Cromatografía es una palabra que proviene del griego croma-color y grafos-

escribir –escritura a color– que técnicamente significa la separación física de

compuestos coloridos (colorantes o pigmentos) de un extracto o mezcla orgánica.
El término Cromatografía fue nombrado por el botánico ruso Mijaíl Tswett en
1906, aunque el método data desde el año 1850 cuando Friedrich Ferdinand
Runge, químico alemán, quien descubrió la cafeína, separó anilinas con un
disolvente en un papel poroso: la primera cromatografía en papel.
El principio fundamental de la cromatografía es la separación de dos o más
compuestos con propiedades físicas diferentes que les permiten repartirse en dos
fases: una estacionaria y otra móvil. Como ejemplo, tenemos que en la
cromatografía en papel, la fase estacionaria es el papel filtro y la móvil un
disolvente como el agua o el alcohol etílico (etanol).
La fase estacionaria, es una fase fija que puede ser desde un papel filtro o una
lámina de aluminio cubierta con polvo de sílice (SiO2, componente principal de la
arena) o bien partículas de sílice dentro de un soporte rígido de vidrio o de metal
conocido como columna.
La fase móvil, por el contrario es la fase que mueve o arrastra a la mezcla de
compuestos a través de la fase estacionaria y de todo el sistema cromatográfico.
Esta fase móvil pude ser un líquido como el alcohol, o un gas inerte como el
helio o el nitrógeno. Basándose en la cromatografía en papel, Tswett separó los
pigmentos que dan color a las plantas (clorofilas, xantofilas y carotenos),
utilizando como fase estacionaria un tubo de vidrio (columna) relleno de
carbonato de calcio, material del que se fabrican los gises, usando como
adsorbente un polisacárido de la fructosa (inulina) y pasó a través de ella, éter de
petróleo para arrastrar la mezcla de pigmentos. Debido a esta separación de
colores, denominó cromatografía a esta técnica e inventó la cromatografía en
columna.
Por lo tanto, la definición más amplia de la cromatografía, es la separación de
mezclas complejas que se basa en el principio de retención selectiva de
moléculas químicamente similares, según su masa molecular y carga iónica.
Permite la identificación y cuantificación de los componentes que se separan.
Según la disposición de la fase estacionaria, la cromatografía puede ser
cromatografía plana, en capa fina y en columna; según la fase móvil se clasifica
en cromatografía de líquidos, de gases y de fluidos supercríticos; y según la
interacción entre la fase estacionaria y la fase móvil, tenemos la cromatografía de
adsorción, de reparto, de intercambio iónico, de afinidad y de exclusión
molecular.
La aplicación de la cromatografía es muy amplia, puede ser utilizada en todas las
ramas de la ciencia, a menudo, los científicos necesitan separar los componentes
de una mezcla para identificarlos y determinar aquel o aquellos responsables del
aroma, del color y del sabor de los frutos, de las propiedades medicinales o
tóxicas de una planta, de los compuestos específicos que ayudan a la
clasificación de una especie o bien, los que funcionan como señales químicas en
las interacciones entre los diferentes organismos.
Es por ello, que aunque la palabra cromatografía se utilice hace más de 110 años,
los avances científicos y tecnológicos nos presentan una innovación continua de
equipos de cromatografía de gases (GC) y de líquidos (HPLC), con el
acoplamiento de técnicas como la espectrometría de masas que permite la
identificación de compuestos a concentraciones muy pequeñas con una alta
eficiencia y rapidez.
Clasificación de las técnicas
cromatográficas
1. De acuerdo con la forma del lecho
cromatográfico:
1.1 Cromatografía plana
Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en
capa fina” o “en capa delgada” porque la fase estacionaria
recubre un soporte plano y rígido.

Disposiciones
experimentales para
Cromatografía ascendente en realizar una cromatografía
capa fina en papel descendente
(izqda.) y ascendente
(dcha.).
Cromatografía ascendente en
capa fina: colocación de una
muestra (con 3 componentes),
desarrollo de la cromatografía y
revelado del cromatograma.
Rf es el factor de retardo o
retraso, que mide la movilidad
relativa de cada componente con
respecto al máximo posible, la
distancia recorrida por el frente
de fase móvil.
Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D
Componente 3: Rf = c / D
1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo
inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por
capilaridad y se va produciendo
la separación de los
componentes
6: se marca el frente de avance
del disolvente y se deja secar la
placa
7: revelado de los componentes
ya separados y medida de su
avance

1.2 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y
varios cm de longitud.
F.M. gas, F.E. sólida: columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-
20 m de longitud.
F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con menor diámetro
y 30-100 m (incluso más) de longitud.

Puede verse una animación del avance de las moléculas por la

columna.
Funcionamie
nto de una
columna,
mostrando la
carga de la
muestra y
diversos
momentos a
lo largo de la
elución:

1. Muestra
depositad
a sobre el
lecho
cromatog
ráfico
2. La
muestra
penetra
en el
lecho
3. Se añade
fase
móvil
4. Comienza
la
separació
n de los
compone
ntes de la
muestra

7. Eluye el
primer
compone
nte

9. Eluye el
segundo
compone
nte
2. De acuerdo con el estado físico de las fases
fase móvil
líquida gaseosa
“cromatografía “cromatografía
líquida” de gases”
Cromatografía Cromatografía
sólida
fase líquido-sólido gas-sólido
estacionaria Cromatografía Cromatografía
líquida
líquido-líquido gas-líquido

2.1 Cromatografía de gases

Con fase móvil gaseosa.

 Cromatografía gas-líquido
 Cromatografía gas-sólido

2.2 Cromatografía líquida

Con fase móvil líquida.

 Cromatografía líquido-líquido
 Cromatografía líquido-sólido

2.2.1 HPLC

Cromatografía líquida de alta presión o de alta eficacia (cuando

se emplean particulas de fase estacionaria muy pequeñas y una
presión de entrada relativamente alta).
[HPLC, de High Pressure Liquid Chromatography / High
Performance Liquid Chromatography]

3. De acuerdo con el mecanismo de separación

Nota: Ésta es una clasificación conceptual; en la práctica, el
mecanismo que rige la separación puede ser mixto; p.ej.,
adsorción+reparto.

3.1 Cromatografía de adsorción

(atención: es adsorción, no absorción)

Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la

muestra sobre la superficie de un sólido activo. La adsorción es
la capacidad de las superficies para fijar moléculas.

La F.E. es siempre sólida. Ejemplos: alúmina, gel de sílice,

carbón activo, fosfato cálcico, hidroxiapatito...

3.2 Cromatografía de reparto

Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la
fase estacionaria (caso de la cromatografía de gases), o
diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y
estacionaria (caso de la cromatografía líquida).

Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o

disolvente asociados a la celulosa (papel) o al soporte sólido que
forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de
diatomeas, gel de sílice, celulosa en polvo...

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el
intercambio de iones. ¿Qué significa intercambio de iones? La
F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los
componentes de la muestra que tienen carga opuesta.

 Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva,

une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de la
muestra (de ahí la palabra intercambio).
 Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa,
une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien los de
la muestra.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos

covalentemente a la F.E. sólida):

intercambiadores intercambiadores
 catiónicos aniónicos
carboxilato
dietilaminoetilo (DEAE)
sulfonato
dietil-(2-
fosforilo
hidroxipropil)aminoetilo
carboximetilo (CM)
polietilenimina
sulfopropilo (SP)

La F.E. suele llamarse “resina” (de intercambio iónico).

Puede verse una animación de una cromatografía de

intercambio aniónico.

Las biomoléculas poseen frecuentemente varios grupos

ionizables, de modo que su carga eléctrica neta depende del pH
del medio en el que se encuentran (es decir, la F.M.).

3.4 Cromatografía de exclusión

También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se
basa en diferencias de tamaño, forma o carga entre las
moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo
más habitual es aprovechar las diferencias de forma y
tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de
exclusión por tamaño, de filtración en gel, de permeación
en gel o de tamiz molecular.
 Esquema
de la
separación
de
moléculas
de distinto
tamaño
durante
una
cromatogr
afía de
exclusión.

Pulsando
entrada de fase
sobre la móvil
imagen de detector
la columna columna
a la cromatográfica
derecha se con
relleno poroso
mostrará
señal
el aspecto
en detalle
del relleno,
que ilustra
el
diferente
acceso de
las
moléculas
a los poros
dependien
do del
tamaño de
aquéllas.

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de

exclusión.
Ejemplos: para la separación de proteínas y polisacáridos se
usan como F.E. polímeros lineales entrecruzados (es decir, que
forman enlaces transversales). Los más comunes son dextranos
(marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y
poliacrilamida (Biogel P). Estos materiales, en forma de
pequeñas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en
disoluciones acuosas, generando un retículo o matriz
tridimensional, con poros de tamaño definido.

Aplicaciones:

 Para la purificación de una proteína (al igual que otras

técnicas cromatográficas).
 Se puede establecer una correlación entre el tamaño
molecular y la movilidad en la columna de exclusión, por lo
que esta técnica se emplea para determinar masas
moleculares. Dicha correlación es aproximadamente lineal
pero sólo dentro del llamado “intervalo de fraccionamiento”
o “intervalo de resolución” propio del tipo de F.E.
empleado.
 Para eliminar sustancias de pequeño tamaño molecular de
una muestra proteica (p.ej., las sales inorgánicas en un
“desalado” de la muestra, eliminación del exceso de
reactivos tras tratar una proteína en el laboratorio,
eliminación de inhibidores enzimáticos,...). El resultado es
similar a una diálisis, pero más rápido.
 (más aplicaciones en Freifelder, 1991)

3.5 Cromatografía de afinidad

Variedad particular de cromatografía en la que la separación se
basa en la especificidad biológica singular de interacción
entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la
F.E.; los ejemplos más comunes son las interacciones enzima-
sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-receptor.

F.E.: un soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel de

agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de
afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor
de una enzima, anticuerpo, antígeno, hapteno, sustancia
transportada, hormona, oligosacáridos, lectinas (proteínas con
afinidad por oligosacáridos)...

Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de

afinidad.

4. Algunas técnicas especiales

4.1 Cromatografías de fase normal y de fase invertida
Fase normal: cuando la F.E. es más polar que la F.M.

Fase invertida: cuando es más polar la F.M.

[Nota: se suele ver el término "fase reversa", expresión

incorrecta que debe evitarse (la normativa IUPAC indica que en
inglés debe decirse ReversedPhase y no Reverse Phase).]

4.2 Análisis isocrático

La composición de la fase móvil permanece constante a lo largo
del proceso de elución.

4.3 Elución con gradiente

La composición de la fase móvil se cambia, de forma continua o
en etapas, a lo largo del proceso de elución
(respectivamente, gradiente continuo y gradiente
escalonado o en etapas).

4.4 Cromatografía bidimensional

Una vez separados los componentes de la muestra, parte de
ellos o todos se someten a etapas adicionales de separación
bajo diferentes condiciones, en otra columna o, en el caso de la
cromatografía plana, en dirección perpendicular.

Ejemplo: Huellas dactilares estudio de proteínas (Freifelder-

193ss)
Etapas en la realización de una
cromatografía
Cromatografía plana
Cromatografía en columna
(papel o capa fina)
1.- Preparación del
1.- Preparación del soporte y fase
soporte y fase
estacionaria.
estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna.
2.- Aplicación de la
2.- Aplicación de la muestra. muestra.
Secado.
3.- Elución:
a) Lavado de componentes no
retenidos. 3.- Desarrollo de la
b) Liberación, desplazamiento o cromatografía.
elución propiamente dicha de los
componentes retenidos.
4.- Recolección de fracciones o
4.- Secado de la placa.
análisis del efluente en continuo.
5.- Revelado y
5.- Análisis, cuantificación o
cuantificación en su
revelado.
caso.
6.- Regeneración de la fase
estacionaria.

Recogida del efluente

El efluente de una columna se suele
recoger en forma de pequeñas porciones o
fracciones, comúnmente con la ayuda de
un dispositivo mecánico llamado colector
de fracciones.

Esquema de un colector de fracciones.

En cada tubo cae un número determinado
de gotas o un cierto volumen. A
continuación el soporte gira, de modo que
el tubo siguiente queda colocado bajo la
salida del efluente. Las gotas se detectan
mediante una célula fotoeléctrica; cada
gota interrumpe el haz de luz y así se
cuenta.

Detección
Los componentes de la muestra separados se detectan en el
efluente:

a. Mediante su análisis en continuo. Por ejemplo:

o midiendo absorbancia a 280 nm para proteínas
o midiendo absorbancia a 260 nm para ácidos nucleicos
o midiendo radiactividad
b. O bien mediante el análisis de las fracciones una vez
recogidas.
o cualquier tipo de análisis (absorbancia, radiactividad,
ensayo enzimático, ensayo biológico...)