Detección de números bajos de copias de ADN del HPV, mediante hibridación in situ fluorescente

combinada con microscopía confocal como alternativa a la reacción en cadena de la polimerasa in situ.
G. Lizard a,*, M.-C. Chignol b, C. Souchier c, P. Roignot d, Y. Chardonnet b, D. Schmitt b

Abstracto
En las lesiones genitales infectadas por el virus del papiloma humano (VPH), los criterios histológicos y la
tipificación del ADN del VPH tienen valor pronóstico. Por lo tanto, los métodos no radioactivos, como la
hibridación in situ, se usan ampliamente ya que preservan la organización histológica del tejido y permiten la
detección y caracterización del ADN del VPH. Sin embargo, la sensibilidad de estos métodos a menudo se
limita a la detección de números bajos de copias del ADN del VPH en células aisladas o en secciones de tejido,
y por lo tanto, se han explorado técnicas alternativas. En el presente estudio, se visualizaron 1-2 copias de
ADN de HPV en células SiHa mediante amplificación in situ de secuencias de ácido nucleico con la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o mediante hibridación fluorescente in situ (FISH) asociada con la observación
mediante escaneo láser confocal. microscopía (LSCM).
El último procedimiento se evaluó para su uso en secciones de tejido histológico para identificar números
bajos de copias del ADN del VPH. Se investigaron las lesiones genitales que fueron negativas por hibridación
enzimática in situ y FISH pero con sospecha histológica de infección por HPV, y se obtuvieron señales intensas
tanto con PCR in situ como con el uso combinado de FISH y LSCM. Por lo tanto, la combinación de FISH con el
examen LSCM puede ser tan valiosa como la PCR in situ para detectar genes virales presentes en pequeñas
cantidades en células aisladas y en secciones de tejido.
Palabras clave:
Virus del papiloma; Hibridación in situ; PCR in situ; Microscopía confocal de escaneo láser.
1. Introducción
Muchos estudios han sugerido un papel etiológico del virus del papiloma humano (VPH) en la infección del
tracto genital, la génesis de las lesiones y en la progresión a carcinomas (Schiffman, 1994). La detección del
ADN del VPH es de interés en las biopsias genitales, especialmente cuando los tipos de VPH potencialmente
oncogénicos 16 o 18 están presentes debido a un mayor riesgo de malignidad. La hibridación in situ junto con
los criterios histológicos son valiosos para evaluar el grado de infección por VPH y malignidad pero, en tales
lesiones, el número de copias de ADN de VPH es bastante bajo, variando de 1 a 50 por genoma celular como
se muestra por Southernblot o PCR (Ikenberg et al., 1990, Berumen et al., 1994, Brown et al., 1994, Jeon et al.,
1995). Como la sensibilidad de los métodos de hibridación in situ está limitada a 10-50 copias por célula, la
señal correspondiente a un número de copias inferior del ADN del VPH por célula no puede detectarse
mediante hibridación enzimática in situ (EISH) y microscopía de campo brillante (Syrja¨nen et al., 1988;
Gue'rin-Reverchon et al., 1989) o por hibridación fluorescente in situ (FISH) y examen de microscopía de
fluorescencia convencional (Lizard et al., 1994). La sensibilidad de la detección del ADN del VPH debe
mejorarse para detectar tan solo de 1 a 2 copias del ADN del VPH por célula.
Se han explorado diferentes formas para amplificar las señales de hibridación in situ. Por lo tanto, se han
desarrollado varios métodos para inhibir la difusión del cromógeno en células y tejidos, y se han usado
agentes antifading para atenuar la disminución de la señal fluorescente bajo excitación luminosa (Longin et
al., 1993). También se han empleado tintes o sustratos enzimáticos fluorescentes con altos rendimientos
cuánticos (Speel et al., 1992; Siadat-Pajouh et al., 1994), así como métodos inmunohistoquímicos muy
sensibles, como el método catalizado de deposición del reportero (CARD) (Van Gijlwijk et al., 1997) utilizando
como informador la tirámido flúor Cy3-29 (Schmidt et al., 1997) o estreptavidina-nanogold combinado con
autometalografía de acetato de plata (Zehbe et al., 1997). La amplificación de ácidos nucleicos mediante la
reacción en cadena de la polimerasa in situ (PCR) para detectar y caracterizar números bajos de copias de
genes por amplificación de secuencias de ácido nucleico específicas también se ha informado en infecciones
virales (Haase et al., 1990; Nuovo et al. , 1991a, b, 1992a, b, Chardonnet y otros, 1994, Pan et al., 1997).
Para mejorar la detección de señales de hibridación in situ, también se pueden usar equipos altamente
sensibles para la detección de fluorescencia tales como cámaras CCD enfriadas o microscopía confocal de
barrido láser (LSCM) (Viegas-Pequignot et al., 1989; Tanke et al., 1995). . En comparación con la microscopía
convencional de campo brillante y fluorescente, LSCM ofrece una mayor sensibilidad a la luz y una mayor
resolución espacial (Brakenhoff et al., 1979) y también permite una detección y discriminación más específica,
sensible y precisa de pequeñas secuencias de ácidos nucleicos (Baak et al. al., 1987). Además, es posible
adquirir imágenes digitales en serie y, posteriormente, la reconstrucción tridimensional (Tekola et al., 1994)
puede ayudar a la caracterización de las células infectadas, especialmente cuando las señales de hibridación in
situ son de pequeño tamaño y / o de baja intensidad fluorescente. y localizado en varios planos focales. Por lo
tanto, como se detectaron 1-2 copias de ADN de VPH en depósitos celulares de células de SiHa mediante el
uso combinado de LSCM y FISH (Lizard et al., 1994), nos preguntamos si la sensibilidad de los combinados
utilizados de FISH y LSCM era la lo mismo que la PCR in situ no solo para células aisladas sino también para
secciones de tejido.
En el presente estudio, se muestra que la sensibilidad de FISH combinado con LSCM era la misma que la PCR
in situ, y permitía la detección de tan solo 1 o 2 copias de ADN de HPV en células aisladas de SiHa. Además, las
lesiones genitales que fueron negativas por EISH y FISH pero se sospecha histológicamente de infección por
HPV por el HPV común 6/11 se investigaron simultáneamente mediante PCR in situ y con el uso combinado de
FISH y LSCM para comparar la sensibilidad de cada método en secciones de tejido histológico. En esas
condiciones, mientras que el ADN del VPH no fue detectado por EISH o FISH mediante microscopía estándar,
el ADN se demostró mediante PCR in situ y examen mediante microscopía de campo brillante, y mediante el
uso combinado de FISH y LSCM. Por lo tanto, este último método puede ser tan adecuado como la PCR in situ
para demostrar bajos números de copias de ADN de HPV en células aisladas y en secciones de tejido.

2. Materiales y métodos
2.1.
Preparación celular
Se usaron células SiHa derivadas de un carcinoma uterino (Pater y Pater, 1985). Contienen 1-2 copias de HPV
DNA tipo 16 integrado en el ADN celular. Las células se cultivaron en DMEM (Gibco, Eragny, Francia), suero de
ternera fetal al 10% (Boeringher-Mannheim, Meylan, Francia) y antibióticos (100 U / ml de penicilina y
estreptomicina) (Gibco). Se pasaron cada 3-4 días, se tripsinizaron y se sembraron a 2 × 106 células por matraz
de plástico de 75 cm2. Para la hibridación in situ y la PCR in situ, se prepararon depósitos de
aproximadamente 40000 células en portaobjetos de cultivos celulares de 3 días, se secaron al aire, se fijaron
en acetona fría durante 10 min y se mantuvieron a -20 ° C.
2.2.
Biopsias
Las lesiones genitales se extirparon de pacientes con condiloma acuminado. Se fijaron rutinariamente en
formalina al 10% (Sigma) y se incluyeron en parafina para el diagnóstico histológico después de tinción con
hematoxilina (RAL, Villiers Saint Paul, Francia). Las secciones se de fi nizaron y se trataron con 3 mg / ml de
pronasa E (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de la hibridación in situ o
la PCR in situ.

Hibridación in situ
La hibridación molecular in situ se realizó en células congeladas y secciones fijas de lesiones con sondas de
plásmidos biotiniladas que contenían todo el genoma de los tipos de ADN del VPH 6/11, 16 y 18 (Gue'rin-
Reverchonetal., 1989) condiciones poco restrictivas (Tm -17 ° DO). Todas las muestras se hibridaron durante la
noche a 37 ° C. Para la hibridación enzimática in situ (EISH), la detección de híbridos de DNADNA se llevó a
cabo mediante una reacción inmunohistoquímica en tres etapas que implicaba sucesivamente un antisuero
anti-biotina de ratón diluido 1: 100 (Dako, Copenhague, Dinamarca), un conejo biotinilado diluido 1:25
antisuero anti-ratón (Dako), y un complejo de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluido 1:50 (Dako). Para
examen por microscopía de campo brillante, las reacciones se potenciaron con una mezcla de
nitrobluetetrazolium (NBT; Sigma) y 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP; BRL, Gaithersburg, MD) (0,33 mg
/ ml NBT y 0,17 mg / ml de BCIP en Tris-HCl 0,1 M con NaCl 0,1 M y MgCl2 50 mM, pH 9,5), y los portaobjetos
se montaron en glicerol (Dako). Para la hibridación fluorescente in situ (FISH), la detección de híbridos ADN-
ADN involucró sucesivamente un antisuero anti-biotina de ratón diluido 1: 100 (Dako), un antisuero anti-ratón
de conejo biotinilado diluido 1:25 (Dako) y un 1 : 50 complejo de estreptavidinafluoresceína (Dako). Los
portaobjetos se contratiñeron con 0,5 mg / ml de yoduro de propidio (Sigma) para visualizar los núcleos, y
para observación con microscopía confocal de barrido láser (LSCM), se montaron en Tris-HCl 0,2 M, pH 7,6 y
glicerol (1: 9 v / v) que contiene el 2% del reactivo antiflujo 1,4-diaza-biciclo- (2,2,2) -octano (DABCO; Sigma).
Para todas las reacciones inmunohistoquímicas, los anticuerpos se diluyeron en solución salina tamponada
con Tris (TBS), pH 8 (Sigma), y entre cada etapa, los portaobjetos se lavaron en TBS. Los controles utilizados
incluyeron la omisión de la sonda viral específica, y la incubación con NBT / BCIP para evaluar la actividad de la
fosfatasa alcalina endógena; en estas condiciones, no se observaron señales de hibridación.

PCR in situ
La PCR in situ se llevó a cabo de acuerdo con la técnica descrita anteriormente (Chardonnet et al., 1994). El
primer paso consistió en la amplificación de la secuencia viral. Los cebadores (Tabla 1) se eligieron en la región
E6-E7 de los tipos de VPH 5, 6/11, 16 y 18 (Soler et al., 1991, 1993). Después de la desparafinación y el
tratamiento durante 15 minutos a temperatura ambiente con 0,3 mg de pronasa E (Sigma), preparados en
Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) (Sigma) y EDTA 5 mM (Sigma), los portaobjetos se cubrieron con 100 ml de
amplificación mezcla y 100 ml de aceite mineral parafínico; se colocaron en un termociclador PTC 101
(Prolabo, Fontenay-sous-Bois, Francia). El ADN se desnaturalizó a 90 ° C durante 4 min y las secuencias virales
se sometieron a 20 ciclos para la amplificación (2 min a 90 ° C, 3 min a 54 ° C, 4 min a 72 ° C), el último
alargamiento fue 7 min a 72 ° C. Los portaobjetos se sumergieron sucesivamente en etanol durante
aproximadamente 15 minutos para dejar caer el cubreobjetos y se lavaron en 2x SSC. Después de 30 minutos
de fi jación en paraformaldehído al 4%, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 5 minutos en 2xSSC
antes de la deshidratación. El segundo paso de la PCR in situ consistió en una hibridación durante la noche a
37 ° C con una mezcla que contiene el genoma del HPV del plásmido biotinilado completo como sonda,
después de calentar en un bloque calefactor a 90 ° C durante 10 min. El genoma completo del HPV del
plásmido utilizado como sondas consistía en HPV 5, 6/11, 16 o 18 clonado en pBR322 (proporcionado por el
Dr. G. Orth, París, y el Dr. H. zurHausen, Heidelberg). Los híbridos de DNADNA se revelaron usando
estreptavidina-fosfatasa alcalina y NBT / BCIP (Soler et al., 1991). Se incluyeron controles positivos y negativos
en las reacciones. En algunos experimentos, oligoprobes utilizados en PCR líquido y descritos en la Tabla 1
fueron biotinilados y aplicados para la detección de productos amplificados. Los controles de amplificación de
genes específicos consistieron en omisión de Taq polimerasa en mezcla de PCR, uso de cebadores de tipos de
VPH heterólogos (ADN de VPH tipo 5), queratinocitos normales negativos o fibroblastos aislados de piel
humana normal como se describió anteriormente (Lizard et al., 1990; Varani y otros, 1990). Para controlar la
hibridación específica con HPV 6/11, 16 ó 18, se produjeron productos amplificados mediante cebadores
heterólogos. En algunos experimentos con células cultivadas y secciones de tejido, la mezcla de PCR se analizó
después de PCR in situ en geles de acrilamida.

2.5.
Microscopio de campo brillante
Para EISH y PCR in situ, los portaobjetos se examinaron bajo un microscopio (Zeiss, Oberkochen, Alemania) a
una magnificación de × 160-250 para secciones de tejido y 500 para depósitos celulares.
3. Resultados
3.1.
Detección mejorada del ADN del VPH en células SiHa con PCR in situ y microscopía de campo brillante, y con el
uso combinado de hibridación fluorescente in situ y microscopía confocal de barrido con láser
En las células SiHa, que contienen 1-2 copias de HPV DNA tipo 16, intentamos detectar el DNA del VPH
mediante diversos métodos, como la hibridación enzimática in situ (EISH) y la PCR in situ combinada con
observaciones con microscopía de campo brillante e hibridación fluorescente in situ ( FISH) asociado con
observaciones con LSCM. Con EISH, realizado con sonda de HPV 16 biotinilada y demostrado con complejo de
estreptavidina-fosfatasa alcalina y NBT-BCIP, los híbridos de ADN-ADN eran apenas detectables (figura 1A). La
amplificación por PCR in situ mejoró la sensibilidad de la detección de ADN del VPH, y en las células de
SiHahibridizólos puntos de condensación se detectaron fácilmente (Fig. 1B). En las reacciones de control de
EISH, las células de SiHa fueron consistentemente negativas con las sondas de HPV heterólogas o cuando se
omitió la sonda de HPV 16.
La especificidad de la PCR in situ se confirmó mediante diversos controles: las reacciones fueron negativas
utilizando cebadores heterólogos y sonda de HPV 16, cebadores homólogos y una sonda heteróloga tal como
sondas de plásmidos de HPV tipo 5 o 6/11; en ausencia de Taq polimerasa en la mezcla de amplificación, no
hubo señal. De forma similar, no se obtuvo señal por PCR in situ cuando la reacción se llevó a cabo con
fibroblastos y queratinocitos humanos normales. Cuando se utilizó una reacción FISH que implica
sucesivamente un anticuerpo anti-biotina de conejo, un anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado y
complejo de isotiocianato de estreptavidina-fluoresceína en asociación con observaciones realizadas con
LSCM, también se observaron puntos de hibridación en los núcleos celulares de las células SiHacounterstained
con yoduro de propidio como se informó anteriormente (Fig. 2) (Lizard et al., 1994).

Fig. 1. Detección en células SiHa de 1-2 copias de ADN de HPV tipo 16 con microscopía de campo brillante
después de EISH (A) o PCR in situ (B). Los híbridos ADN-ADN se revelaron con complejo de estreptavidina-
fosfatasa alcalina y NBT-BCIP. Las flechas apuntan a señales de hibridación de PCR in situ. Barra de escala = 8
mm.
3.2. Detección mejorada del ADN del VPH en lesiones genitales con PCR in situ y microscopía de campo claro
Entre 19 condilomas genitales acuminados que fueron negativos por FISH con NBT-BCIP, cinco fueron
positivos después de PCR in situ. Se da un ejemplo con una muestra que fue negativa por EISH para HPV 6:11,
16 y 18 (Fig. 3A).
Después de la PCR in situ, se detectó ADN del tipo de HPV 6:11 dando una señal difusa en los núcleos (Fig. 3B)
mientras que no se observó señal con las sondas de HPV 16 y 18. En las reacciones control, la PCR in situ fue
consistentemente negativa usando heterólogos cebadores, sonda de plásmido de ADN de HPV 6:11,
cebadores homólogos y sondas heterólogas; en ausencia de Taq polimerasa en la mezcla de amplificación, no
se detectó señal.
Los otros cuatro condilomas que se volvieron positivos después de la PCR in situ también contenían ADN del
VPH tipo 6:11. No se encontró ningún producto amplificado significativo en la mezcla de PCR después de in
situ PCR

“Fig. 2. Detección en células de SiHa de 1-2 copias de ADN de HPV tipo 16 con el uso combinado de FISH y
LSCM. Híbridos de ADN-ADN fueron revelados por FISH con un complejo de estreptavidina-fluoresceína y los
núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio. Se realizaron dieciséis secciones de núcleos celulares
tomadas a intervalos de 0,5 mm a lo largo del eje z, y se muestran cuatro secciones contiguas. Las flechas
apuntan a puntos de hibridación in situ. Barra de escala = 8 mm.”
3.3. Detección mejorada del ADN del VPH en lesiones genitales con FISH o EISH fluorescente combinado con
exploración con láser de barrido confocal
Dado que el uso combinado de FISH y LSCM permitió la detección de tan solo 1-2 copias de ADN del VPH 16
en depósitos de células SiHa, esta técnica se aplicó a secciones histológicas de los cinco casos de condiloma
acuminado negativo por EISH y NBT: BCIP para HPV 6:11.
Estas cinco muestras de condiloma acuminado fueron positivas para el VPH 6:11 mediante PCR líquida
realizada en las condiciones descritas por Soler et al. (1993) (datos no mostrados). Con el complejo de
estreptavidina-fluoresceína, los puntos de hibridación fueron indetectables mediante microscopía
fluorescente estándar, mientras que LSCM pudo observarlos e interpretarlos fácilmente, con una
autofluorescencia limitada después de un tratamiento con pronasa leve como se muestra en una muestra
típica (Fig. 4).
Las señales de hibridación fluorescentes pequeñas y punteadas fueron claramente visibles y se ubicaron en
diferentes planos de los núcleos teñidos con yoduro de propidio, como se muestra en secciones ópticas a lo
largo del eje z (figura 4A).
La superposición de estas imágenes favoreció la visualización de las señales de hibridación en los núcleos
celulares (figura 4B). La sección transversal en el plano x-z indicada por una línea verde (figura 4C) muestra la
distribución del ADN del VPH desde la parte superior hasta la parte inferior de los núcleos (figura 4D). Las
otras muestras permanecieron negativas después del examen con LSCM.

Fig. 3. Detección por EISH y PCR in situ de

HPV 6:11 en un condiloma acuminado
genital con sospecha histológica de
infección por VPH. Las observaciones se
realizaron con microscopía de campo claro.
Los híbridos ADN-ADN se revelaron con un
complejo de estreptavidina-fosfatasa
alcalina y NBT-BCIP.

(A) reacción negativa EISH. (B) Reacción

positiva de PCR in situ en una sección
contigua. Las flechas apuntan a señales de
hibridación de PCR in situ. Barra de escala =
10 mm.
 Fig. 4. Detección con el uso combinado de FISH y
LSCM de VPH 6:11 en un condiloma acuminado
genital. Los híbridos de DNADNA se revelaron
mediante FISH con un complejo de
estreptavidinfluoresceína y los núcleos se
contratiñeron con yoduro de propidio.

(A) Secciones ópticas a lo largo del eje z tomadas a

intervalos de 0,25 mm.

(B) La reconstrucción de la imagen obtenida a partir

de la superposición de las secciones ópticas que se
muestran en (A).

(C) Localización (línea verde) de la sección óptica

realizada a lo largo del eje z de acuerdo con el
procedimiento de corte z.

(D) Visualización en el plano x-z de las señales de

hibridación de acuerdo con el procedimiento de
corte z realizado en la imagen (C).

Barra de escala = 25 mm

4. Discusión
En el presente estudio, fue posible detectar 1-2 copias de ADN de VPH en células de SiHa y copias bajas de
ADN de VPH en secciones histológicas de lesiones genitales, es decir, condiloma acuminado, tanto mediante
PCR in situ como mediante el uso combinado de FISH. y LSCM. Por lo tanto, se sugiere que FISH combinado
con LSCM, que evita los diferentes problemas relacionados con la amplificación de ácidos nucleicos, puede
representar un método alternativo a la PCR in situ para detectar números bajos de copias de ADN de HPV en
secciones histológicas.
El interés de la PCR in situ es detectar números de copias de ADN de VPH bajos sin la necesidad de extracción
de ADN, que es necesaria para la PCR en fase de solución muy sensible o PCR anidada (Nuovo et al., 1992b,
Chardonnet et al., 1994; 'Leary et al., 1994), y para preservar la morfología de las secciones de tejido.
La principal ventaja de este método es permitir la ubicación simultánea de las células diana infectadas y
evaluar la proporción de células infectadas.
Comparado con EISH, el mayor tamaño de las señales de hibridación después de la amplificación puede
corresponder en los mejores casos a un aumento de aproximadamente 200 veces en el número de copias de
ADN nativo (Haase et al., 1990), pero más comúnmente de aproximadamente 20-50 -doblez. En nuestro caso,
un conjunto de cebadores específicos del tipo dieron productos amplificados de 200-300 pb que se
detectaron sin fondo anormal (Chardonnet et al., 1994). En esas condiciones, en células SiHa, que se sabe que
contienen 1-2 copias de HPV DNA 16 por célula (Pater y Pater, 1985), algunas mostraron varios puntos de
hibridación por núcleo después de la PCR in situ, mientras que otras permanecieron negativas.

Tales diferencias pueden explicarse mediante el uso de la técnica Southern blot que se ha usado para definir
el número de copias de ADN del VPH por núcleo, y que proporciona un valor medio.
Por lo tanto, esto no excluye la posibilidad de que algunas células de SiHa no contengan ADN de HPV tipo 16.
Cuando se utiliza la PCR in situ en secciones de tejido negativas consistentes por EISH, es notable que el
porcentaje de muestras negativas EISH se vuelvan positivas en nuestro estudio después de La PCR in situ
alcanza aproximadamente el 30% (5 casos: 19 casos). Este porcentaje es similar a los reportados previamente
en lesiones genitales (Zehbe et al., 1992) pero podría aumentarse probablemente utilizando sondas de ADN
de otros tipos de ADN del VPH. De hecho, ahora hay evidencia convincente de que el desarrollo de lesiones
genitales sin afectación del VPH específico es excepcional o imposible, y los factores que pueden explicar los
raros casos en que el ADN del VPH no es detectable tienen orígenes metodológicos o biológicos e incluyen:
ADN del VPH inadecuado sondas, sensibilidad del método, mecanismos de transformación y: o existencia de
VPH no identificados (Walboomers y Meijer, 1997).
Hoy, mientras que la PCR in situ favorece la detección de números bajos de copias de ADN del VPH, este
método no se ha utilizado ampliamente debido a las diferentes variables que son difíciles de estandarizar,
como los fijadores, el tiempo de fijación, la digestión con proteasa, el número de ciclos de PCR, retención
específica de productos amplificados, pérdida de productos amplificados fuera de las células o inhibición de
PCR en las células, y a veces conservación difícil de la morfología del tejido (Nuovo et al., 1993; Nuovo, 1996).
De hecho, para mejorar la eficacia de productos amplificados específicos, se ha utilizado un grupo de
conjuntos de cebadores (Haase et al., 1990; Nuovo et al., 1991b) así como la reacción de inicio en caliente que
implica la adición de Taq polimerasa después de calentar el mezcla de hibridación (Nuovo et al., 1992b).
El uso de un conjunto de cebadores de consenso tomados en la región L1 del virus del papiloma el genoma, y
bien adaptado a la PCR líquida, también ha dado resultados interesantes cuando los productos amplificados se
revelaron con el ADN del VPH total de los tipos 6:11, 16:18 y 31:33:35 (Bernard et al., 1994).
Para eludir estos diferentes problemas técnicos relacionados con la PCR in situ, el uso combinado de FISH y
LSCM constituye un método alternativo para la detección de bajos números de copias del ADN del VPH, y abre
nuevas perspectivas para caracterizar células infectadas in situ en secciones histológicas de tejidos. De hecho,
nuestro método que permite la detección de tan solo 1-2 copias del ADN del VPH tiene la misma sensibilidad
que la PCR in situ, que puede ser difícil de realizar, y como PCR líquida, que es una técnica precisa (Shibata et
al., 1988). ; Soler et al., 1991, 1993). Sin embargo, la PCR líquida no permite realizar análisis multiparámetros
en células infectadas individuales presentes en secciones de tejido. Como nuestro método es altamente
sensible y es posible usar FISH con otros marcadores fluorescentes que reconocen varios componentes
celulares (Nederlof et al., 1990; Speel et al., 1994), también será posible investigar con precisión, célula por
célula. , las relaciones entre la presencia del ADN del VPH y la incidencia de la expresión del antígeno, la
proliferación celular y la muerte celular (Lizard et al., 1996). Además, LSCM favorece la detección de señales
de baja intensidad de fluorescencia en varios planos focales de secciones de tejido (Lizard et al., 1997) cuando
las señales se dan con fluoresceína o rojo rápido (Van den Brule y col., 1991; Lizard et al., 1994, 1997), y
también permite con reconstrucción tridimensional la visualización de la forma de las señales de hibridación
en los núcleos celulares así como su localización. De acuerdo con nuestros hallazgos actuales, nuestro estudio
confirma el interés de FISH combinado con LSCM para citología e histología con el fin de visualizar pequeñas
cantidades de secuencias de ADN (Sasano et al., 1993). En el presente estudio, una desventaja de la revelación
de híbridos ADN-ADN con tinción con fluoresceína fue un desvanecimiento rápido de señales de hibridación
fluorescentes.
Sin embargo, este problema puede eludirse fácilmente con métodos inmunohistoquímicos que implican la
fosfatasa alcalina y la sal Fast Red TR: naphtol AS-MX phosphate como sustrato de la enzima (Lizard et al.,
1997).
En estas condiciones, los productos de reacción de Fast Red aparecen como precipitados de color rojo bajo un
microscopio Brighfield y dan señales de fluorescencia rojas cuando se excitan con luz verde (Murdoch et al.,
1990). Además, a diferencia de otros fluorocromos, Fast Red no se desvanece en la exposición cuando se
excita con luz verde o durante el almacenamiento (Speel et al., 1992). Así, Fast Red permite una mejor
exploración de las secuencias de ácidos nucleicos que la fluoresceína mediante LSCM en planos sucesivos de
preparaciones celulares o tisulares (Speel et al., 1992; Wessendorf y Brelje, 1992) especialmente para detectar
secuencias de ADN del VPH presentes en pequeñas cantidades ( Lizard et al., 1997). Sin embargo, el uso de
métodos FISH junto con LSCM mejora la sensibilidad de la detección in situ del ADN del VPH.
En conclusión, el uso combinado de FISH y LSCM alcanza una sensibilidad similar a la obtenida por PCR in situ.
Por lo tanto, con ambos métodos, se detectaron tan pocas como 1-2 copias de ADN de HPV en células SiHa, y
se detectaron números bajos de copias de ADN de HPV en secciones de tejido histológico.
Como la PCR in situ sigue siendo difícil de estandarizar debido a muchos problemas asociados con la
amplificación diana de ADN, la principal ventaja de FISH acoplado con LSCM es el uso de métodos clásicos de
FISH que son menos costosos y más fáciles de llevar a cabo rutinariamente que la PCR in situ.