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TRIGO
Maria Alejandra Otavo Pajarito
Daniela Reyes Lugo
Resumen
Las enzimas son catalizadores orgánicos que disminuyen la energía de activación de las reacciones, por lo que
aumentan la velocidad, y permiten que se produzcan a temperaturas y presiones a las que normalmente no tendrían
lugar. Las fosfatasas catalizan la hidrólisis de ésteres y anhídridos de H3PO4, son responsables de la
mineralización del fósforo orgánico del suelo y de la liberación del fósforo inorgánico que utilizan los
microrganismos y las plantas. Se clasifican en fosfatasas ácidas, y alcalinas, las ácidas son producidas por
microorganismos y plantas superiores como el germen de trigo, mientras que las alcalinas son producidas
principalmente por microorganismos. El tiempo de incubación en que la enzima está actuando sobre el sustrato,
influye directamente en la aparición de producto, por otro lado, las enzimas se ven afectadas por ciertos factores
que puede aumentar o disminuir su actividad enzimática, tales como la temperatura optima la cual es de 37°C
generalmente, el pH optimo en un rango entre 5.0 a 5.6, la concentración de enzima, de sustrato y el efecto de un
inhibidor irreversible o reversibles.
a continuación
3 0.3 3.7 0.5 sustrato (BS)
5.6 1.6 0.8 –
4 0.4 3.6 0.5
37 Termostato
Tabla 4: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de pH óptimo 60 Termostato
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6
92 Agua en ebullición
Sustrato
– 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
(ml)
Agua
(ml)
efecto de la concentración de la enzima
Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5
Buffer (ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Buffer (ml)
1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 0.8
Buffer (ml)
1.4 1.2 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.0
Sustrato
[ S ] mM
Enzima
– – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
(ml)
Grafica 1. Curva de calibración patrón fosfatasa
ácida
Resultados y discusión
Para determinar el tiempo óptimo de la reacción
Para realizar la curva de calibración de fósforo catalítica enzimática, se tuvo en cuenta la
inorgánico se utilizó un patrón de fósforo 0,04mg/ml absorbancia obtenida de cada muestra a cierto
para cada tubo, sin embargo, la concentración de esta determinado tiempo de reacción tal como se muestra
era diferente para cada uno, por lo cual se calculó la en la tabla 11, a partir de esta, se calculó la
concentración de fósforo para cada tubo tal como se concentración de producto de fósforo inorgánico
muestra en la tabla 10. para cada una de las muestras. Una vez obtenidas
estas concentraciones se dividieron en su respectivo
Antes de calcular dichas concentraciones, se leyó la tiempo de reacción, de esta forma se pudo obtener la
absorbancia de cada uno de los tubos sin tener en actividad enzimática y la cantidad de producto por
cuenta la concentración de patrón de fósforo min.
inorgánico. A partir de las absorbancias obtenidas y
de la concentración de fósforo para cada tubo, se Posteriormente, con los datos obtenidos, se
realizó la curva de calibración tal como se representa representaron en la gráfica 2 comparando la actividad
en la gráfica 1. De acuerdo a la gráfica se obtuvo una enzimática contra el tiempo y a partir de esta, se pudo
recta con su respectivo ajuste el cual está dado por la obtener que el tiempo óptimo es de 20 min, ya que en
ecuación y=154,01x +0,0215, en donde y representa este tiempo, la cantidad de producto obtenido es
la absorbancia y x la concentración de fósforo para mayor frente a las otras muestras, por otro lado, su
cada absorción. actividad enzimática disminuyó respecto a las otras.
1 BS -0,019 -0,00026 -
0,002
36
4 BE2 0,463 0,00286 0,025 0,00516 5 Para la determinación del pH óptimo de la fosfatasa
8
ácida se tuvo en cuenta los datos de absorbancia de
5 TR2 0,47 0,0029 0,002 0,00055 5 la tabla 12 los cuales representa a cada una de las
77 muestras en donde se utilizó buffer de citrato 0,1M a
diferentes pH. Utilizando la ecuación obtenida en la
6 BE3 0,66 0,0041 0,037 0,00373 10
31 gráfica 1 se calculó la concentración de fósforo que
se encontraba en cada una de las muestras.
7 TR3 0,432 0,00266 - -0,00109 10
0,010
9 Posteriormente, se calculó la velocidad máxima o la
actividad enzimática que alcanzaba cada una de las
8 BE4 0,21 0,0012 0,011 0,00073 15 muestras, dichos datos se encuentran en la tabla 12.
01
A partir de esto, se realizó la gráfica 3 sobre la
9 TR4 0,274 0,00163 0,006 0,00040 15 actividad enzimática vs pH, en donde se observa un
10 comportamiento parabólico. De acuerdo a la teoría
(Zubay, Parson & Vance, 1995), el pH óptimo se
10 0,041 0,000126 0,001 5,697E- 20
BE5 13 05 determina con el punto de la velocidad máxima, en
este caso comparando con la gráfica 3, dicho punto
11 0,86 0,00544 0,050 0,00251 20 estaria ubicado en un pH de 5 y de acuerdo a la
TR5 22
literatura ("Fosfatasa - Diccionario Médico", 2016)
12 0,777 0,0049 0,044 0,00147 30 el pH óptimo para la fosfatasa ácida está entre 5.0-
BE6 1 5.6 y la actividad enzimática obtenida fue de
13 0,43 0,0026 - -0,00059 30
0.00135.
TR6 0,017
9 En la muestra 3, se presenta la mayor actividad
enzimática respecto a las demás muestras, esto quiere
decir que a los 10 minutos que dura la reacción, en la
muestra 3 se generó mayor producción de fósforo
inorgánico, gracias al buffer citrato 0,1M.
BS 0,017 -2,9E-05 -
3,2E-
06
1 7352,9
2 8474,5
3 9174,3
4 9569,3
5 9708,7
6 9779,9
7 9923,1
8 9810,8
[I](mg/ml)i [I](mg/ml)f KI
5 0,5 2
1 2932,04
2 3214,28
3 2368,42
4 1551,72
5 1153,84
6 918,36
7 762,71
8 412,84
Conclusiones
Tabla 17. Velocidad por muestra sin inhibidor
La curva de calibración de fósforo
inorgánico, nos permitió calcular la
Vmáx´ Km´/Vmax Km´
concentración de fósforo que había en cada
10000 0,00004 0,4 procedimiento y así mismos nos permitió
calcular la actividad enzimática en cada una
de ellas.
El pH óptimo de la fosfatasa ácida obtenido Datateca.unad.edu.co. Revisado el 12
fue de 5.0, lo cual de acuerdo a la literatura es
Marzo 2016, desde
el pH esperado en la práctica.
La temperatura óptima permite que la http://datateca.unad.edu.co/contenidos/2000
actividad enzimática sea máxima hasta cierta 02/MODULO%20SISTEMAS%20METAB
temperatura en la cual después desnaturaliza
a la enzima, por lo cual la temperatura OLICOS%20NUTRICIONALES/leccin_8_f
obtenida de 60°C no fue la esperada ya que actores_que_afectan_la_cintica_enzimtica.ht
sobrepasa a la temperatura óptima de 37°C.
La concentración de enzima es directamente ml
proporcional a la velocidad de la reacción, Pin, G., & Guzmán, C. (2010).
por lo cual entre más enzimas se utilicé, la
reacción ocurrirá más rápido. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE
El tiempo óptimo para la reacción enzimática FOSFATASA ALCALINA SÉRICA EN
fue de 20 min, en donde la producción de
fósforo inorgánico fue máxima, pero la CANES (1st ed., pp. 7-13). Facultad de
velocidad de reacción no. Medicina Veterinaria y Zootecnia, U. A. G.
R. M. Revisado desde
http://www.fcv.uagrm.edu.bo/sistemabibliot
Bibliografía ecario/doc_tesis/PIN,%20LEDA-20101118-
155347.pdf
ENZIMAS - LibroBOTANICAOnLine -
Zubay, G., Parson, W., & Vance, D. (1995).
ENZIMAS. (2007). Forest.ula.ve. Revisado
Principles of biochemistry. Dubuque, Iowa:
el 12 Marzo 2016, desde
Wm. C. Brown.
http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/enzimas/
Fosfatasa - Diccionario Médico. (2016).
Portalesmedicos.com. Revisado el 12 Marzo
2016, desde
http://www.portalesmedicos.com/diccionari
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Joyce, B., & Grisolia, S. (1960). Purification
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Kansas Medical Center. Revisado desde
http://w3.ualg.pt/~jvarela/pl/p8/joycegrisolia
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LECCIÓN 8 Factores que afectan la
cinética enzimática. (2002).