Purificación de linfocitos por gradiente de densidad para

su cuantificación por conteo en cámara de Neubauer

Barberán Alison1, Chávez David1, Toaquiza María Belén1, Zambrano Gabriel1
1 Ingeniería En Biotecnología. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Universidad de las
Fuerzas Armadas – ESPE

Resumen. Los linfocitos son glóbulos blancos que se encuentran en la sangre y son las únicas células que
pueden proliferar de forma activa, se originan a partir del líquido linfático de todo el cuerpo y su separación
es importante para determinar y diagnosticar diferentes alteraciones en el sistema inmunológico del paciente.
La técnica más utilizada para la separación de linfocitos se realiza mediante la de centrifugación por gradiente
de densidad. En esta práctica se tomó sangre periférica, en esta se colocó medios de densidad acuosos con
centrifugación para separar y aislar los linfocitos. Se obtuvo tres resultados para concentración de células en
un volumen de sangre: 6.22×106, 1.17×107 y 1.34×107 células/mL sangre y un porcentaje de viabilidad, es decir el
número de células vivas obtenidas, los porcentajes fueron 39,87%, 74,43% y 85,88%.

Palabras clave: linfocitos, gradiente de densidad, placa Neubauer

Abstract. Lymphocytes are white blood cells that are found in the blood and are the only cells that can
proliferate actively, they originate from the lymphatic fluid of the whole body and their separation is important
to determine and diagnose different alterations in the immune system of the body. patient. The most used
technique for the separation of lymphocytes is performed by centrifugation by density gradient. In this practice,
peripheral blood was taken, in which aqueous density media were placed with centrifugation to separate and
isolate the lymphocytes. Three results were obtained for concentration of cells in a volume of blood: 6.22×106,
1.17×107 y 1.34×107 cells/mL blood and a percentage of viability, that is to say the number of living cells obtained,
the percentages were 39.87%, 74.43% and 85.88%.

Key words: lymphocytes, density gradient, Neubauer plates

INTRODUCCIÓN
La sangre está constituida por el 30% de linfocitos en comparación al total de leucocitos sanguíneos. Los
linfocitos poseen la capacidad de reconocer antígenos y responder a ellos. En los tejidos linfáticos han
identificado tres tipos de linfocitos de acuerdo a su tamaño: 90% de linfocitos pequeños y 10% entre linfocitos
medianos y grandes (Ross, M. & Pawlina, W., 2008).

Los linfocitos de acuerdo a su función se clasifican en linfocitos T, linfocitos B y células NK. Los linfocitos T
sufren la diferenciación en el timo, y participan en la erradicación de microorganismos patógenos. Los
linfocitos B son células derivadas de la médula ósea, productores de anticuerpos. Finalmente, los linfocitos
NK son células programadas para destruir ciertos tipos de células transformadas o virus (Abbas, A., Lichtman,
A. & Pillai, S., 2015) (Ross, M. & Pawlina, W., 2008).

Para el aislamiento de linfocitos de una muestra de sangre se empleó la centrifugación por gradiente de
densidad. Según Lomonte (2009), en este proceso se recupera aproximadamente el 50% de linfocitos, y posee
una viabilidad mayor al 90%. En la estratificar de una muestra de sangre se utiliza Histopaque 1077, mezcla
de polisucrosa y solución de diatrizoato, que posee una densidad de 1,077g/mL (Perry, D. & Pasi, J., 1999).
Según Lomonte (2009), las células se separan por la diferencia de densidad: los granulocitos se sedimentan;
los monocitos (linfocitos y monocitos) se mantienen en la interfase entre el plasma y medio; y, los leucocitos
mononucleares se acumulan en el anillo blanco que se forma en la interfase entre el plasma y Histopaque 1007.
Para la contabilización e identificación de linfocitos vivos y muertos se utilizó la cámara de Neubauer,
constituida por una placa base de vidrio. Esta base presentaba en su parte central una cuadrícula de recuento
de 9 cuadros grandes de 1mm de lado, para el recuento de leucocitos se utiliza los 4 cuadros que se ubican en
las esquinas y están divididos en 16 cuadrados con lados de 0.254 mm (Silva, 2006).

El objetivo de la práctica fue la purificación de linfocitos por gradiente de densidad para su cuantificación por
conteo en cámara de Neubauer. Para ello se preparó una dilución de sangre en PBS y homogeneizó, se añadió
el reactivo Histopaque para por centrifugación obtener un gradiente de densidad para purificación de linfocitos
su tinción y conteo en cámara de Neubauer. Mediante el conteo se determinó la concentración de células en
un volumen de sangre y el porcentaje de viabilidad.

PROTOCOLO
La muestra sanguínea fue recolectada a partir de un individuo previamente vacunado con hepatitis B (HB),
tétanos y difteria (dT) y fiebre amarilla (FA). Esta práctica se llevó a cabo en el laboratorio de docencia en la
Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE) según el siguiente protocolo:

Separación de linfocitos mediante gradiente de densidad

1. Se extrajeron 5mL de una muestra de sangre venosa, y colocaron en tubos para plasma (tapa azul). Se
transfirieron a un tubo Falcon de 15 mL con 5mL de 1X PBS para homogeneizar.
2. En otro tubo Falcon 5 mL con Histopaque – 1077, con la ayuda de una pipeta eléctrica se transfirieron
verticalmente 10 mL de la dilución de sangre, previendo que el histopaque no se mezcle con la sangre,
manteniendo las dos fases intactas.
3. Se centrifugó la mezcla inmediatamente a 2000 rpm durante 20 min en una centrífuga de enfriamiento a
4ºC.
4. Se retiró cuidadosamente el tubo e identificaron las tres fases: en la parte superior el plasma, en la parte
media el Histopaque y en la parte inferior los eritrocitos. Entre la capa de plasma y de Histopaque se
encuentró un halo blanquecino, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
5. Se transfirieron con la ayuda de una micropipeta el halo a un tubo eppendorf de 2 mL y centrifugar a 2000
rpm durante 5 minutos.
6. Se eliminó el sobrenadante teniendo cuidado que el pellet no se despegue del fondo. Este proceso se repitió
nuevamente añadiendo suero fisiológico al tubo hasta llenarlo.
7. Se re suspendió el pellet con 1X PBS hasta llenar la mitad del tubo.

Conteo de linfocitos en cámara de Neubauer

1. Se diluyeron los leucocitos (1:10), suspendiendo 10 µL de fase intermedia en un tubo Eppendorf que
contenía 90 µL de Trypan blue, de esta forma se tiñeron las células no viables.
2. Se tomó una alícuota de 10 µL con una micropipeta y se colocó lentamente en la plataforma de la cámara
de Neubauer, la primera en la parte superior y la segunda en la parte inferior.
3. Se realizó la observación de células viables en el microscopio de campo claro a 40X para los 4 cuadrantes
de la cámara.

RESULTADOS
El objetivo de esta práctica fue realizar el recuento de células en cada uno de los cuadrantes de la cámara de
Neubauer. Se empezó el conteo desde el primer cuadrante (superior izquierda) como se muestra en la Figura
1 y luego se fueron contabilizando cada una de las células vivas en los demás cuadrantes. Para garantizar un
porcentaje de error menor, existe una convención que se sigue en el caso de que las células toquen el límite
superior o el izquierdo del cuadro, a estas se las debe tomar en cuenta, pero no se contabilizan si tocan el límite
inferior o el derecho. El cálculo del número de linfocitos por mililitro de sangre se obtiene a partir del número
de células totales con el factor de dilución y el número de cuadros.
 Sobrenadante

PBMC

RBC

Figura 1. Separación en fases por gradiente de densidad.

a) b)

c) d)

Figura 2. Conteo de linfocitos viables en cámara de Neubauer. Se contabilizaron los linfocitos después de la tinción con
tripan blue, sin tomar en cuento aquellos de coloración azul (células muertas) en los cuatro cuadrantes. (a) Cuadrante
N1 = 452 células. (b) Cuadrante N2 = 243 células. (c) Cuadrante N3 = 340 células. (d) Cuadrante N4 = 209 células.
 52 243

340 209

Figura 3. Número de células por cuadrante.

Figura 4. Concentración de total de células por ml de sangre. A) Grupo 1 (roja): 6,22×106 b) Grupo 2 (verde)
1,17×107 c) Grupo 3 (azul): 1,34×107. El promedio de concentración fue de 1,044×107

Figura 5. Porcentaje de viabilidad. A) Grupo 1 (roja): 39,87% b) Grupo 2 (verde) 74,43% c) Grupo 3 (azul): 85,88%.
El promedio de la viabilidad fue de 52,20%

Cálculo del número de linfocitos por mililitro de sangre

Á𝑟𝑒𝑎 = 1 𝑚𝑚 × 1𝑚𝑚 = 1 𝑚𝑚2

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 = 1 𝑚𝑚2 × 0,1 𝑚𝑚 = 0,1 𝑚𝑚3 = 1 × 10−4 𝑚𝐿

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 = 452 + 243 + 340 + 209 = 1244

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑁𝑂 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 = 568 + 382 + 420 + 506 = 1876

Promedio células viables:
1244
= 311
4

Dilución: (90 µL trypan blue y 10 µL de muestra de linfocitos recuperada)

𝑉𝑓 = 𝑉𝑎𝑙𝑖𝑐𝑢𝑜𝑡𝑎 (𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎) + 𝑉𝑑𝑖𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 (𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒)

𝑉𝑓 = 10 + 90 = 100𝜇𝐿

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 100

𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 = 𝑓𝐷 = = = 10
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 10

Numero de cuadrantes: 4
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 ∗ 10 000 ∗ 𝑓𝐷
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
𝑁𝑢𝑚𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑢𝑎𝑑𝑟𝑜𝑠

1244 ∗ 10.000 ∗ 10
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =
4

𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 31.1 × 106 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑒𝑛 5𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒

31.1 × 106 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

× 1𝑚𝐿
5𝑚𝐿
𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 = 6.22 × 106
𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑛𝑔𝑟𝑒

Otra técnica de separación de linfocitos

La clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) es un método para la separación de diversas
poblaciones celulares en función de sus antígenos de superficie (moléculas de CD). En la selección positiva,
las células que expresan el (los) antígeno (s) de interés, que están unidos a la columna magnética, se lavan a
un recipiente separado, después de eliminar la columna del campo magnético. Este método es útil para el
aislamiento de un tipo de célula particular, por ejemplo, linfocitos CD4 (Semple, 1994).

Explique la centrifugación zonal e isopicnica

En la separación isopícnica, las partículas se separan únicamente en función de su densidad. Este método es
ideal para separar células cuyas densidades difieren en más de 0,02 g/ml. El tamaño de partícula solo afecta la
velocidad a la que las partículas se mueven hasta que su densidad es la misma que la del medio gradiente
circundante (Frei, 2015).

La densidad del medio de gradiente debe ser mayor que la densidad de las partículas a separar. Con este
método, las partículas nunca se sedimentarán hasta el fondo del tubo, sin importar cuánto tiempo sea el tiempo
de centrifugación (Harsh, 2017).

La centrifugación de frecuencia-zonal separa las especies moleculares al someterlas a una fuerza centrífuga
alta en un medio de gradiente de densidad. La velocidad a la que las partículas sedimentan depende
principalmente de su tamaño y masa en lugar de su densidad (Lin, 2013). El problema de la contaminación
cruzada de partículas de diferentes velocidades de sedimentación se puede evitar colocando la muestra en
capas como una zona estrecha sobre un gradiente de densidad. De esta forma, las partículas de sedimentación
más rápidas no se contaminan con las partículas más lentas como ocurre en la centrifugación diferencial
(Walsh, 2012).

Medidas de bioseguridad en tomas de sangre en humanos y en animales, así como el transporte de muestras
Medidas de bioseguridad
Según la norma de Exposición ocupacional a los patógenos transmitidos por sangre, emitido por la
Administración de Salud y Seguridad Profesional (OSHA), todos los laboratorios deben adoptar precauciones
estándares, que requieren que todos los materiales de origen humano como sangre, líquidos corporales y tejidos
sean tratados como si fueran infecciosos, por lo que deben seguir las siguientes practicas (Rodak, 2005):

1. El lavado de manos.
2. En el área de trabajo del laboratorio debe prohibirse comer, beber, fumar y aplicar lápiz labial.
3. Las manos, las lapiceras y otros fómites deben mantenerse alejados de la boca y de las mucosas del personal
de laboratorio.
4. Los alimentos y bebidas no deben mantenerse en el mismo refrigerador que las muestras o reactivos del
laboratorio o en donde se guardan o prueban los materiales potenciales infecciosos.
5. Debe prohibirse pipetear con la boca.
6. Las agujas y otros objetos punzocortantes contaminados con sangre y otros materiales potencialmente
infecciosos no deben manipularse de ningún modo.
7. Los elementos punzocortantes contaminados deben colocarse en un recipiente resistente a la perforación.
8. Los procedimientos de manipulación de las muestras deben evitar el salpicado o la producción de gotas,
estos procedimientos pueden realizarse detrás de una barrera, como un protector plástico o gafas.
9. Al personal se le debe proporcionar ropa y equipo protector.
10. Las placas de flebotomía deben rotularse de manera adecuada para indicar los materiales potencialmente
infecciosos.
11. Si se utiliza un sistema de tubo neumático para transportar las muestras, estás deben colocarse en una bolsa
hermética especial, rotulada de manera adecuada con el símbolo de biopeligroso.
12. Cuando los equipos utilizados para procesar las muestras se presentan con contaminación visible o m
cuando requiere mantenimiento o reparación deben desinfectarse, ya sea dentro del laboratorio o por un
servicio de reparación del fabricante.

Transporte de muestras
El UNCETDG establece diferencias para el embalaje, etiquetado y documentación entre las sustancias
infecciosas de categoría A y B, exigiéndose en ambos casos el SISTEMA DE TRIPLE EMBALAJE

Sistema básico de embalaje/envasado triple

Este sistema de embalaje/envasado, que deberá utilizarse para todas las sustancias infecciosas, comprende las
tres capas siguientes:

Figura 6. Esquema simplificado de un triple embalaje para el transporte de muestras, según normas de la ONU.
 Recipiente primario: es el recipiente que contiene la muestra y debe cumplir con las siguientes
características:
 Las muestras de suero, fluidos corporales y/o secreciones en general (esputos), deberán ser enviadas
en tubos o frascos con tapa hermética de goma o rosca. No tapar con algodón.
 Los tubos deben ser envueltos con abundante material absorbente (papel absorbente, algodón u otro),
que permita absorber todo su contenido en caso de ruptura o fuga.
 Los tubos o frascos deberán ser enviados correctamente rotulados con etiqueta adhesiva, con nombre
completo del paciente, fecha de obtención de la muestra, concordando con los datos del formulario.
No usar papel engomado, ya que se despega y no permite una identificación correcta del paciente.

Embalaje/envase secundario: Un segundo embalaje/envase hermético, impermeable y duradero, que

encierra y protege al recipiente o recipientes. Se pueden colocar varios recipientes primarios envueltos en
un embalaje/envase secundario, pero se deberá usar suficiente material absorbente para absorber todo el
fluido en caso de rotura o fuga (Montoro & Moquete, 2014).

Embalaje/envase exterior o terciario: Los embalajes/envases secundarios se colocan en embalajes/envases

exteriores o terciarios de expedición, con un material amortiguador adecuado. El mismo debe ser rígido y
resistente. Los embalajes/envases exteriores protegen el contenido de los elementos exteriores, como daños
físicos, mientras el bulto se encuentra en tránsito (Montoro & Moquete, 2014).

Métodos de criogenización y medios usados para ese fin

Según Polar Expres (2016), los métodos más habituales de ultracongelación son:
 El hielo seco o también conocido como nieve carbónica, en el cual se utiliza dióxido de carbono en estado
sólido, la cual suele estar a una temperatura de -80°C y su poder de enfriamiento es tres veces superior al
hielo convencional, teniendo una capacidad de reducir la temperatura a -80°C en cuestión de minutos. Siendo
este un método apto para el proceso de criogenia, aunque no el más rápido.
 Nitrógeno líquido, en el cual se utiliza nitrógeno puro a una temperatura de -196°C, este se almacena en
grandes tanques y a menor escala en pequeñas cántaras habilitadas para el trasporte de material biológico,
siendo ampliamente utilizado en la conservación de muestras biológicas o criogenia, debido a su forma más
rápida de ultracongelar.

¿Para qué nos sirve hacer la diferenciación de células? ¿Con que otras sustancias o químicos se realizan
estos procesos?
Un conteo de células sanguíneas (CSC) comprueba el tipo y número de células en la sangre. Un conteo puede
dar a su médico información importante acerca de su salud (American College of Cardiology, 2012). Un CSC
es un examen de laboratorio que se realiza comúnmente. Se puede emplear para detectar o vigilar muchas
afecciones diferentes o como parte de un chequeo de rutina (Vajpayee, Graham, & Bem, 2017).

En la tabla 1 se detalla algunas sustancias que se utilizan en procesos de selección de linfocitos mediante
centrifugación por gradiente de densidad.

Tabla 1. Otras sustancias que se utilizan la selección de linfocitos mediante centrifugación por gradiente de densidad
Sustancias Características
Ficoll PM400 Polímero de sacarosa formado por copolimerización de sacarosa con epiclorohidrina, son
Ficoll PM70 altamente ramificada con un alto contenido de grupos hidroxilo (GE Life Sciences, 2007).
Lymphoprep Divide las células sanguíneas en dos fracciones principales, después de la centrifugación las
(LP), Percoll células mononucleares (monocitos y linfocitos) se ubican en la parte superior, mientras los
eritrocitos y granulocitos se sedimentan (Bøyum, Brincker, Martinsen, Lea, & Løvhaug, 2002).
NycoPrep (NP), Se obtiene una suspensión de linfocitos relativamente pura, los monocitos se sedimenta (Bøyum,
iohexol Brincker, Martinsen, Lea, & Løvhaug, 2002)
DISCUSIÓN
La sangre periférica es la fuente primaria de obtención de células mononucleares (linfocitos y monocitos). El
proceso de separación de células mononucleares del resto de los elementos formes de la sangre, se basa en la
diferencia de densidad existente entre ambos (Moreno, 2004). Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica o PBMCs (Peripherial Blood Mononuclear Cells), utilizando el reactivo Histopaque para crear un
gradiente de densidad (figura 1).

El Histopaque – 1077 es una solución estéril probada con endotoxina de polisucrosa y diatrizoato de sodio
ajustados a una densidad de 1.077 g/mL facilitando la recuperación rápida de linfocitos viables y otras células
mononucleares de pequeño volumen en sangre ( Merck KGaA, 2018) como se evidencia en la figura 1. Para
el conteo de linfocitos se usó el colorante Trypan blue en solución para teñir las células no viables. Se
suspendieron 10µL de fase intermedia en un tubo Eppendorf que contenia 90µL de trypan blue lo que dio
como resultado un factor de dilución de 10.

La recuperación de estas células mononucleares y su posterior tinción fue de utilidad para la cuantificación
por medio del conteo en placa de Neubauer como se observa en la figura 2.

Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tienen por objeto determinar el número de cada
uno de los tipos celulares que están comprendidos en una unidad de volumen de sangre (Preparadores de
Oposiciones, 2017). Se efectuó el conteo de células sanguíneas en cámara de Neubauer, este consiste en
determinar el número de células viables y no viables en una placa por conteo en 4 cuadrantes (Pérez, 1997);
en esta práctica se obtuvieron 1244 células viables y 1876 células no viables. Con el número total de células
viables se determinó una concentración de 6.22×106 células/mL sangre,1.17×107 células/mL sangre y 1.34×107 células/mL sangre
para los pacientes de los grupos 1, 2 y 3 respectivamente como se evidencia en la figura 4, estos resultados son
óptimos tal como lo describe (Bastidas) donde indica que la concentración óptima para conteo en
hematocitómetro es de 1 millón de células por mL = 106 células/mL.

Además, se determinó el porcentaje de viabilidad es decir el porcentaje de células vivas obtenidas para cada
una de las muestras de los pacientes de los grupos (figura 5), esto por medio de la relación porcentual entre el
número de células totales y las viables. Los porcentajes fueron 39.87%, 74.43% y 85.88% para los pacientes
de los grupos 1, 2 y 3 respectivamente, con un promedio de viabilidad de 52.20%.

CONCLUSIONES
 El reactivo de Hispotoque permite la segregación de los distintos tipos de células como granulocitos y
linfocitos de la muestra de la sangre. Conocer el número de linfocitos en la sangre nos permite evaluar y
manejar ciertos trastornos de la sangre o del sistema linfático.

 La concentración de linfocitos en los tres pacientes sobrepasa un millón de linfocitos por mililitro de sangre
(6.22×106 células/mL sangre,1.17×107 células/mL sangre y 1.34×107 células/mL sangre) los cuales son resultados óptimos para
conteo en hematocitómetro.

 Los porcentajes de células viables entre los tres pacientes variaron considerablemente desde 39.87%,
74.43% y 85.88% para los pacientes del grupo 1, 2 y 3, respectivamente. Con un promedio de general del
52.20% de células viables.

BIBLIOGRAFÍA
Abbas, A., Lichtman, A. & Pillai, S. (2015). Inmunología celular y molecula, octava edición. España:
ELSEVIER SAUNDERS.
American College of Cardiology. (2012). Cardio Smart. Obtenido de Su prueba: Conteo de células sanguíneas:
https://www.cardiosmart.org/~/media/Documents/Fact%20Sheets/es-US/zx1261.pdf
Bastidas, O. (s.f.). celeromics. Obtenido de Conteo Celular con Hematocitómetro:
http://celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-Camara-Neubauer.pdf
Bøyum, A., Brincker, H., Martinsen, I., Lea, T., & Løvhaug, D. (2002). Separación de linfocitos humanos a
partir de sangre citratada mediante centrifugación en gradiente de densidad (NycoPrep): la depleción de
monocitos depende de la activación de los canales de potasio de la membrana. Scandinavian Journal of
Immunology, 76-84.
Frei, M. (2015). Sigma Aldrich. Obtenido de Isopycnic Centrifugation:
https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/centrifugation-separations.html
GE Life Sciences. (27 de abril de 2007). GE Healthcare Bio-Sciences AB. Recuperado el 24 de mayo de 2018,
de https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/18115827.pdf
Harsh, O. (2017). Quora. Obtenido de Rate zonal and isopynic centrifugation: https://www.quora.com/What-
is-the-difference-between-rate-zonal-and-isopynic-centrifugation
Lin, C. (2013). Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids
Research, 70-94.
Merck KGaA. (2018). Sigma Aldrich. Obtenido de Histopaque 1077:
https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-
aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/10771pis.pdf
Montoro, E., & Moquete, E. (2014). Ministerio de Salud Pública. Obtenido de Procedimientos de Bioseguridad
en el transporte de muestras biológicas en la Red Pública de Servicios:
http://siapsprogram.org/publication/altview/manuals-and-standard-operational-procedures-for-the-
implementation-of-a-unified-pharmaceutical-system/procedimientos-de-bioseguridad-en-el-transporte-de-
muestras-biologicas-en-la-red-publica-de-servicios/
Moreno, R. (2004). Inmunología: Universidad Complutense de Madrid. Obtenido de LYMPHOPREP:
Aislamiento de células mononucleares en sangre periférica por centrifugación en gradiente de densidad. :
http://webs.ucm.es/info/inmuno/arearest/pro/protocol/lymphoprep.pdf
Pérez, E. (1997). Técnicas para medir la concentración de número de entidades. En A. Fuentes, Bioquímica
clínica y patología molecular, Volume 1 (págs. 461-467). Reverté.
Perry, D. & Pasi, J. (1999). Methods in molecular medicine, Hemostasis and Thrombosis Protocols. Totowa:
Humana Press.
Polar Expres. (24 de Mayo de 2016). Criogenia: ultracongelación ¿hielo seco o nitrógeno líquido? Obtenido
de Clinical & Biomedical Logistics Services: https://polarexpres.es/criogenia-ultracongelacion-hielo-seco-
nitrogeno-liquido/
Preparadores de Oposiciones. (12 de Enero de 2017). PROCEDIMIENTOS DIAGNÓSTICOS. Obtenido de
TEMA 27: Recuento celular: fundamento, técnica y aplicaciones: https://www.preparadores.eu/formacion-
profesional/Procedimientos-de-Diagnostico/Procedimientos-de-Diagnostico-Tema.pdf
Rodak, B. F. (2005). Hematología: fundamentos y aplicaciones clínicas. Argentina: Médica Panamericana.
Ross, M. & Pawlina, W. (2008). Histología, texto y atlas color con biología celular y molecular, quinta edicón.
China: Editorial médica panamericana.
Semple, J. (1994). Rapid Separation of CD4 + and CD19 + Lymphocyte Populations From Human Peripheral
Blood by a Magnetic Activated Cell Sorter (MACS). Toronto.
Silva, C. G. (2006). Técnico especialista en laboratorio de atención primaria del Instituto Ctalán de la Salud.
España: MAD.
Vajpayee, N., Graham, S., & Bem, S. (2017). Basic examination of blood and bone marrow. En R. McPherson,
& M. Pincus, Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Elsevier.
Walsh, A. (2012). Turberfield A. DNA cage delivery to mammalian cells. ACS, 50-80.