtenidos con acetato de plomo y sulfato cúprico se
añade el exceso de estas sales, observándose, entonces, la disolución de los precipitados.
3.5.6 Precipitación de las proteínas con ácidos minerales.

Los ácidos minerales concentrados (menos el ácido fosfórico) causan precipitación irreversible de las
proteínas desde sus disoluciones. Esta precipitación se explica por el fenómeno de la deshidratación
de las partículas coloidales de proteína, la anulación de su carga, formación de sales de la proteína y
el ácido, etc. La reacción con ácido nítrico se emplea ampliamente para las investigaciones
diagnósticas.
Instrumentos:
56
Reactivos:
 Acido sulfúrico concentrado
 Ácido nítrico concentrado
 Disolución de proteína para las reacciones de precipitación
Procedimiento:
En 3 tubos de ensayo se vierten con cuidado 1 mL de ácidos en cada uno: ácido clorhídrico en el
primero, ácido sulfúrico en el segundo y el nítrico en el tercero.
En todos los tubos de ensayo se aplica con cuidado sobre el ácido una capa de disolución de
proteína (alrededor de 1 mL). En el contacto de dos líquidos aparece un precipitado de proteínas en
forma de pequeño círculo (anillo) blanco.
Cada tubo de ensayo se agita con cuidado. El precipitado se disuelve en los dos primeros tubos de
ensayo donde hay exceso de ácidos clorhídrico y sulfúrico; en el tercer tubo, que contiene ácido
nítrico, el precipitado no desaparece en el curso de la agitación, ya que las proteínas no se disuelven
en el exceso de ácido nítrico.
3.5.7 Precipitación de las proteínas con ácidos orgánicos.

Las proteínas pueden precipitarse de sus disoluciones también con ácidos orgánicos, aunque
distintos ácidos actúan sobre la proteína de diferentes maneras. Así, por ejemplo, el ácido
tricloroacético (CCl3COOH) y el ácido sulfosalicílico [C 6H3 (OH) COO—HSO3H] son, en relación a las
proteínas, reactivos muy específicos y fuertes y se aplican ampliamente en la práctica de
investigación.
La precipitación de las proteínas con ayuda de ácido tricloroacético de concentración final de 2,5 a
5% se usa para eliminar completamente las proteínas desde los líquidos biológicos u
homogeneizados de los tejidos, puesto que el ácido tricloroacético precipita sólo las proteínas,
mientras que los productos de su desintegración (metabolismo), esto es, la urea, el ácido úrico, las
amidas de los aminoácidos, los aminoácidos, los péptidos de bajo peso molecular etc., se quedan en
disolución. Esto tiene importancia para determinar por separado el nitrógeno proteínico y no
proteínico (restante) en los tejidos.
Instrumentos:
Reactivos:
 Ácido tricloroacético, disolución al 5 %
 Ácido sulfosalicílico disolución al 20%
 Disolución de proteína utilizado en las reacciones de precipitación
57
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 1 ó 2 mL de disolución de proteína y se añaden al primer tubo
varias gotas de disolución de ácido tricloroacético al 5 % y al segundo, varias gotas de ácido
sulfosalicílico. Los tubos de ensayo se agitan y se observa la precipitación de la proteína.
3.5.8 Precipitación de las proteínas con alcohol y acetona

Los disolventes orgánicos precipitan las proteínas de una disolución neutra o débilmente ácida. Ellos
desplazan las proteínas de las disoluciones acuosas. El mecanismo de acción del alcohol y otros
disolventes orgánicos puede ser explicado por la deshidratación de las micelas de proteína, lo que
conduce a la merma de su estabilidad en disolución. Si en la disolución de proteína hay presentes
sales (NaCl), el precipitado se forma más rápidamente debido a la anulación de la carga desde la
partícula coloidal. Este fenómeno disminuye aún más estabilidad de la disolución de la proteína.
Si la precipitación se hace en frío y el precipitado se separa rápidamente del alcohol, entonces, la
proteína puede ser de nuevo disuelta en agua, es decir, sus propiedades no varían, la
desnaturalización no logra realizarse, y la precipitación resulta ser reversible. Durante una estancia
prolongada con alcohol, la proteína se desnaturaliza y se vuelve insoluble en el disolvente inicial.
Instrumentos:
Reactivos:
 Disolución de proteína para las reacciones de precipitación
 Alcohol etílico al 96 %
 Acetona
 Cloruro sódico cristalino
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten 1 ó 2 mL de disolución de proteína, con cucharita se añade un
poco (0.2 ó 0.3 g) de cloruro sódico y se agita enérgicamente.
Al primer tubo de ensayo se añaden gradualmente (gota a gota) 2 ó 3 mL de alcohol, y al segundo, 2
ó 3 mL de acetona.
Los tubos se agitan enérgicamente y después de 3 ó 6 min se observa la formación de un precipitado
fino de proteínas.
3.6 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS PROTEÍNAS

La determinación cualitativa de las proteínas se basa en dos tipos de reacciones:
a) las reacciones en que intervienen los enlaces peptídicos de la molécula proteínica.
b) las reacciones de los grupos amino presentes en la molécula de la proteína.
Estas son reacciones coloreadas de reconocimiento de las proteínas.
58
3.6.1 Descubrimiento de los enlaces peptídicos en las moléculas de proteínas (reacción del
Biuret)
En la disolución alcalina, al añadir sulfato cúprico, tales sustancias como el Biuret, la oxamida, los
polipéptidos y las proteínas forman sales complejas coloreadas de un color violeta. Esta reacción
es condicionada por la presencia de la unión peptídica.
O
H3C NH C
CH3
El nombre de «reacción del Biuret» proviene de un derivado de la urea, el Biuret, que, en

condiciones apropiadas, da esta reacción. El Biuret se forma en el curso del calentamiento de la
urea con desprendimiento de amoniaco:
calentamiento
H2N CO NH H* H2N CO NH2 NH3 H2N CO NH CO NH2
urea
Biuret
La estructura de la sal compleja coloreada de Cu-Na-Biuret que se forma en medio alcalino, puede
representarse del modo siguiente:
-
O -
O
NH NH
-
HN O Cu O NH
NH NH
Como se ve en la fórmula indicada más arriba. El Biuret en un medio alcalino sufre la ionización
completa según el esquema
H2N CO NH CO NH2 H2N C NH C NH2
OH OH
Dos moléculas de Biuret en forma dienólica se combinan con el hidróxido cúprico formando un
complejo en que los enlaces de coordinación son formados a cuenta de los pares electrónicos de los
grupos imino.
R2
C
C
N
N O CH R3
-
C O Cu C OH
R1 HC N N
C OH HC R4
cadena cadena
De un modo análogo esta constituido el complejo de cobre con los grupos enolizados peptídicos
de cualquier proteína o polipéptido.
Los complejos de este tipo poseen sobre todo, un color rojo (el máximo de absorción esta
situado en la región de 520 a 535 nm). En caso de formarse complejos cúpricos con
participación de tres o dos átomos de nitrógeno, su coloración es preferentemente violeta y azul
(el máximo de absorción es de 540 a 580 nm y de 615 a 670 nm). Por lo tanto la coloración de las
59
disoluciones varia, al verificarse la reacción del Biuret, del azul al rojo, con preponderancia del
color violeta.
Instrumentos:
Reactivos:
 Urea cristalina
 Hidróxido sódico disoluciones al 10 % y 30%
 Disolución de proteína (claras de dos huevos mezcladas con un litro de agua destilada)
Procedimiento:
Reacción con el Biuret. En un tubo de ensayo seco se toma una pequeña cantidad (0,5 g) de
urea y se calcina con cuidado en la llama de un mechero de gas. La urea primero se funde en el
curso del calentamiento ulterior se desprende amoniaco. Al enfriarse, a la masa fun dida se le
añade 1 ó 2 mL de hidróxido sódico al 10% y varias gotas de disolución de sulfato cúprico al 1 %.
Después de agitada la mezcla, se desarrolla una coloración violeta azul de la disolución.
Reacción con la proteína. A 1 ó 2 mL de disolución de proteína se le añade un volumen doble de

disolución de hidróxido sódico al 30%. Se mezcla cuidadosamente y se agregan 2 ó 3 gotas de
disolución de sulfato cúprico al 1%. De nuevo se mezcla cuidadosamente. Se desarrolla una colora-
ción roji-violeta. Siendo pequeña la concentración de la proteína, la sensibilidad de la reacción
puede ser aumentada, aplicando sobre la capa de disolución de proteína en álcali 1 mL de
disolución de sulfato cúprico al 1%. Estando el tubo de ensayo en reposo, en el contacto de dos
capas aparece un anillo violeta. Este método puede emplearse para la determinación de la
proteína en la orina.
3.6.2 Ensayo de la ninhidrina

El ensayo se basa en la reacción con ninhidrina del grupo amino de aminoácidos libres y de los
grupos amino dela molécula proteínica. Este proceso transcurre en varias etapas. En un
principio, como resultado de la interacción del aminoácido con la ninhidrina se forma una base
de Schiff. Lugo ésta sufre un reagrupamiento, se descarboxila y se pone aldehído y
aminodicetohidrindeno.
El aminodicetohidrindeno se condensa con otra molécula de ninhidrina más, y el compuesto

formado, al enolizarse, toma un color violeta azul. En presencia de disolventes orgánicos
(acetona, etanol, etc.) en los cuales se prepara la disolución de ninhidrina, la reacción
transcurre. Hoy en día la reacción de ninhidrina se utiliza ampliamente tanto para la detección
de los aminoácidos, como para la determinación de su cantidad en los objetos biológicos.
60
Instrumentos:
 Baño de agua
Reactivos:
 Ninhidrina, disolución al 0.2% en alcohol o acetona
 Glicina, disolución al 0.1%
Procedimiento:
Primeramente, se efectúa la reacción con glicina o cualquier otro aminoácido. En un tubo de
ensayo se vierten 2 mL de disolución de glicina, se añaden de 6 a 8 gotas de disolución de
ninhidrina y se calienta. Se forma una coloración violeta.
En el otro tubo de ensayo se vierten 2 o 3 mL de disolución de proteína, se añaden 10 o 12
gotas de disolución de ninhidrina. El contenido se mezcla y se calienta durante varios minutos
en baño de agua. Se observa una coloración violeta azul.
3.6.3 Reacción con el ácido pícrico

El ácido pícrico al ser calentado con la proteína en un medio alcalino, se reduce formando el ácido
picrámico. Esta reacción puede realizarse también con otros reductores, por ejemplo, con la glucosa:
OH OH
O2N NO2 + 6H O2N NH2 + 2H2O
NO2 NO2
Ácido pícrico Ácido picrámico
Instrumentos:
 Espátula
Reactivos:
 Acido pícrico, disolución saturada
 Glucosa, disolución al 0.1 %
 Hidrocarbonato sódico seco
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolución de proteína y se añade de 0.3 a 0.5 g de
Hidrocarbonato sódico, luego se agrega 1 mL de disolución saturada de ácido pícrico. El tubo de
61
ensayo se calienta durante varios minutos en la llama del mechero. La coloración amarilla de la
disolución gradualmente pasa a ser roja debido a la reducción del ácido pícrico en picrámico.
En el otro tubo de ensayo se efectúa la misma reacción con disolución de glucosa al 0,1 % en lugar
de la proteína. Se observan los mismos fenómenos que en el caso de la proteína.
3.7 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS AMINOACIDOS
3.7.1 Ensayo xantoproteico

La reacción xantoproteica (del griego <xanthos>, amarillo) permite descubrir la presencia en la
molécula de proteína de los aminoácidos cíclicos (fenilalalina, tirosina y triptófano). La presencia de
estos aminoácidos en la molécula de la proteína, da lugar a la reacción. Los anillos aromáticos de los
aminoácidos se someten a la nitración que lleva a la formación de los derivados nitro de las
proteínas, coloreados de amarillo.
La reacción xantoproteica la dan los compuestos aromáticos sencillos: el benceno y sus homólogos,
le fenol, etc.
La tirosina por nitración se convierte en nitrotirosina, a partir de la cual, bajo la influencia del álcali, se
forma una sal amónica que tiene agrupamiento quinoidal:
O
OH O ONa
H +HO NO2 OH
N + NaOH N
O O
NH2 -H O -H2O
2
NH2 NH2
CH2 CH COOH CH2 CH COOH
CH2 CH COOH
Tirosina Nitrotirosina
Instrumentos:
Reactivos:
 Fenol, disolución al 0,1%
 Ácido nítrico concentrado
 Hidróxido sódico, disolución al 20%, o amoníaco
Procedimiento:
Primeramente, se efectúa la reacción con el fenol. En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de la
disolución de fenol y se añaden 1 ó 2 mL de ácido nítrico concentrado. Se calienta con cuidado,
manifestándose un color amarillo.
En el otro tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolución de proteína, aproximadamente, y se añaden
de 6 a 10 gotas de ácido nítrico concentrado. Bajo la influencia del ácido aparece el precipitado de
proteína que al enfriarse adquiere una coloración amarilla. Luego el tubo de ensayo se deja enfriar y
62
se le añade, con cuidado, un exceso de hidróxido sódico o de amoniaco. Esto hace que la coloración
amarilla se convierte en anaranjada.
3.7.2 Reacción de la tirosina

La reacción se debe a la presencia, en la molécula de proteína, de la tirosina que tiene en su
composición un grupo fenólico. Éste por calentamiento con el reactivo Millon (una mezcla de nitrato y
nitrito mercúricos disueltos en ácido nítrico concentrado) proporciona una coloración roja al coágulo.
El quimismo de la reacción se reduce a la formación de la nitroso tirosina que, adicionando el
mercurio en el curso del calentamiento, se transforma en una sal mercúrica de color rojo.
OH OHg
Hg+2 . HNO3
N O
+ HgNO2 + H2O
CH2 CH2
H2N CH COOH H2N CH COOH
Tirosina Compuesto mecúrico de

nitrotirosina
Casi todas las proteínas dan la reacción de Millon, puesto que en su composición entra el aminoácido
de tirosina que es un fenol.
Instrumentos:
Reactivos:
 Fenol, disolución al 0.1 %
 Reactivo Millon
 Gelatina, disolución al 1 %
Procedimiento:
Primeramente se hace el experimento con el fenol. En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de
disolución de fenol y 1 mL de reactivo de Millon, calentándose lentamente. Aparece una coloración
rosada. A continuación se realiza la reacción con proteína. En el otro tubo de ensayo se vierten 2 mL
de disolución de proteína y se añaden 6 a 8 gotas de reactivo Millon. Al principio aparece un
precipitado de proteína que al calentarse toma un color rojo ladrillo.
Debe evitarse el exceso de reactivo Millon, ya que el ácido nítrico puede dar coloración amarilla
(reacción xantoproteica) que enmascara la reacción de la tirosina.
De manera análoga se efectúa la reacción con disolución de gelatina. Como regla, la reacción de
Millon con gelatina es negativa.
63
3.7.3 Reacción del triptófano
Instrumentos:
 Pipetas de 1 mL
Reactivos:
 Sacarosa, disolución al 10 %
Procedimiento:
En el tubo de ensayo se vierte 1 mL de disolución de proteína, aproximadamente, y se añaden 2
gotas de disolución de sacarosa. Luego mediante la pipeta se deja bajar al fondo 1 mL de ácido
sulfúrico concentrado. En el contacto de los líquidos aparece una coloración guinda roja en forma de
un anillo.
La esencia de la reacción se reduce a que bajo la influencia del ácido sulfúrico ocurre la hidrólisis de
la sacarosa hasta monosacáridos que se deshidratan, convirtiéndose en hidroximetilfurfural. El
triptófano, al combinarse con el hidroximetilfurfural, forma un complejo de color guinda rojo.
3.7.4 Reacción de la arginina

La arginina en presencia del -naftol se oxida con hipobromito, perdiendo a la vez un grupo imino. La
arginina oxidada, al combinarse con el -naftol, forma una sustancia de color rojo que se supone
posee la estructura siguiente:
NH2
O C N CH2 CH2 CH2 CH COOH
H NH2
Las proteínas que tienen en su composición arginina, dan una coloración roja con hipobromito o
hipoclorito y α-naftol en medio alcalino.
Instrumentos:
Reactivos:
 Hidróxido sódico, disolución al 10%.
 α-naftol, disolución al 0.2 % (antes de usar 5 mL de disolución básica se diluye 5 veces con
agua)
 Hipobromito sódico
64
 Arginina, disolución al 0.01 % en ácido sulfúrico 0,1N
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolución de proteína. Se añaden 2 o 3 gotas de disolución
de hidróxido sódico y 2 gotas de α-naftol. El contenido del tubo de ensayo se mezcla y se agrega 1
gota de hipobromito. Aparece una coloración carmesí roja.
En el mismo orden que se efectúa la reacción con la disolución de arginina. Aparece una coloración
roja ladrillo.
3.7.5 Reacción de los aminoácidos que contienen azufre

En la composición molecular de la mayoría de las proteínas entran aminoácidos que contienen
azufre: la cisteína, cistina y metionina. Al calentarse con álcali, de estos aminoácidos se desprende
azufre en forma de sulfuro de hidrógeno que se detecta en la reacción con el acetato de plomo:
H2C SH H2C OH
1)
HC NH2 + 2NaOH HC NH2 + Na2S + H2O
H2C COOH H2C COOH
2) Na2S + (CH3COO)2Pb 2CH3COONa + PbS
Instrumentos:
 Soporte con tubos do ensayo
Reactivos:
 Clara de huevo no diluida
 Acetato de plomo, disolución al 0,5%
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 1 ó 2 mL de clara de huevo y se añade igual volumen de disolución
de hidróxido sódico, se calienta hasta la ebullición y se agregan 1 ó 2 gotas de acetato de plomo. Se
observa un oscurecimiento paulatino de la disolución.
3.7.6 Reacción de reconocimiento del glutatión

El glutatión es un tripéptido compuesto de los restos del ácido glutámico, la cisteína y la glicina:
O O
C CH2 NH C CH2 O
CH2 C CH NH C
HO
O H2C OH
SH
65
En los tejidos y células del organismo animal el glutatión se encuentra en forma reducida (como
tripéptido G—SH) y en forma oxidada (como tripéptido GS—S—S—G). La reducción del glutatión se
realiza a través de la reacción con el DANPH2:
G  S  S  G  DANPH2  2G  SH  DANP
En el organismo el glutatión se oxida, interaccionando con los aminoácidos de proteínas. La función

más importante del glutatión es mantener en el estado reducido los grupos tioles de la cisteína en las
proteínas. Esta reacción se describe con la ecuación siguiente:
- S  S  2G  SH  HS SH  GSSG
R R
Proteína glutatión proteína glutatión
reducido oxidado
El glutatión puede servir de agente de transferencia de hidrógeno intermediario en las reacciones de

oxidación del aldehído fosfoglicérico y de activador de una serie de enzimas (proteinasas). Sobre la
catalasa, fosfatasa y algunas otras enzimas el glutatión ejerce una acción inhibidora.
Contienen glutatión la sangre, el hígado, los músculos, los riñones, las glándulas suprarrenales y
otros órganos. En la sangre de los animales sanos se contiene de 4,4 a 32,3 mg de glutatión,
mientras que por ejemplo en la sangre de las vacas enfermas de cetosis su contenido alcanza a 22,5-
23,2 mg. Estos indicadores reflejan la alteración de los procesos de oxidación-reducción en los tejidos
del animal.
El principio del método. En el medio alcalino del glutatión se desprende el sulfuro sódico que, al
combinarse con el nitroprusiato de sodio, forma un compuesto de color carmesí:
  
2Na FeCN5NO  Na S  2Na FeCN5NO  S
2 2

Nitroprusi ato de sodio Complejo coloreado
Instrumentos:
 Mortero con machaca
 Polvo de vidrio
 Pipetas
 Infernilla
Reactivos:
 Hígado fresco
 Sulfato amónico, disolución saturada
 Nitroprusiato de sodio, disolución al 2%
 Amoníaco concentrado
66
Procedimiento:
En el mortero se trituran cerca de 1 g de hígado con una pequeña cantidad de polvo de vidrio y 3 ó 4
mL de disolución saturada de sulfato amónico. El contenido del mortero se divide en dos porciones
iguales que se ponen en dos tubos de ensayo. El tubo de ensayo 1 sirve de control, él se calienta
hasta la ebullición para desnaturar las proteínas y el glutatión. En el tubo de ensayo 2 (experimental)
el glutatión queda intacto. En ambos tubos se añaden 2 mL de amoníaco y 1 mL de disolución de
nitroprusiato de sodio. En el tubo de ensayo 2 se observa la aparición de una coloración carmesí.
3.7.7 Diazorreacción de reconocimiento de la tirosina, el triptófano y la histidina

Con el diazorreactivo las proteínas dan una coloración roja anaranjada. El color depende de la
formación de los azocompuestos coloreados a partir de los restos de aminoácidos, la tirosina, el
triptófano y la histidina que forman parte de la composición de la molécula proteínica.
La diazorreacción se emplea para la determinación cuantitativa y cualitativa de la tirosina e histidina
en los hidrolizados proteínicos.
Instrumentos:
Reactivos:
 Reactivo diazo
 Tirosina, disolución 0,01 % en ácido sulfúrico 0,1 N
 Carbonato sódico, disolución al 10 %
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL de disolución de tirosina, 0,5 mL de disolución de sosa y 1 mL
de reactivo diazo. Aparece una coloración roja anaranjada.
De manera análoga se efectúa con la proteína utilizando la disolución de proteína en lugar de la de
tirosina. En este caso también aparece una coloración roja anaranjada.
3.8 DESCUBRIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO EN LAS PROTEÍNAS

Ciertas proteínas (glicoproteínas, nucleoproteínas, etc.) tienen en su composición hidratos de
carbono. En presencia del ácido sulfúrico concentrado tales proteínas dan una coloración
característica para los hidratos de carbono: violeta con -naftol y roja con timol. Esta coloración
aparece como resultado de la interacción con el a-naftol o el timol del furfural e hidroximetilfurfural
que se forman bajo la influencia del ácido sulfúrico concentrado (deshidratación de los
monosacáridos).
Instrumentos
67
Reactivos.
 α-Naftol, disolución al 0,2 %
 Timol, disolución al 1% en alcohol
 Glucosa, disolución al 0,1%
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo se vierten, en cada uno, 2 mL de disolución de glucosa. Al primer tubo se le
añaden de 4 a 6 gotas de disolución de α-naftol, al otro tubo, de 4 a 6 gotas de disolución de timol. En
ambos tubos se deposita en el fondo, formando una capa, con cuidado, 1 ó 2 mL de ácido sulfúrico
concentrado. Se observa una coloración violeta (en el caso del α-naftol) o roja (en el caso del timol)
en la unión del ácido sulfúrico y la disolución de glucosa.
Se realiza la misma reacción con la disolución de proteína. Se anota la reacción positiva de
reconocimiento del componente de hidrato de carbono.
3.9 PROTEINAS CONJUGADAS

Las proteínas conjugadas están compuestas de proteínas sencillas y componentes no proteínicos
(grupo prostético). En dependencia de la naturaleza del grupo prostético (ácido nucleico, sustancia
coloreada, hidrato de carbono, lípidos, vitamina, metal, etc.) las proteínas conjugadas se dividen en:
nucleoproteínas, cromoproteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, metaloproteínas, fosfoproteínas, etc.
3.9.1 NUCLEOPROTEINAS
Las nucleoproteínas son proteínas complejas constituidas de proteínas sencillas del tipo de histonas y
protaminas, conjugadas con ácido nucleico. Se distinguen dos clases de ácidos nucleicos: el
ribonucleico y el desoxirribonucleico.
3.9.2 Aislamiento de la desoxirribonucleoproteína

Las desoxirribonucleoproteínas son la componente principal de los núcleos de las células. Se
denominan también proteínas de núcleo o nucleoproteínas. Una propiedad característica de las
nucleoproteínas es su capacidad de formar disoluciones muy viscosas en las disoluciones
concentradas de sales (NaCl y otras) y su insolubilidad en las disoluciones salinas diluidas. Al ser
precipitadas desde las disoluciones salinas, las nucleoproteínas sedimentan en forma de hilos.
Instrumentos:
 Centrífuga de 2500 ó 3000 revoluciones
 Probetas de centrífuga graduadas
 Vaso de precipitación 300 mL
 Probeta 100 mL
68
 Varilla de madera con entallados
 Vidrio reloj
Reactivos:
 Glándula linfática, timo o hígado (de conejo o bovino)
 Cloruro sódico, disolución 1 N
Procedimiento:
2 g de tejido se desmenuzan primero con tijeras sobre el vidrio reloj y luego se trituran en el mortero.
En el mortero se añaden, por porciones pequeñas, de 70 a 80 mL de disolución de NaCl 1 N,
triturando el contenido cuidadosamente durante 10 ó 15 minutos.
La disolución viscosa obtenida se reparte en las probetas de centrífuga y se lleva a centrifugar a 2500
ó 3000 rpm. Luego el líquido se decanta en la probeta graduada y se mide su volumen.
Se toma un volumen séxtuplo de agua (con respecto al líquido centrifugado), se vierte en el vaso y
girando lentamente la varilla de madera en el agua, se le agrega el líquido centrifugado.
Los hilos de nucleoproteína formados se arrollan sobre la varilla, se trasladan con cuidado a un tubo
de ensayo y se usan posteriormente para realizar las reacciones de reconocimiento de ADN.
3.9.3 Reacciones de Reconocimiento del ADN

El ADN da una serie de reacciones coloreadas con las cuales éste puede ser distinguido del ARN.
Estas reacciones están condicionadas por la presencia en la molécula de la desoxirribosa. Para
descubrir el ADN, se emplea las reacciones con la Difenilamina (C 6H5-NH-C6H5) que da con la
desoxirribosa y el ADN una coloración verde.
Instrumentos:
 Baño María
Reactivos:
 Reactivo de difenilamina
 Hidróxido de sodio, disolución 0.4 %
Procedimiento:
Una pequeña cantidad del precipitado de desoxirribonucleoproteína se traslada a un tubo de ensayo y
se disuelve en 1 mL de NaOH. Se añade igual volumen de reactivo de difenilamina (hasta disolver el
precipitado) y el tubo se pone en el baño María hirviendo donde se mantiene durante 15 ó 20
minutos. Se observa una coloración azul.
69
3.9.4 Obtención de la nucleoproteína a partir de levadura
Las levaduras son ricas en ribonucleoproteínas. Éstas pueden ser extraídas de las células de
levadura destruidas en un medio alcalino de la disolución, y precipitadas por acidulación.
Instrumentos:
 Vaso o matraz 100 mL
 Probeta graduada 100 mL
 Centrífuga y probetas de centrífuga
 Pipeta 10 mL
 Arena de vidrio
Reactivos:
 Levadura prensada
 Éter dietílico
 NaOH, disolución al 0.4 %
 Ácido acético, disolución al 5%
Procedimiento:
En el mortero se colocan 5 g de levadura, se añade 10 gotas de éter y 10 gotas de agua, una pulgada
de arena de vidrio, se tritura cuidadosamente. A la masa homogenizada se le agregan 30 mL de
disolución de NaOH y se sigue triturando durante 15 minutos más. El contenido del mortero se
reparte en 3 probetas de centrífuga, llevando el volumen a 10 mL. Se centrifugan durante 5 ó 10 min
a 2500 rpm. El líquido de todas las probetas se decanta en un vaso donde se vierte la disolución de
ácido acético (12 mL) removiendo constantemente con la varilla hasta la completa precipitación de la
nucleoproteína. El precipitado de la nucleoproteína se separa mediante otra centrifugación y se utiliza
para la reacción de la hidrólisis.
3.9.5 Hidrólisis de la nucleoproteína

Esta reacción puede verificarse mediante la ebullición de la nucleoproteína con el ácido sulfúrico al
5% durante 1 hora. La nucleoproteína se desdobla en proteína y ácido nucleico. Este último se
descompone en mononucleótidos individuales, de los cuales luego se desprende el ácido fosfórico y
las bases púricas (adenina y guanina). La proteína mientras tanto, también se somete a hidrólisis
parcial hasta polipéptidos de bajo peso molecular y aminoácidos. En el hidrolizado pueden ser
determinados, la proteína, bases púricas, pentosa y ácido fosfórico.
Instrumentos:
 Matraz con refrigerante de reflujo
70
 Embudo con filtro
 Vaso 100 mL
Reactivos:
 Ácido sulfúrico, disolución 5 %
Procedimiento:
La nucleoproteína obtenida a partir de la levadura a partir de la levadura se traslada al matraz para
hidrólisis y se le añade 15 mL de disolución de ácido sulfúrico al 5%. El matraz se cierra con un tapón
provisto de refrigerante de reflujo y se hierve con cuidado durante 1 hora.
Al enfriarse, el hidrolizado se filtra en el vaso y se utiliza para el análisis de los productos de hidrólisis.
3.9.6 Detección de las proteínas sencillas

Para este fin pueden emplearse dos reacciones, la de Biuret y la de Millon
Instrumentos:
Reactivos:
 Hidróxido de sodio, al 10%
 Sulfato cúprico, al 1%
 Reactivo de Millon
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierte 0,5 mL de hidrolizado filtrado, éste se neutraliza por el papel tornasol
con NaOH y se añade 0,5 mL de NaOH, luego se agregan 2 ó 3 gotas de sulfato cúprico. El tubo de
ensayo se agita y se observa la reacción de Biuret positiva (coloración rosada o violeta).En otro tubo
de ensayo se vierte 1 mL de hidrolizado y se añade 0,3 mL de reactivo de Millon. Se calienta y el
precipitado adquiere un color rosado o rojo ladrillo.
3.9.7 Detección de las pentosas

Se realiza una de las reacciones de oxidación de las aldopentosas. Para ello se realiza la reacción de
Fehling.
Instrumentos:
Reactivos:
 NaOH, disolución 10 %
71
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierte 0,5 mL de hidrolizado filtrado, éste se neutraliza por el papel tornasol
con disolución de álcali. Al hidrolizado neutralizado se añade igual volumen de reactivo de Fehling, el
tubo se agita y la capa superior del líquido se calienta. Se observa la aparición de un precipitado rojo
amarillo de óxido cuproso e hidróxido cuproso.
3.9.8 Detección de las bases púricas

La esencia de la reacción se reduce a la formación de sales de plata de la bases púricas, que se
precipitan al fondo del tubo de ensayo.
Instrumentos:
Reactivos:
 Amoníaco concentrado
 Disolución de nitrato de plata en amoníaco
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL del hidrolizado de la nucleoproteína, se añaden 5 ó 6 gotas de
amoníaco concentrado hasta la reacción alcalina por el papel tornasol, luego se agrega 0,5 mL de la
disolución amoniacal de plata. Aparece un precipitado en forma de copos de sales de plata y bases
púricas que sedimentan, paulatinamente al fondo.
3.9.9 Detección del ácido fosfórico
Instrumentos:
 Pipeta de 5 mL
Reactivos:
 Molibdato amónico
 Ácido ascórbico, disolución 0,04 %
Procedimiento:
En un tubo de ensayo se vierten 2 mL del hidrolizado de la nucleoproteína, se añaden 3 mL de
molibdato amónico y 1 mL de ácido ascórbico. Se mezcla cuidadosamente y se observa la aparición
de una coloración azul que puede ser acelerada mediante calentamiento en el baño María hasta
40°C.
72
3.10 GLICOPROTEÍNAS
Son proteínas conjugadas compuestas por las proteínas sencillas y grupo prostético en cuya
composición entran los hidratos de carbono tanto del tipo de homopolisacáridos, como de
heteropolisacáridos.
3.10.1 Aislamiento de la mucina de la saliva
Instrumentos:
Reactivos:
 Ácido acético, disolución al 1%
 Hidróxido de sodio, disolución al 10%
 Ácido clorhídrico, disolución 0.1%
 α-Naftol, disolución al 0.2%
Procedimiento:
En tres tubos de ensayo se colectan 1 ó 2 mL de saliva en cada tubo y se añade, gota a gota, una
disolución de ácido acético al 1% hasta aparecer flóculos de mucina. El precipitado de mucina se lava
cuidadosamente con agua, deteniendo el flóculo con la varilla de vidrio.
Después del lavado, al flóculo de la mucina en el primer tubo de ensayo se le añade 1 mL de
disolución de hidróxido de sodio al 10%, se mezclan y al diluirse la mucina, se realiza la reacción de
Biuret. Para ello además se añaden 5 ó 6 gotas de hidróxido de sodio y 1 ó 2 gotas de sulfato cúprico.
El tubo de ensayo se agita y se observa un cambio de color por el rosa o violeta.
En el segundo tubo de ensayo se añade 1 mL de disolución de ácido clorhídrico al 0.1%, y se observa
la disolución de la mucina.
Al flóculo de mucina en el tercer tubo se añade 5 ó 6 gotas de α-naftol, se mezcla y se agrega, con
cuidado por las paredes, ácido sulfúrico concentrado. En el límite entre dos capas del líquido surge
una coloración violeta. La reacción es debida a la presencia, en el grupo prostético, de la mucina de
los monosacáridos y sus derivados que bajo la influencia del ácido sulfúrico se convierten en furfural
e hidroximetilfurfural, y estos últimos dan color con el α-naftol sustancias coloreadas.
73
3.11 PREPARACIÓN DE REACTIVOS PARA ENZIMAS
SOLUCIONES DE pH
Fosfato sódico disustituido, disolución 0.2 M (A).
Ácido cítrico disolución 0.1 M (B).
- Disoluciones amortiguadoras
o pH 5,0: se mezclan 515 ml de disolución A con 485 ml de disolución B
o pH 6,8: se mezclan 772,5 ml de disolución A con 227,5 ml de disolución B
o pH 8,0: se mezclan 972,5 ml de disolución A con 27,5 ml de disolución B
SACARASA
Se pesan 10 g de levadura, se trituran completamente y se homogeniza en 100 mL de agua.
ÁCIDO SUCCÍNICO 3%
Se pesan 3 g de ácido succínico y se disuelven en 97 mL de agua destilada y se neutraliza con
disolución de hidróxido de sodio al 10 % hasta pH 7.4 según papel indicador.
ACIDO TRICLOROACETICO 20 %
Pesar 20 g de ácido tricloroacético, llevar a volumen de 100 mL con agua destilada.
ALMIDÓN TAMPONADO
Solución de almidón 500 mg/L, tamponada a pH 7 con buffer fosfato 0.1 mol/L en NaCl 0.15 mol/L.
Otro método de preparar almidón tamponado, es mezclando 8 mL de almidón al 1% con 4 mL de
solución tampón de pH 7.
REACTIVO DE IODO
Preparar una solución de 0.01 eq/L de iodo en ácido clorhídrico 0.02 mol/L.
3.12 PREPARACION DE REACTIVOS PARA RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS
DISOLUCION DE PROTEÍNA
Disolución de clara de huevo (de tres huevos de gallina) que se prepara mezclando las claras de
huevo con 700 mL de agua destilada y 300 mL de disolución saturada de cloruro de sodio con
posterior filtración a través de varias capas de gasa.
REACTIVO DE MILLON
40 g de mercurio se disuelven en 57 mL de ácido nítrico concentrado primeramente temperatura
ambiente y luego con un calentamiento débil en baño María; la disolución obtenida se diluye en dos
volúmenes de agua, se deja sedimentar y se decanta. Preparar bajo la campana de extracción.
74
HIPOBROMITO SODICO
Se disuelven 300 g de hidróxido de sodio en 1 L de agua destilada, se enfría y se añaden bajo la
campana de humos, con cuidado y removiendo constantemente, 50 g de bromo puro (alrededor de 16
mL); la disolución se guarda en un frasco ámbar durante 3 meses como máximo.
REACTIVO DIAZO
0,9 g de ácido sulfanílico se disuelven en 9 mL de HCl concentrado y se agrega agua hasta completar
100 mL. Ésta disolución básica se puede guardar largo tiempo. Se toma 1,5 mL de disolución básica
de ácido sulfanílico y se vierte en un matraz aforado de 50 mL puesto en hielo, se añaden 1,5 mL de
disolución de nitrito de sodio al 5% recién preparado. Al cabo de 5 min, se agregan, agitando otros 6
mL de disolución de nitrito de sodio. Tras 1 minuto se añade poco a poco (durante el enfriamiento)
agua hasta completar 50 mL. La disolución se agita y se deja sobre el hielo durante 15 min. La
disolución puede guardarse en hielo durante 24 horas.
REACTIVO DE DIFENILAMINA
Se pesa 1 g de difenilamina, se disuelve en 10 mL de ácido acético glacial; se añade 2,75 mL de
ácido sulfúrico concentrado y se lleva a 100 mL con ácido acético glacial.
MOLIBDATO AMONICO
Pesar 12,5 g de molibdato de amonio y disolver en 250 mL de agua en un matraz de 500 mL. A la
disolución obtenida se añaden 250 mL de ácido sulfúrico concentrado.
ÁCIDO ASCORBICO 0,04 %

Disolver 0,04 g de ácido ascórbico en 100 mL de agua destilada. Este reactivo debe prepararse en el
momento de realizar la práctica.
75
BIBLIOGRAFIA
CHECHETKIN A.V.; Prácticas de Bioquímica del ganado y aves de corral. Editorial Mir Moscú
HAWK, PHILIP., Química Fisiológica Práctica. Editorial Interamericana
JAMARDO & JAMARDO; Guía práctica de Química Biológica. Primera edición. Editorial Universitaria
LENENGER, DAVID, COX M.; Principios de Bioquímica. Editorial Omega 2006
MATHEWS, C. K., VAN HOLDE, K. E., AHEM.; Bioquímica. Tercera edición. Editorial Pearson E.
2002
76

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y PROTEÍNAS

Dra. Guadalupe Jibaja

1.1.1 Reacción con α-Naftol o Prueba de Molisch ................................................................................................................... 5

CAPÍTULO III ........................................................................................................................................................................................................ 43

1.1 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE HIDRATOS DE CARBONO

1.1.1 Reacción con α-Naftol o Prueba de Molisch

En el contacto con las capas aparece:

1.1.3 Prueba con Naftorresorcina

1.2 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES

1.2.1 Prueba con el hidróxido cúprico (II), Reacción de Trommer

1.2.2 Reacción con el licor de Fehling

1.2.3 Reacción con sales de bismuto, Nylander

Bi(OH) 2NO 3 + NaOH Bi(OH) 3 + NaNO 3

Glucosa Ácido Glucónico

1.2.4 Reacción con Fenilhidrazina

La reacción de formación de osazonas transcurre en 3 etapas. Al reaccionar los monosacáridos con

Figura 1 Cristales de osazonas de mono y disacáridos

1.2.5 Reconocimiento de la fructosa en disolución (Reacción de A. F. Selivánov)

1.2.7 Reacción con Floroglucina

1.2.9 Prueba de Benedict.

1.3 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE DISACÁRIDOS

1.3.1 Reacción de reconocimiento de la sacarosa

Sacarosa -D- glucosa -D-fructosa

La sacarosa da con el sulfato de cobalto en un medio alcalino un complejo de color violeta.

1.3.2 Hidrólisis ácida de la sacarosa

1.3.3 Hidrólisis enzimática de la sacarosa

1.3.5 Reacciones de reducción de iones metálicos

1.4 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE POLISACÁRIDOS

1.4.1 ALMIDÓN: Reacciones coloreadas del almidón

En el caso de polisacáridos de cadenas ramificadas, por ejemplo, la amilopectina y el glicógeno, junto

El contenido del tubo de ensayo se divide en tres partes:

1.4.2 Hidrólisis ácida escalonada del almidón

1.4.3 Hidrólisis enzimática del almidón

1.5 IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES

1.5.1 Preparación de las muestras a analizar: extracción de carbohidratos

1.5.1.1 A partir de frutas

1.5.1.2 A partir de leche

1.5.1.3 A partir de tusa de maíz

1.5.1.4 Jarabe de maíz

1.5.2 Reacciones de identificación

1.5.2.2 Reacción de Benedict

1.5.2.3 Reacción de Selivánov

REACTIVO DE LA ANTRONA 0.2 % y H2SO4

REACTIVO DEL BIAL

2.1 LOS LÍPIDOS Y SUS METABOLITOS

2.2 REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LAS GRASAS

2.2.1 Reacción de la grasa y el aceite con el reactivo de Sudán III

La reacción de formación de la acroleína se hace con el propósito de reconocer la glicerina libre o

2.2.3 Solubilidad de las grasas

Tabla 2-1 Solubilidad de los lípidos

2.2.4 Determinación de la temperatura de fusión

2.3.1 Determinación del número acídico

El número acídico se calcula según la fórmula:

2.3.2 Determinación del índice de iodo

El iodo que no ha reaccionado se valora con tiosulfato.

El índice de yodo (x, g) se calcula según la fórmula.

2.3.3 Determinación del número (índice) de saponificación

El número de saponificación se determina según la fórmula:

Donde: x  es el número de saponificación, g

2.3.4 Determinación del índice (número) de éster

2.5 HIDRÓLISIS DE LOS GLICÉRIDOS CON LIPASA