Cromatografía de Gases y

Líquidos
Análisis instrumental.
 Introducción.
¿Que es la cromatografía?
La cromatografía es un método de separación de componentes en mezclas complejas. En todas las
separaciones cromatográficas la muestra se disuelve con una fase móvil (puede ser un gas o un
líquido), la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria fija en el interior de una columna.

El fluido que entra por la

columna se le llama eluyente. El
fluido que sale por el extremo
de la columna se llama eluato
 Introducción.
Clasificación de los métodos cromatográficos en columna
 Introducción.
Cromatografía de adsorción.
Usa una fase estacionaria sólida y una fase móvil líquida o gaseosa. El soluto se absorbe en la
superficie de las partículas sólidas. Cuanto mas fuertemente se adsorbe un soluto, mas lentamente
atraviesa la columna.
 Introducción.
Cromatografía de reparto.
Utiliza una fase estacionaria líquida, en forma de una fina película de alto punto de ebullición sobre la
superficie de un soporte sólido, que en cromatografía de gases es, típicamente, la cara interna de una
columna de cromatografía de sílice. El soluto está en equilibrio entre el líquido estacionario y la fase
móvil, que es en cromatografía de gases es el gas que fluye.
 Introducción.
Cromatografía de intercambio iónico.
En este tipo de cromatografía existen aniones como –SO3- , o cationes como –N(CH3)3+ ,
covalentemente unidos a la fase estacionaria sólida, que generalmente es una resina. Los iones en
disolución. Los iones en disolución de carga opuesta son atraídos a la fase estacionaria por fuerzas
electrostáticas . La fase móvil es un líquido.
 Introducción.
Cromatografía de exclusión molecular.
Esta técnica también llamada de filtración por gel o de permeación por gel, separa moléculas por su
tamaño. Las moléculas de mayor tamaño pasan mas rápidamente que las de menor tamaño. A
diferencia de otras formas de cromatografía, no hay una interacción atractiva entre la fase
estacionaria y el soluto. En su lugar, la fase móvil líquida o gaseosa pasa a través del gel poroso. Los
poros son bastantes pequeño para excluir los solutos grandes. Las moléculas grandes pasan de largo
sin entrar a los poros.
 Introducción.
Cromatografía de afinidad.
Esta forma de cromatografía, que es la mas selectiva, emplea interacciones específicas entre una clase
de moléculas de soluto y una segunda molécula que está unida covalentemente en la fase
estacionaria. Por ejemplo la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo unido a una proteína
determinada. Si se pasa a través de la columna una mezcla que contiene un millar de proteínas, solo la
proteína que reacciona con el anticuerpo se fija a la columna
 Introducción.
El cromatograma.
El cromatograma es la representación de la respuesta del detector en función del tiempo de elución

Si las concentraciones son bajas, aA es igual a

1. Entonces:

La constante de equilibrio (KC)

entre las dos fases del soluto A:
donde nS y nM son las cantidades de
moles de analito en las dos fases y VS y
VM son los volúmenes de las dos
Donde aA es el coeficiente de actividad
de cada fase. La constante de equilibrio (KC) se denomina
constante de distribución o de reparto
 Introducción.
El cromatograma.
El tiempo de retención
(tR ) está dada por:

El factor de retención (k) se

usa para comparar la
velocidad de migración de
los solutos en las columnas:

El factor de selectividad (α)

de una columna para 2
solutos Ay B se define como: Donde: tR = tiempo de retención de la fase móvil
tS = tiempo de retención del analito
donde kB y kA son los factores de retención de tM =tiempo de la fase móvil no retenida que
atraviesa la columna en un tiempo mínimo
B y de A
 Introducción.
Determinación de número de platos
La eficiencia de la columna cromatográfica
aumenta cuanto mayor es el número de
platos N y cuanto menor es la altura H del
plato:

Donde L es la longitud del relleno de la columna. N

también se expresa como:
Donde: tR = tiempo de retención de la fase móvil
tM = tiempo fase móvil no retenida que atraviesa
la columna en un tiempo mínimo
W=es la magnitud de la base del triángulo
 Introducción.
Información del cromatograma.
1. Posición del Pico (variable termodinámica, tR, KC, kC y α)
2. Ancho de Pico (variable cinética, N, H )
3. Forma de pico (simétrica o asimétrica)
 Introducción.
Variables cinéticas que influyen en el ensanchamiento del pico.
El ensanchamiento de banda refleja una pérdida de la eficiencia de la columna. Cuanto más
lenta es la velocidad de los procesos de transferencia de masa que ocurren mientras un
soluto migra por la columna, más ancha es la banda en salida de la columna

*u (velocidad lineal de la fase móvil), Ds (Coeficiente de difusión de la

fase estacionaria), DM (Coeficiente de difusión de la fase móvil), df
(espesor del revestimiento líquido en la fase estacionaria), dp (diámetro
de las partículas de relleno). f(k) y fʹ(k) son funciones de k
λ y γ son constantes que dependen de la calidad de relleno.
B es el coeficiente de difusión longitudinal
Cs y CM son coeficiente de transferencia de masa en las fases
estacionaria y móvil, respectivamente
 Introducción.
Término de trayectoria múltiple A.
El ensanchamiento de una zona en la fase móvil de debe en parte a la multitud de caminos por los
cuales las moléculas o los iones pueden desplazarse por la columna rellena. Obsérvese que la
distancia que recorre la molécula 2 es mayor que la recorrida es mayor por la recorrida por la
molécula 1
 Introducción.
Término de difusión longitudinal B/u.
La difusión es un proceso en el cual las especies migran desde una zona de un medio con mayor
concentración a otro de menor concentración. La velocidad de migración es proporcional a la
diferencia de concentración entre las regiones y el coeficiente de difusión DM de las especies.
 Introducción.
Término de la transferencia de masa de la fase estacionaria y móvil (Csu y CMu)
CS se refiere a la transferencia de masa del analito hacia y desde la fase estacionaria y CM se refiere a
la resistencia a la transferencia de masa dentro de la fase móvil.
 Introducción.
Velocidad de flujo de la fase móvil.
Contribución de varios términos de transferencia de masa a la
altura de plato.
 Introducción.
Mejoramiento del rendimiento de la columna
(Resolución).
Los experimentos de mejoramiento tienen como objetivo
reducir el ensanchamiento de banda (variables cinéticas)
o bien de modificar las velocidades de migración de los
componentes de la mezcla (variables termodinámicas).

La resolución (RS ) de una columna señala que tan

separadas están unas bandas en relación con sus ancho:

Es conveniente que la resolución sea mayor a 1.5 en

análisis cuantitativo.
 Introducción.
Influencia del factor de retención y selectividad en la Resolución.
Optimización del rendimiento de la columna.
Guía para la elección de la condiciones de una buena separación en un tiempo mínimo:
1. Aumentar los platos teóricos (siempre y cuando se reduzca la
altura de la columna).
2. Se puede mejorar la resolución si se modifican las variables
cinéticas (en función de H). Las mas importantes es disminuir
el tamaño de partícula de la fase estacionaria y la viscosidad
de la fase móvil y aumentar la constante de difusión.
3. En fases móviles gaseosas k puede mejorarse cambiando la
temperatura (T) y para fases móviles líquidas un cambio en la
composición del solvente permite manipular k.
4. α puede mejorarse: a) cambiando la composición de la fase
móvil, b) cambiando la temperatura de la columna (T) y c)
cambiando la composición química de la fase estacionaria.
 Introducción.
Optimización del rendimiento de la columna.
Ejemplo del efecto de la composición de la fase móvil y temperatura
 Introducción.
Forma del pico
Algunos picos cromatográficos son no ideales y presentan deformación hacia la cola o hacia el frente.

La parte superior produce una sobrecarga de la

columna, es decir, por aplicarle demasiado soluto.

La parte inferior se origina por introducir cantidades

pequeñas de soluto que son retenidas con más fuerza
en la fase estacionaria.

La parte central da los picos simétricos ideales

 Cromatografía de Gases (CG)
Definición.
En la cromatografía de gases (CG) se hace pasar el analito en forma gaseosa a través de la columna,
arrastrado por una fase móvil gaseosa, llamada gas portador.

Diagrama esquemático del cromatógrafo de gases. La

muestra de líquido volátil o de un gas se inyecta a través de
un septo (diagrama de silicona), en un inyector caliente, en
cuyo interior se evapora rápidamente. El vapor es
arrastrado a través de a columna por el gas portador , que
puede ser He, N2 o H2 y los analitos después de separados,
pasan por el detector, cuya respuesta aparece en la pantalla
de un ordenador
 Cromatografía de Gases (CG)
Cromatografía gas-líquido (columnas capilares).
En cromatografía gas-liquido la fase estacionaria es un líquido no volátil que recubre la pared interior de una
columna o soporte. En la inmensa mayoría de los análisis se utilizan columnas tubulares abiertas, largas y
estrechas, fabricadas de sílice fundida (SiO2) que actúa como soporte y recubiertas de poliimida (un plástico capaz
de soportar hasta 350°C) y protección contra la humedad atmosférica. Estas columnas se llaman FSWC.
Las WCOT son simplemente capilares cuya pared interna está
revestida con una fina capa de fase estacionaria. En las tipo SCOT la
superficie interna del capilar está cubierta con una capa delgada (30
µm) de un material de soporte, tal como tierra de diatomáceas.
 Cromatografía de Gases (CG)
Columnas capilares utilizadas.
Algunas fases estacionarias líquidas comunes en cromatografía gas-líquido.
 Cromatografía de Gases (CG)
Cromatografía gas-sólido
La cromatografía gas-sólido se basa en la adsorción de sustancias gaseosas sobre superficies
sólidas. Es útil para la separación de especies que no se retienen en columnas de gas líquido,
como los componentes del aire, sulfuro de hidrógeno, disulfuro de carbono, óxidos de
nitrógeno, monóxido de carbono, dióxido de carbono y gases nobles

Los tamices moleculares son

materiales inorgánicos (zeolita:
figura lado derecho) o polímeros
orgánicos (figura lado izquierdo)
provistos de grandes cavidades
 Cromatografía de Gases (CG)
La variable temperatura en la resolución
Elevando la temperatura de la columna:
1. Disminuye el tiempo de retención.
2. Los picos son mas pronunciados.
 Cromatografía de Gases (CG)
El gas portador.
A caudales altos la resolución aumenta: H2 > He > N2
Cuanto más rápido difunde un soluto entre
las fases, menor es el término de
transferencia de masa CU de la ecuación de
Van Deemter. Los solutos se difunden más
rápidamente a través de H2 y de He que de
N2. H2 es usado en columnas capilares,
además de ser el más económico
He es el mas usado para sistemas
acoplados como CG-EM (Espectrometría de
masas) ya que el H2 reacciona con el aceite
de la bomba de vacío del detector.
 Cromatografía de líquidos (CL)
Aplicaciones.

El análisis cuantitativo se basa en el área del pico cromatográfico. Se suele escoger

condiciones en la que la respuesta es lineal, es decir, cuando el área es proporcional a
la cantidad del analito. En la mayoría de los equipos el software del equipo
proporciona e área correspondiente de los picos.
El análisis cualitativo se basa en identificar los compuestos que originan los picos
cromatográficos, mediante detectores acoplados a CG, como por ejemplo: EM e FT-IR.
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Definición.
La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada. Con el
objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de la fase
estacionaria se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de
utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de
cromatografía líquida de alta resolución o eficiencia (HPLC), que requiere de instrumental especial que
permita trabajar con las altas presiones requeridas.
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Columnas.
Se utilizan generalmente columnas de acero de una longitud de 5-30 cm y un diámetro interior de 1-5
mm. Las columnas son caras y se degradan con facilidad, por el polvo o las partículas suspendidas en
las muestras o del disolvente. Por eso se protege la entrada de la columna con una columna corta, la
precolumna, que contiene la misma fase estacionaria que la columna analítica.
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
La fase estacionaria
Fase Normal: el componente principal de la fase Fase Reversa: la fase estacionaria es no polar,
estacionaria es muy polar(partículas esféricas de normalmente silice tratada con R de C8H17 (C-8 o n-
sílice) y la fase móvil es un solvente relativamente octil) a C18H37 carbonos (C-18 o n-octadecil) y la fase
no polar como el hexano o el isopropileter. móvil es un solvente relativamente polar, como el
metanol o el agua.
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Proceso de elución.
La elución es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Las moléculas
del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí por reaccionar con los sitios activos de la
fase estacionaria
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Parámetro para medir la polaridad
La fuerza eluyente (εo) es una medida de la energía de adsorción del disolvente, tomando como
referencia o como valor cero al pentano en relación a la sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente
mayor es su fuerza eluyente respecto a la sílice.

El Índice de polaridad (Pʹ) es una

magnitud que permite cuantificar la
polaridad relativa de una mezcla de
solventes que componen la fase
móvil. En esta escala, los valores de
polaridad varían de 10.2 para un
compuesto muy polar como el agua
hasta –2 para los muy poco polares
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Elución isocrática.
La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente o una mezcla de disolventes de
composición fija.

Disolvente B=Acetonitrilo
Disolvente A=Solución acuosa (25 mM KH2 PO4 y 0.1 g/L
NaNH2 ajustado a un pH de 3.5 con HCl)
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Elución en gradiente
En una elución en gradiente se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,
produciendo un gradiente continuo.

Disolvente B=Acetonitrilo
Disolvente A=Solución acuosa (25 mM KH2 PO4 y 0.1 g/L
NaNH2 ajustado a un pH de 3.5 con HCl)
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Elución en gradiente
En una elución en gradiente se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,
produciendo un gradiente continuo.
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Optimización de 2 o 3 disolventes orgánicos
Aplicación del método
del triángulo para
separar compuestos

Nomograma del porcentaje en volumen de

disolventes que tienen la misma fuerza eluyente
 Cromatografía de líquidos (HPLC)
Detectores
UV-Vis es utilizado en más del 70 % de los equipos HPLC:
• La señal es proporcional a la concentración del soluto (análisis cuantitativo).
• Se detectan alquenos, compuestos aromáticos y aquéllos que tienen uniones múltiples de C, O, N,
y S.
• La fase móvil no debe interferir en la detección.

También puede estar acoplado a detectores de EM

o FT-IR. (Análisis cualitativo)