Cromatografia de Afinidade

Uma característica importante de muitas proteínas é a sua capacidade de se ligar a

moléculas específicas de uma forma não covalente. Esta propriedade pode ser usada
na purificação de proteínas através da cromatografia de afinidade.

Nesta técnica, a molécula, conhecida como o ligando, que se liga especificamente

à proteína de interesse, está covalentemente ligada a uma matriz inerte e porosa.

Quando uma mistura passa através deste material cromatográfico, a proteína de

interesse liga-se ao ligando imobilizado, enquanto outras substâncias são eluídas ao
longo da coluna com o tampão.

A proteína-alvo pode assim ser recolhida numa forma altamente purificada a partir da
alteração das condições de eluição até que a proteína seja libertada da matriz
cromatográfica. A grande vantagem da cromatografia de afinidade é a sua capacidade
de explorar as propriedades únicas das proteínas ao invés de pequenas diferenças
nas propriedades físico-químicas entre as proteínas.

A matriz cromatográfica da cromatografia de afinidade tem que ser quimicamente

inerte, ter alta porosidade e possuir um grande número de grupos funcionais capazes
de formar ligação covalentes com o ligando. Um dos poucos materiais disponíveis que
segue estes critérios é a agarose. Esta possui numerosos grupos hidroxilo livres,
sendo a matriz mais utilizada. Se o ligando tem um grupo amina primário que não é
essencial para a sua ligação à proteína de interesse, o ligando pode ser ligado
covalentemente à agarose num processo de dois passos:

A agarose reage com o brometo de cianogénio para formar um intermediário ativo mas
estável;

O ligando reage com a agarose ativada para formar um produto covalentemente

ligado.

Muitas proteínas são incapazes de interagir com o ligando acoplado ao brometo de

cianogénio, devido a interferências estéricas com a matriz de agarose. Este problema
é resolvido através da inclusão de espaçadores entre a matriz de agarose e o ligando.
Isto é conveniente efetuado através do uso de resinas comerciais ativadas. Uma
dessas resinas é a agarose ativada com epóxis, em que o grupo espaçador (contendo
até uma dúzia de átomos) se liga à resina a um grupo epóxi reativo. O grupo epóxi
pode reagir com muitos grupos nucleofilicos dos ligandos, permitindo, deste modo, que
o ligando escolhido se ligue covalentemente à agarose através de uma cadeia com um
comprimento definido.

O ligando usado na separação de uma proteína particular através da cromatografia de

afinidade tem que possuir uma afinidade suficientemente elevada para se ligar à
proteína, mas não de um grau tão elevado ao ponto de evitar a sua eluição.
Após a ligação da proteína à coluna cromatográfica, esta tem que ser libertada da
matriz. Um dos métodos é passar na coluna uma solução de um composto que tenha
uma maior afinidade do que a proteína para o local da ligação à coluna. Outra forma é
alterar as condições da solução de uma forma em que o complexo ligando-proteína
não permaneça de uma forma estável, como por exemplo, alterando o pH, a força
iónica e ou a temperatura. No entanto, é necessário algum cuidado ao manusear estas
condições para não danificar a proteína de interesse.

A cromatografia de afinidade tem sido utilizada na purificação de substâncias, como

enzimas, anticorpos, proteínas transportadoras, recetores de hormonas, membranas e
até células. Por exemplo, já se conseguiu ligar a insulina, uma hormona proteica, a
uma matriz de agarose para purificar um recetor de insulina. O poder de separação da
cromatografia de afinidade é, usualmente, bastante maior do que outras técnicas
cromatográficas. Na verdade, a substituição de vários passos cromatográficos por um
só em que use cromatografia de afinidade na separação de uma proteína de interesse
leva a maiores rendimentos.

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​ ​Metodologia

Formatos gerais para cromatografia de afinidade

O esquema mais comum para realizar uma separação em cromatografia de afinidade
tradicional e HPAC figura 2
Primeiro, uma amostra é injectada na coluna de afinidade sob condições que permitem
uma ligação forte pelo alvo ou analito de interesse com o ligante imobilizado. Estas
condições de aplicação envolvem tipicamente o uso de um tampão aquoso que tem um
pH e força iónica que mimetizam o ambiente nativo do ligando e o seu alvo. Os
compostos da amostra que têm pouca ou nenhuma interacção com o ligando eluirão da
coluna durante este passo, dando um pico não retido. O próximo passo utiliza um
tampão de eluição para dissociar o alvo do ligando de afinidade. Este passo de eluição
requer frequentemente a alteração da composição da fase móvel para promover a
eluição do alvo, como pode ser conseguido alterando o pH ou adicionando um agente
competidor para deslocar o alvo da coluna. Durante esta etapa de eluição, o alvo
liberado pode ser coletado para posterior análise ou uso. Se um suporte a HPLC for
usado na coluna de afinidade, também poderá ser possível durante essa etapa monitorar
o alvo de eluição diretamente por um método on-line. Ambas as abordagens on-line e
off-line podem ser combinadas com métodos de detecção como absorbância,
fluorescência ou espectrometria de massa. Depois que o destino tiver sido eluído, a
coluna poderá ser regenerada antes do próximo aplicativo de amostra passando pelo
buffer do aplicativo original.
O formato mostrado na Figura 2 para captura e eluição de alvo é às vezes conhecido
como o modo de ativação / desativação de eluição de cromatografia de afinidade. Esta
abordagem tem sido amplamente utilizada para isolamento de compostos e
pré-tratamento de amostras em análises biomédicas e farmacêuticas devido à sua
simplicidade, flexibilidade, seletividade e facilidade de uso. Este formato também pode
ser utilizado com muitos tipos de ligantes de afinidade, como lectinas, boronatos e
anticorpos. Além disso, é relativamente fácil automatizar esse formato ao usar colunas
de afinidade apropriadas para o trabalho em HPAC ou como parte de sistemas HPLC; É
possível até usar este modo em alguns casos para a detecção direta de analitos. A
detecção direta no modo de eluição do passo é comumente realizada usando detectores
on-line de absorbância ou fluorescência, mas a detecção baseada em espectrometria de
massa ou um reator pós-coluna também é possível.
Métodos que empregam eluição isocrática podem ser desenvolvidos em cromatografia
de afinidade se o alvo retido tiver afinidade fraca ou moderada para o ligante
imobilizado. Essa situação permite que uma única fase móvel seja usada como o
aplicativo de amostra e o buffer de eluição. O resultado é uma abordagem conhecida
como cromatografia de afinidade fraca (WAC) ou cromatografia de afinidade dinâmica.
O WAC tem sido usado em várias aplicações farmacêuticas e biomédicas. Um exemplo
comum é o uso de eluição isocrática para separações quirais baseadas em colunas de
afinidade que contêm enzimas imobilizadas como tripsina, α-quimotripsina e
celobiohidrolase I ou proteínas séricas como albumina de soro humano (HSA),
albumina sérica bovina (BSA) e α 1​ ​-glicoproteína ácida (AGP). Um exemplo de tal
separação é fornecido na Figura 1 . Além disso, o WAC tem sido explorado como uma
ferramenta para testes de triagem de drogas. Por exemplo, este método tem sido usado
com colunas de tripsina e trombina mais HPLC e espectrometria de massa para a
descoberta de drogas baseada em fragmento / triagem de design de amidinas, ou ligantes
miméticos de arginina. Esta abordagem de triagem também foi utilizada na avaliação de
ligantes ou inibidores da toxina da cólera . O uso combinado de microcolunas de
afinidade com HSA é outra opção que foi recentemente explorada como um meio para o
rastreamento de alto rendimento das interações droga-proteína.

Outro formato que é frequentemente utilizado para cromatografia de afinidade em

análises biomédicas é a extração por afinidade. Nesta abordagem, um analito específico
ou grupo de analitos é removido ou extraído da amostra por uma coluna que contém um
ligando de afinidade imobilizado. Os alvos retidos são então eluídos e passados ​para um
segundo método para análise. Anticorpos são frequentemente colocados em colunas
para uso na extração por afinidade, fornecendo um método conhecido como
imunoextração. No entanto, outros ligantes (por exemplo, boronatos ou lectinas)
também podem ser usados ​neste formato. Quando faz parte de um sistema HPAC, a
extração por afinidade pode ser utilizada com alguns ligantes para remover os alvos das
amostras em menos de alguns segundos (veja a Figura 3). Esta característica tem sido
usada para medir as frações livres de drogas e hormônios nas misturas de soro ou droga
/ proteína com colunas que contêm anticorpos imobilizados ou HSA como o ligante de
afinidade.