Avaliação da ação de peptídeos derivados de secreções animais em

modelo in vitro de neuroinflamação

CHUBA, T. N.¹,², SANTA-CECÍLIA, F. V.¹, ALVAREZ-FLORES, M. P.², CHUDZINSKI-TAVASSI, A. M.², CURY, Y.¹,²
¹Laboratório Especial de Dor e Sinalização, Instituto Butantan. ²Center of Excellence in New Target Discovery, Instituto Butantan.

Introdução Resultados

A progressiva disfunção e perda de neurônios e axônios dos

sistemas nervosa central e periférico, características de processos
neurodegenerativos, são associadas à neuroinflamação, estresse
oxidativo e disfunção mitocondrial.
Células envolvidas nas respostas imunes inata e adaptativa,
principalmente macrófagos, podem adentrar o cérebro em condições
neuroinflamatórias. Este evento contribui para o agravamento da
condição inflamatória do cérebro e contribui para a neuroinflamação e
neurodegeneração crônica. Desta forma, a produção elevada de óxido
nítrico mostrou-se estar correlacionada à incidência de processos
neurodegenerativos.
Diversos estudos já foram desenvolvidos para caracterizar as
moléculas que apresentam ações para o controle destes fenômenos.
Neste contexto, duas moléculas desenvolvidas no Instituto Butantan
apresentaram resultados promissores.
Viabilidade Celular: Nenhum dos peptídeos A teve Células do DRG estimuladas ou não por LPS:
qualquer efeito tóxico nas células, nas concentrações • [NO] Ideal: LPS aumenta a liberação de Nitritos 48 horas
testadas. após o tratamento (Fig. 1B).
• Nenhum dos tratamentos alterou a produção de NO
Macrófagos Peritoneais: induzido por LPS (dados não mostrados).
• [NO] Ideal: LPS aumenta a liberação de nitritos entre
10 a 48 horas após o tratamento. O tempo de 24h foi Crescimento de Neuritos:
escolhido para estudos subsequentes (Fig. 1A). • 10 nM de rLosac e 10 µM de CRF (na presença de
• O pré-tratamento com rLOSAC inibiu a liberação de PGE2) foram efetivos na promoção do crescimento de
NO induzida por LPS (Fig. 1C). neuritos (Fig. 3B, C).
• Efeitos similares foram observados para o P3 (150, • P2 e D3, nas nossas condições experimentais, não
200, 250 nM) e D3 (150, 200 nM) (Fig. 1 D, E), apresentaram resultados significativos na indução do
assim como para 10uM CRF (Fig. 1F). crescimento de neuritos (Fig. 3C).
A
B A B

• Crotalfina (CRF): um peptídeo identificado no veneno da Cascavel

(C. d. terrificus), apresenta ação analgésica. Dados preliminares
mostram que em (1) ensaios in vitro deste peptídeo preveniram a
desmielinização, possivelmente por uma ação direta em células
precursoras de oligodendrócitos ou em oligodendrócitos
mielinizantes e (2), em um modelo experimental in vivo de
encefalomielite autoimune, que a Crotalfina interfere com o
desenvolvimento de sinais clínicos da doença.
• rLosac: uma hemolina derivada do extrato das cerdas da lagarta
C D
Fig. 2. Efeito dos tratamentos na Viabilidade Celular em culturas primárias de: (A) macrófagos peritoneais
de ratos; (B) Células do DRG de ratos.
Lonomia obliqua que apresenta atividade de proteção e
sobrevivência celular. Conjuntamente, dois peptídeos (P2 e D3),
derivados do Losac, foram desenvolvidos in silico e sintetizados com
A B C
o objetivo de comparar sua atividade com a proteína recombinante
original.

Objetivos D
Baseado nos efeitos da Crotalfina e rLosac, os principais
objetivos foram:
1. Avaliar as alterações induzidas pela Crotalfina, rLosac, P2 e D3 em E F
parâmetros inflamatórios (óxido nítrico) em cultura celular de
gânglios da raiz dorsal (DRG) e em macrófagos peritoneais de ratos,
estimulados ou não por LPS;
2. Avaliar a ação da Crotalfina, rLosac, P2 e D3 no crescimento
neuronal (ensaio de crescimento de neuritos) em células do DRG.

Metodologia

Fig. 1. Produção in vitro de NO (Ensaio de Griess). (A) Macrófagos peritoneais de ratos após estímulo
de 1 μg/μl de LPS. (B) Células do DRG de ratos após estímulo com 1 μg/μl de LPS. Efeitos do pré- Fig. 3. Avaliação do crescimento neuronal (Ensaio de Crescimento de Neuritos). (A) Controles (TGF e
tratamento (2 h) de rLosac (C), P2 (D), D3 (E) e CRF (F) na produção de NO por macrófagos Estaurosporina). Células tratadas com: (B) rLosac, P2 e D3. (C) CRF, PGE2 e CRF + PGE2. (D)
peritoneais de ratos estimulados com 1 μg/μl de LPS. Imagens de microscopia ótica representando o crescimento de neuritos após 3 dias de tratamento.

Conclusões Perspectivas Futuras

Os resultados sugerem:
- Determinação dos efeitos de cada molécula na
• Um efeito anti-inflamatório para o rLosac, P2, D3 e produção de citocinas inflamatórias em cada tipo
celular, permitindo uma melhor caracterização dos seus
CRF, caracterizados neste trabalho pela inibição da
efeitos na inflamação e neuroinflamação.
liberação de NO por macrófagos. Efeitos similares
- Avaliação dos efeitos dos tratamentos em co-
foram descritos na literatura para CRF em neurônios do
culturas (entre macrófagos e células do DRG), assim
DRG e para rLosac, em condrócitos e células como em outros modelos de neuroinflamação.
endoteliais; - Confirmação dos efeitos no crescimento de
• rLosac e CRF podem promover o crescimento de neuritos em experimento com maior sensibilidade, como
neuritos, indicando um possível efeito na sobrevivência a plataforma HCS.
e manutenção funcional de neurônios.

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