Universidad de Chile

Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Bioquímica II

PCR
Reaccion en cadena de la
polimerasa

Integrantes: Bárbara Avello

Paulina Campos
Profesor Guía: Isabel Castro
Un poco de historia…

 Técnica desarrollada en 1985 por el

Bioquímico Estadounidense Kary B. Mullis
quien recibió el premio Nobel de Química
de 1993.

 Esta tecnica resultó ser una revolución en

la investigación biológica y médica.
Definición de PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa

Técnica de Biología Molecular que tiene por

objetivo la amplificación directa de un gen (o
fragmento de DNA) o indirecta de un RNA,
presente en mezclas de muy diversas fuentes.

* No es necesaria una purificación previa de la

muestra íntegra original.
 Tiene la capacidad de amplificar millones de
veces fragmentos pequeños de DNA de
hasta 10 Kb (10.000 pares de bases), en un
período de tiempo relativamente corto.

 Es un método muy adecuado para preparar

ácidos nucleicos en una cantidad muy
superior a la de la muestra original.
Objetivo básico de la PCR

AMPLIFICACION
Para disponer de cantidad
suficiente como para
utilizarlo con fines
diversos.
AMPLIFICAR DNA
DETECCION
Para poderlo detectar en
muestras con pequeñas
cantidades del DNA diana.
Fundamentos

Mimetiza el proceso de replicación

Complementariedad BN

Capacidad del DNA para

desnaturalizarse/ renaturalizarse
Requerimientos
1.- Muestra (templado o molde: DNA o cDNA)

2.- Primers

3.- DNA polimerasa resistente a alta

temperatura

4.- Mg++

5.- Desoxinucleótidos trifosfatos – dNTPs

(dATP, dGTP,dCTP, dTTP)

6.- Buffer, KCl

 1.- Templado o Molde
 Molécula que contiene la región de DNA que se quiere
amplificar.

 Puede ser DNA o cDNA.

 Se requiere poca cantidad.

No debe ser necesariamente

puro.

 Tiene que ser libre de altas

concentraciones de EDTA o
cationes que pueden actuar
como quelantes.
 2.-Primers (iniciadores, partidores o
cebadores)
 2 oligonucleótidos sintéticos que flanquean a
la región blanco, uniéndose por
complementariedad de bases a cada uno de
los extremos del fragmento de DNA que se
quiere amplificar.

Primer sentido Primer antisentido

 Deben ser específicos para la secuencia a
amplificar.

 Deben tener idealmente un alto % de C+G,

entre un 40-60%.

 Deben evitar ser complementarios entre si,

especialmente en el extremo 3´.

 Deben evitar formar estructuras secundarias.

 Generalmente su longitud debe variar entre

18 y 30 pb.
 La concentracion debe ser adecuada para
favorecer la hibridacion entre el molde y el
primer.

 Ambos primers deben tener una Tm

(temperatura de melting) similar,con una
diferencia de no mas de 5ºC.
Tm = [2 x (A + T) + 4 x (G + C)] – 5

 La temperatura de annealing o de
hibridacion (Ta) debe ser aprox. 5ºC menos
que los valores de Tm obtenidos.
3.- DNA polimerasa

Características que debe tener la enzima:

PROCESIVIDAD

FIDELIDAD

TERMOESTABLE
Taq DNA polimerasa Termoestable:

-Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas

termales).
-Comete un error cada 10.000 nucleótidos.
-Su temperatura optima de actuación es a
72ºC.
-Su concentracion varia entre 1 a 2 unidades
de enzima por cada 100µL de reaccion.
-No posee la actividad editora o correctora (3`
exonucleasa).

Otras DNA polimerasas termoestables, obtenidas de bacterias

termófilas:
Pwo Pyrococcus woesei
Pfu Pyrococcus furiosus
Tli Thermococcus littoralis
 4.- Mg++ (MgCl2, MgSO4)
Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas.

Determinar la [Mg++] óptima es uno de los

pasos más importantes en la puesta a punto de
una PCR.
[Mg++] muy bajas : la polimerasa no funciona
correctamente, afectando el rendimiento de la
reacción.
[Mg++] muy altas :favorece amplificaciones
inespecificas, afectando la especificidad
reacción.
5.- Desoxinucleótidos trifosfato
(dNTPs)
 Provee de nucleotidos (base+ azucar +
fosfato) a la reaccion para la sintesis de DNA.

 Deben estar presentes en cantidad suficiente

para que se logre la extensión a lo largo de
todos los ciclos (~200 µM cada dNTP).

 No deben estar en exceso para que los iones

Mg++ no estén formando complejos con los
dNTPs.
6.- Buffer y sales
Buffer Mantiene el pH optimo para
que la enzima actúe.

El buffer es en general Tris base

ajustado a un pH específico con HCl.

pH óptimo para Taq: 8.3

Sales KCl: contribuye al plegamiento

correcto de la enzima.
Aditivos adyuvantes
Existen una serie de reactivos que pueden
contribuir a la reacción de amplificación.

 Formamida y el dimetil-sulfóxido (DMSO)

 Glicerol
Equipos: Termociclador
Instrumento programado para cambiar la
temperatura de las muestras rápidamente
desde una temperatura a otra.
 PCR convencional en el
laboratorio
1.Creación del Primer

2.Extracción de DNA (o RNA)

3. PCR

4. Detección de resultados
1. Creación del primer

Los primer o cebadores (compuestos

por oligonucleótidos específicos) son
sintetizados químicamente.

*Para realizar esta labor se utilizan bases de dato

universales y programas computacionales que
establecen la secuencia primer para un gen
determinado.
 2. Extracción de DNA
Se extrae el DNA genómico desde la
muestra a analizar

*Para esto existen Kits

comerciales que aseguran:
 Alto rendimiento.
 Alta pureza.
Gran cantidad de DNA
 La correcta extracción de DNA o RNA
se comprueba mediante la
determinación de:

Integridad y concentración
aproximada de DNA o RNA
(electroforesis en gel de agarosa 1%)
Relación Ác. Nucleicos/Proteínas
(ABS a 260/280 con
espectrofotometro)
3. PCR y sus etapas
3.1
Desnatura-
lización del
DNA

3.3 3.2 Unión del

Elongación iniciador a la
secuencia
de la complementa
cadena -ria
 3.1 Desnaturalización del
DNA
El DNA molde de doble hebra es
desnaturalizado por calor a un t° por encima de
su punto de fusión

T° inicial del PCR: 95°C por 5 min

T° inicial de cada ciclo: 95°C por 30 seg.
 3.2 Alineamiento/unión del
iniciador a la secuencia
complementaria
Se desciende la t° lo suficiente para que
ocurra la hibridación entre los cebadores y el
DNA molde.

T° ideal: 65°C por 45 seg.

 3.3 Extensión/elongación de las
cadenas
La t° es nuevamente aumentada para
favorecer la actividad catalítica de la
polimerasa la cual se ha unido al extremo del
duplex molde-cebador.

T° ideal en cada ciclo: 72°C por 45 seg.

T° Final: 72°C por 10 min.
*Amplificación exponencial
4. Detección de resultados
La detección del producto del PCR se
realiza normalmente mediante una
electroforesis.

*Electroforesis en gel de
agarosa, revelado con rayos
UV gracias a la utilización de
bromuro de etidio (colorante)
Precauciones

 Contaminación con DNA

Controles
 Control sin molde.

 Control positivo.

 Control de primers.
Ventajas Desventajas

Velocidad Secuencia

Facilidad Tamaño limitado

Contaminaciones
Sensibilidad
(por sensibilidad)

Muestras
Aplicaciones PCR

 Huella digital genética.

 Test de paternidad.
 Detección de enfermedades hereditarias.
 Comparación de la expresión génica.
 Clonamiento de genes.
 Mutagénesis.
 Análisis de DNA antiguo.
 Genotipificacion de polimorfismos
Bibliografía
 Texto Ilustrado de Biología Molecular
e Ingeniería Genética (Conceptos,
Técnicas y Aplicaciones en Ciencias
de la Salud), José Luque y Ángel
Herráez.
 Biología molecular y Biotecnología
(2da edición), J.M. Walker y E. B.
Gingold. 1997