SISTEMAS DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS (LNPs)VERSUS

NANOPARTÍCULAS DE OURO (AuNPs)

NA ENTREGA INTRACELULAR DE siRNA PARA TERAPIA GÉNICA
1 Instituto Superior de Engenharia de Lisboa
Filipa Pires1, Pedro Ferreira1, Sofia Brás1
Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa
Instituto Politécnico de Lisboa

INTRODUÇÃO
Os siRNA (small interfering RNA) são pequenos fragmentos de RNA constituídos por 21 a 25 pares de nucleótidos, resultado da clivagem de dsRNAs pela ação da endonuclease Dicer. O uso de siRNA tem como
objetivo a inibição ou redução da expressão destes genes, através de um fenómeno designado RNAi (RNA interference), anulando a proliferação das células cancerígenas e, consequentemente, retardando a
eventual apoptose. O RNAi é um mecanismo exercido por moléculas de RNA complementares a mRNAs, o qual inibe a expressão génica na fase de tradução ou dificulta a transcrição de genes específicos [1,2,3].
Face a isto, o siRNA constitui um potencial agente de tratamento de diversas doenças desde genéticas a diversos tipos de cancro [1], tais como casos de carcinoma hepatocelular humano (HCC) e de linfomas de
células B, ambos causados pela sobreexpressão de proto-oncogenes (c-MYC e CCND1, respetivamente). O desafio incide na entrega intracelular eficiente dos siRNA nas células alvo dada à sua rápida degradação
por ribonucleases e, ainda, à sua dificuldade em passar pela membrana celular (Transfeção), visto que os siRNAs são moléculas relativamente grandes e de natureza poli-anionica [2]. A transfeção destas pequenas
moléculas para as células alvo por meio destes sistemas dá-se por diversas formas, tais como por interação eletrostática de AuNPs com a membrana celular; por endocitose mediada por recetor (reconhecimento
de recetor-ligando na superfície celular). Quando já no citosol do alvo, estes siRNAs são libertados do sistema e direcionados a complexar com proteínas multiméricas designadas por RISC (RNA induced silencing
complex). O complexo formado é guiado e alinhado até reconhecer por complementaridade de bases mRNA alvo, induzindo à sua clivagem, degradação e consequente silenciamento do gene respetivo. Assim,
diversas técnicas de entrega de siRNA são desenvolvidas para contornar os referidos problemas e garantir uma maior eficiência nas terapêuticas de inibição da expressão dos oncogenes.
No presente trabalho, pretende-se então comparar dois estudos de sistemas de entrega que envolvem vários componentes, entre os quais nanopartículas como carriers destas moléculas. No primeiro estudo, de
2016, para aplicação a casos de tratamento de HCC tem-se um sistema de nanopartículas de ouro (AuNPs) conjugadas com polímeros catiónicos com o siRNA encapsulado; no segundo estudo, de 2015, refere-se a
sistemas de nanopartículas lipídicas (LNPs) conjugadas com anticorpos monoclonais para casos de linfomas das células B. Ambos os casos com o intuito do silenciamento dos genes respetivos.

Modified gold nanoparticles for intracelular Harnessing RNAi-based nanomedicines for

delivery of anti-liver cancer siRNA2
VS therapeutic gene silencing in B-cell malignancies3
1. TIPOS DE CÉLULAS E GENE 1. TIPOS DE CÉLULAS E GENE

Avaliação da expressão * Modelo de cancro no sangue

Avaliação da expressão
Huh7- células do MCL- Linfoma das
hepatoma humano Heterodímero com factor de Proto oncogene Células de Manto* Proteína ciclina D1 (cycD1)
Proto oncogene
transcrição MAX células Granta-519
c-Myc
CCND1
- Inexistente em células B:
- Reguladora de cinases CDK  fases G1/S do ciclo celular
- Transformação neoplásica = O hepatocarcinoma humano (HCC – Human hepatocellular carcinoma) ; - Interação com supressores tumorais
- Desregulação da proliferação celular e interações célula-célula

2. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA DE ENTREGA DE SIRNA 2. PREPARAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA DE ENTREGA DE SIRNA

*bPEI - polímero catiónico - branched polyethyleneimine

Preparação do sistema de entrega: siRNA/bPEI*/AuNPs Preparação do sistema de entrega: αCD38/LNPs/siRNA

Transfeção
LNPs/siRNA
αCD38/LNPs/siRNA

Caracterização do sistema de entrega: • Nanopartículas modificadas na sua superfície com lípidos

ionizáveis conjugados com anticorpos monoclonais anti-CD38 Caracterização do sistema de entrega:
AuNPs bPEI*/AuNPs siRNA/bPEI*/AuNPs (αCD38 mAbs) – sendo o αCD38 um receptor sobreexpresso na
Electroforese superfície destas células tumorais.
15,26 nm 37,92 nm 89,93 nm
Diâmetro • LNPs possuem grupos maleimida aos quais se dá a interação
hidrodinâmico química com o complexo αCD38 mAbs na forma reduzida;
• A seletividade dos siRNA a estas células tumorais é dada pelo
reconhecimento do anticorpo ao receptor e induz à endocitose e
Aumento consequente libertação dos siRNA endocitados no citosol das
- Rácio ótimo da Zeta Potencial negativo = carga superficial negativa a pH fisiológico
interação células alvo.
electroestática* entre
siRNA e bPEI/AuNP; 3. TRANSFECÇÃO
- Atraso da migração ao -21,5 mV
12,3 mV 7,3 mV
longo do aumento do Método: Endocitose mediada por recetores (por reconhecimento da ligação recetor CD38 ao anticorpo).
rácio.
* Interação electroestática entre 4. EFICÁCIA DA TRANSFECÇÃO DO SIRNA E SILENCIAMENTO DO CCND1
grupos fosfato siRNA e grupos
amina do bPEI - Permite a interação
Zeta potencial eletrostática Especificidade e Transfeção do complexo nas MCLs – in vitro:
3. TRANSFECÇÃO
- Cocultura de MCL humanas que expressam GFP e de células TK1 (linfomas T de
Interações eletrostáticas entre o siRNA e a membrana celular – a formação do murganhos) sem αCD38 mAbs.
Método: - Incubação com αCD38-LNPs-siRNA , estando o siRNA marcado fluorescentemete.
complexo foi suficiente, não sendo necessário agente transfetante.
Cinzento – Células não B (são as células TK1)
4. EFICÁCIA DA TRANSFECÇÃO DO SIRNA E SILENCIAMENTO DO C-MYC Vermelho – MCLs - intensidade mais elevada  maior seletividade
Roxo – MCLs sem mAb  diminuição da intensidade  ligação é via CD38.
A [siRNA] de 10 nM  73% de knockdown
suficiente para demonstrar que o sistema
*FI – Fluorescence Intense Expressão da proteína CycD1 Controlo
de entrega foi eficaz, induzindo a supressão
da expressão do oncogene. (Citometria de Fluxo)

47200 FI 43500 FI 40800 FI 27900 FI 16300 FI

αCD38-LNPs-siCycD1  55,7%
de redução nos níveis da
proteína CycD1 (em comparação
com αCD38-LNPs-siLuc)

Deteção da proteína traduzida a partir do gene (Microscopia de fluorescência) Interrupção do ciclo celular na fase G0/G1 (a célula continua em
Devido a Knockdown do gene CCDN1 divisão celular)

Menor Inibição da
Células transfectadas com o Menores **Em Testes In Vivo  Murganhos com xenoenxertos de células MCLs da medula óssea
complexo siRNA/bPEI/AuNPs tradução expressão
valores de FI proteica
- αCD38/LNPs/siRNA ligam-se especificamente às MCL na medula óssea (BM).
do c-MYC
- Silenciamento do gene prolongou a sobrevivência dos murganhos com linfomas da BM

CONCLUSÃO
Quando avaliados os tratamentos utilizados em cada um dos estudos, é possível aferir que ambos têm como alvo o silenciamento de genes com grande importância na regulação celular, nomeadamente na supressão de tumores. Ambos os
oncogenes estão envolvidos no desenvolvimento de neoplasias através da sua expressão e, consequentemente, ao serem inibidos, constituem um importante mecanismo de morte de células cancerígenas.
A terapêutica que utiliza siRNA como mecanismo de supressão tumoral enfrenta ainda muitos obstáculos, nomeadamente a rápida degradação que o siRNA é alvo durante a fase de entrega às células e a possibilidade de induzir “off target” de
outros genes. Desta forma, é de extrema importância desenvolver métodos que aumentem a eficiência de transporte e entrega de siRNA em células cancerígenas. Os estudos avaliados no presente trabalho utilizam como métodos de
transporte nanopartículas de ouro (AuNPs) e nanopartículas lipídicas (LNPs). Até ao presente, estes sistemas de transporte representam uma tecnologia emergente e tem vindo a ser aplicada em diferentes tipos de cancro, tais como do fígado,
da mama, do pâncreas, entre outros.
Quando comparados ambos os sistemas é possível, em primeiro lugar, referir que o com LNPs podem apresentar uma vantagem clinicamente benéfica em relação às AuNPs devido ao direcionamento seletivo direcionado por anticorpos, pois
permitem reduzir a quantidade total de medicamentos necessários para a terapêutica (apresentam uma citotoxicidade reduzida para as células ditas “normais” e que não são alvo dos tratamentos em questão).
Ambos os métodos de Transfeção verificaram-se eficientes, na medida em que induziram o knockdown do respetivo oncogene alvo (73% e 56% para o 1º e 2º estudos, respetivamente), o que poderá sugerir que o 1º artigo detêm uma
eficiciência superior à da obtida no 2º artigo, embora neste último os ensaios tenham sido expandidos para uma vertente in vivo (e não apenas in vitro).
Referências
Mestrado Engenharia Biomédica
[1] Dana, H., Chalbatani, G. M., Mahmoodzadeh, H., Karimloo, R., Rezaiean, O., Moradzadeh, A., … Gharagouzlo, E. (2017). Molecular Mechanisms and Biological Functions of siRNA. International Journal of Biomedical Science : IJBS, 13(2), 48–57 U.C.: Seminários 2
[2] Shaat, H., Mostafa, A., Moustafa, M., Gamal-Eldeen, A., Emam, A., El-Hussieny, E., & Elhefnawi, M. (2016). Modified gold nanoparticles for intracellular delivery of anti-liver cancer siRNA. International Journal of Pharmaceutics, 504(1–2), 125–133. Semestre verão 2017/2018
[3] Weinstein, S., Toker, I. A., Emmanuel, R., Ramishetti, S., Hazan-Halevy, I., Rosenblum, D., … Peer, D. (2016). Harnessing RNAi-based nanomedicines for therapeutic gene silencing in B-cell malignancies. Proceedings of the National Academy of Sciences, 113(1), E16–E22.
[4] Faria, M. H.; Rabenhorst, S. H. (2006). Impact of the C-MYC oncogene on cancer. Revista Brasileira De Cancerologia, (52), 165-171.
[5] GeneCards - Human Gene Database. http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MYC&keywords=c-MYC,Gene (Acedido a 07/04/2018). Docente: Cecília Calado Abril 2018