Universidad San Francisco de Quito

Proyecto I

Ingeniería en Procesos Biotecnológicos

Carolina Cazco y Analía Espín

Extracción de astaxantina a partir de Haematococcus

pluvialis

Quito, 8 de mayo de 2018

 1. Objetivo general
Extraer astaxantina a partir de un cultivo de Haematococcus pluvialis en fase de
aplanospora.
2. Objetivos específicos
● Aplicar tres protocolos de extracción de astaxantina reportados en la literatura.
● Medición cualitativa de la extracción de astaxantina extraída con los protocolos
aplicados.
3. Marco Teórico
Las microalgas son organismos capaces de realizar la fotosíntesis por lo que tienen gran
importancia en el área de biotecnología, ya que tienen la capacidad de producir biodiesel,
pueden biorremediar aguas residuales o generar bioproteínas que son útiles en la industria en
alimentos tanto animal como humana, una de sus propiedades más importantes es la
acumulación de metabolitos: ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga y también están
los carotenoides. Poseen alta eficiencia para fijar dióxido de carbono y también con la
utilización de la luz del sol que les permite hacer biomasa, pueden encontrarse en lagos, ríos,
océanos, en el suelo y en condiciones extremas, para su crecimiento es necesario de N, P, K,
Mg, CO2 y otros nutrientes que sirven como cofactores de enzimas que intervienen en el
metabolismo de estos organismos (Córdoba, et.al; 2015).

Los carotenoides son componentes poliénicos que están formados por 8-10 unidades de
isopreno para obtener compuestos de 40 a 50 carbonos, posee dobles enlaces que forman los
grupo cromóforo con una absorción de 400 a 500 nm dando el color amarillo y rojo,
generalmente se encuentran en la forma trans, su formación se da gracias a la ruta del
mevalonato, donde el ácido mevalónico resulta ser el precursor de los carotenoides; está
presente en hongos, bacterias, algas,plantas, en peces, algunos pájaros y también en los
invertebrados, se consideran pigmentos naturales y accesorios porque permiten la captación
de la luz y protegen a los organismos de la foto-oxidación (Villa, et.al; 2002).

La astaxantina es un cetocarotenoide presente en animales del océano, puede ser producido

por microorganismos como Haematococcus pluvialis o por Phaffia rhodozyma, es el que le
da la coloración rojiza a los crustáceos, moluscos, salmónidos y flamencos; además a este
pigmento se le ha atribuido que puede prevenir el cáncer, pueden aumentar la respuesta por
parte del sistema inmunológico e inhibe radicales libres (Abalde, et.al; 2005). Debido a que
los organismos fotosintéticos poseen la capacidad de hacer una síntesis de novo de la
astaxantina, existe la posibilidad de la producción y extracción a gran escala de este pigmento
de las microalgas debido a que hay gran interés por parte de la industria farmaceútica y
alimentaria. Esta producción con alto rendimiento depende del inóculo base, es decir que las
microalgas deben encontrarse en buenas condiciones bajo ciertas especificaciones físicas y
químicas que le ayuden a producir el pigmento deseado.

4. Justificación
Los carotenoides son muy utilizados para diferentes industrias como la acuicultura, ya que
sirven de alimento dentro del balanceado para especies como salmón, trucha, cultivos de
camarón, etc.; la ornitología, es esencial en el alimento de las gallinas ya que este permite el
color de la yema de los huevos; y en la industria farmaceútica es altamente utilizado como
antioxidante, anticancerígeno, foto protector en diferentes insumos médicos como pastillas y
jarabes (Ramírez, 2013). Debido a la gran demanda que presente ese metabolito secundario
en el mercado y a la baja producción, se aplicarán diferentes métodos de extracción de
astaxantina a partir de H.pluvialis.

5. Pregunta de Investigación
¿Qué método de extracción propuesto es el mejor para extraer astaxantina en la fase de
aplanospora?
6. Hipótesis
De acuerdo con la literatura consultada se espera extraer astaxantina aplicando tres métodos
diferentes para luego realizar una medición cualitativa mediante espectrofotometría y
visualizar el pico en la longitud de onda esperada.

7. Diseño Experimental
Para la extracción de astaxantina se aplicarán tres procesos los cuales varían en la
metodología de ruptura de la pared celular del alga. Los ensayos se plantearon de la siguiente
manera (Tabla 1). Los ensayos se realizarán por duplicado.
Tabla 1.- Ensayos extracción de astaxantina

Método No. Inóculo Temperatura Tiempo en Solvente Sílica

Tratamiento microalgal congelación gel

Método 1 1 1mL - - 1 mL 0,4g

metanol
Método 2 2 1mL 45°C - 1mL Éter -
de petróleo

3.1 1mL -20° C 12h 1 mL 0,4g

acetona
Método 3
3.2 1mL -80° C 12h 1 mL -
acetona
Elaborado por Carolina Cazco y Analía Espín

8. Metodología
La extracción de la astaxantina se hará en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental siguiendo
los tres métodos de acuerdo a la bibliografía consultada y en base a la Tabla 1.
● Microalga
Se utilizará un inóculo de microalgas de Haematococcus pluvialis en fase exponencial de
crecimiento suministrada por la empresa Andes Spirulina (Anexo 1), este inóculo ya se
encuentra en fase de aplanospora, es decir etapa en la que el alga ya ha producido el
carotenoide. Antes de realizar con los ensayos, la muestra de microalgas fue filtrada con la
ayuda de un papel filtro para reducir las impurezas presentes en la muestra.
● Evaluación estado de crecimiento
El estado de crecimiento se visualizará con la ayuda de un microscopio, donde se tomará una
pequeña proporción de la muestra otorgada y se verificará que el alga se encuentre en estado
de aplanospora para empezar con los ensayos de extracción.
● Preparación de ensayos
Cada bioensayo se preparará en un tubo eppendorf grande de 10 mL donde se seguirán las
condiciones establecidas en la tabla 1. Para cumplir con los objetivos del estudio y obtener
una mayor cantidad de microalgas se realizarán un total de 8 ensayos, es decir por duplicado.
● Extracción de astaxantina
Método 1: La extracción de astaxantina se realizará utilizando un solvente (metanol) y
analizando las muestras en un espectrofotómetro. Se tomará una muestra del ensayo y se
centrifugará a 7000 rpm, se retirará el sobrenadante con una pipeta y se añadirá al precipitado
1ml de metanol y 0,4 g de sílica gel. El rompimiento celular se realizará mediante la agitación
celular de las muestras en un Vortex a 2000 rpm durante 10 minutos. Las muestras serán
centrifugadas a 7000 rpm durante 5 minutos, eliminando el sobrenadante y se repetirá el
procedimiento hasta que no se observe el color rojo en la muestra. Se determinará la
absorbancia a 477 nm manteniendo las muestras completamente en la oscuridad (Ramírez,
2013).

Método 2: Se toma una parte de la muestra (1 mL), se realizará una filtración para eliminar el
excedente de agua, una vez que la biomasa esté libre de líquido se añadirá éter de petróleo, Se
centrifugó, el sobrenadante será recuperado usando un rotavapor de cual saldrá el extracto
deseado. Debe tenerse precauciones con la exposición a las altas temperaturas y oxígeno, ya
que el cultivo puede degradarse (Córdoba, et.al; 2015).

Método 3: La extracción de astaxantina en este método se dividirá en dos. Para el primer

ensayo (ensayo 3.1, tabla 1), se colocó 1mL de cultivo de microalgas, se centrifugó, y se
colocó 1 mL de acetona junto con 0,4g de sílica gel con el objetivo de romper la pared celular
del alga. Posteriormente se llevó al vortex durante 10 minutos y se centrifugó. Se repitió este
mismo procesos tres veces. Luego, se colocaron los tubos en una congeladora a -20°C
durante 12 horas para que la eficiencia de la ruptura celular sea mayor. Después, se
centrifugó, se retiró el sobrenadante y se midió con la ayuda de un espectrofotómetro. En el
segundo ensayo (ensayo 3.2, tabla 1), se colocó 1 mL de cultivo, y se colocó 1mL de acetona.
Se colocaron los tubos en la congeladora a -80C durante 12 horas para la ruptura de la pared
celular. Al día siguiente, se centrifugó, se extrajo el sobrenadante y se cuantificó (Cárdenas,
2017).
● Medición de astaxantina
La medición de astaxantina se realizó cualitativamente con la ayuda de un espectrofotómetro
y el programa que ayuda a visualizar el pico en la onda deseada. Se analizó en un rango de
400 nm a 800 nm, esperando obtener un pico en 477 nm. Se colocó 3 mL del sobrenadante
en celdas para proceder a la medición.

9. Resultados
Los resultados se obtuvieron mediante la medición del sobrenadante medido por un
espectrofotómetro y un programa que permite visualizar el pico en la longitud de onda
deseado. Previo a la ruptura celular se observó las células de Haematococcus pluvialis en un
microscopio. Las curvas obtenidas por el espectrofotómetro se indican a continuación.

Figura 1.- Haematococcus pluvialis en estado aplanospora (antes de realizar la ruptura)

Descripción: H. pluvialis se encuentra en el estado óptimo para ser procesada, es decir está
de color rojizo como se esperaba.

Figura 2.- Haematococcus pluvialis en estado aplanospora (después de realizar la ruptura)

Descripción: H. pluvialis luego de aplicar el método 1 y 2 antes descritos. Como se puede

observar las algas no tienen su pared celular rota, aún están circulares y no se extrajo el
carotenoide. El proceso de lisis celular es difícil por lo que se procedió a usar el método 3.

Figura 3.- Sobrenadante extraído a partir de Haematococcus pluvialis

Descripción: A: blanco (agua destilada). B: H. pluvialis + acetona + sílica + 12h a -20C. C y
D: H. pluvialis + acetona + 12h a -80C. Todas las muestras fueron medidas por un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 477 nm.

Figura 4.- Espectro de medición de astaxantina por el método 1 (metanol + sílica gel)

Figura 5.- Espectro de medición de astaxantina por el método 2 (éter de petróleo)

Figura 6.- Espectro de medición de astaxantina por el método 3.1 (-20° C + sílica gel)

Figura 7.- Espectro de medición de astaxantina por el método 3.2 (-80 C)

 10. Discusión
La producción de astaxantina (metabolito secundario) está relacionada con los cambios
morfológicos que ocurre en la microalga, desde un estado de célula vegetativa donde empieza
el crecimiento hasta un estado de color rojo donde se da la acumulación del compuesto. Los
cambios de un estadío a otro pueden ser generados debido a cambios ambientales como altas
temperaturas, salinidad del suelo, deficiencia de nutrientes, intensidad lumínica, entre otras
(Harker, Tsavalos y Young, 1996). Para la extracción de astaxantina se utilizó un cultivo de
microalgas Haematococcus pluvialis en fase aplanóspora (Anexo 2) ya que en este estadío es
cuando el alga ha acumulado en su interior una gran cantidad de pigmentos especialmente los
carotenoides, específicamente astaxantina el cual es el pigmento responsable de la coloración
rojiza del alga (Córdoba et al., 2015). Se utilizó esta especie de alga para la extracción de este
carotenoide ya que se ha reportado en la literatura que H. pluvialis puede llegar acumular
hasta un 5,02% de astaxantina del peso por célula seca (Roldán, 2012).

El cultivo de H. pluvialis utilizado en el presente experimento fue donado por la empresa

“Andes Spirulina”. Este fue recuperado de un recipiente dispuesto para coger agua de la
lluvia donde había una gran acumulación del alga, ya que encontrar el alga roja depende de
las condiciones de estrés en las que se encuentre. Para verificar que el alga se encuentre en
estado de aplanóspora se visualizó una pequeña porción del cultivo en el microscopio. En la
figura 1 se puede observar una acumulación de puntos circulares rojos, es decir que la
mayoría de células se encuentran en estado aplanóspora. Una vez que se verificó el estadío de
H. pluvialis se procedió con el diseño experimental planteado. La microalga produce la
astaxantina de forma intracelular, es decir el pigmento no es excretado al medio, entonces, es
ahí donde comienza el reto. Uno de los pasos más importantes y complicados dentro del
procedimiento de extracción es el rompimiento de la pared celular del alga para la liberación
del carotenoide al solvente. En base a la literatura consultada, se decidió aplicar 3 métodos
para la extracción de astaxantina.
Para entrar en contexto y discutir el por qué de los resultados, explicaremos brevemente cada
uno de ellos. El primer método aplicado consistió en utilizar como solvente al metanol, ya
que la astaxantina es soluble en solventes apolares (Martínez, 2003), para el rompimiento de
la pared celular se utilizó sílica gel junto con varios tiempos en el vórtex. Los resultados que
se obtuvieron aplicando este método no fueron los esperados, ya que como se observa en la
figura 6 el espectro de emisión fue alrededor de 600-700 nm por lo que supera
completamente el rango del espectro de la astaxantina. En el segundo método donde
solamente se aplicó éter de petróleo y se dió la extracción utilizando un rotavapor tampoco
se pudo obtener buenos resultados. Se utilizó un rotavapor (Anexo 3) ya que este permite la
extracción de compuesto deseado, mediante la condensación de solvente, dejando el producto
sólido en las paredes de balón (Henriques, Silva, y Rocha, 2007). Sin embargo, se puede
observar en al figura 5 donde no se observó ninguna curva en el espectro de emisión en
ningún rango. En ambos métodos los resultados no fueron los esperados ya que no logró
romper la pared celular de las células. Como se observa en la figura 2, donde se encuentran
las células de H.pluvialis completamente intactas.
Después de la aplicación de dos métodos reportados en la literatura, y con el intento fallido
de extracción se procedió con la utilización de otro. Cabe recalcar que para este método se
utilizaron las mismas muestras de algas de los anteriores métodos. En el tercer método se
utilizó como solvente a la acetona (solvente no polar) y se aplicó a las muestras en dos
diferentes temperaturas. Se utilizó un solvente no polar ya que la mayoría de carotenoides son
solubles en solventes apolares como éter, benceno, cloroformo, acetona, etc. El método 3 se
divide en dos ya que en ambos cambian la manera de la ruptura celular. En el método 3.1 se
añadió acetona al cultivo y se colocaron las muestras a -80 C durante 12 horas. Mientras que
el método 3.2 se añadió acetona al cultivo, se realizó vortex/centrifugó y se colocaron las
muestras a -20C durante 12 horas. En ambos tratamiento se utilizó un shock térmico como
estrategia para romper la pared celular del alga, ya que se ha reportado en la literatura que las
bajas temperaturas permiten el rompimiento de las células (Leonardi, Niizawa y Irazoqui,
2015). Los resultados obtenidos mediante la aplicación del método 3 fueron parcialmente
buenos. Se puede observar en la figura 6 donde a una temperatura de -20 C durante 12 horas
no fue lo correcto ya que el espectro de emisión no se encuentran dentro del rango esperado.
Mientras que en la figura 7 se observa una pequeña curva en el rango de 400-500 por lo que
existe presencia de astaxantina; sin embargo esta no es pura debido a la presencia de otros
compuestos que generó otra pequeña curva en el lado izquierdo del espectro.
En base a todos los resultados obtenidos aplicando 3 métodos diferentes y en cuanto a la
bibliografía consultada se deben tomar en cuenta ciertos factores que afectan a la extracción
de astaxantina, y los cuales no fueron tomados durante la extracción. Los carotenoides al
contener una gran cantidad de enlaces dobles son muy sensibles a la luz, temperatura y aire
ya que pueden descomponerse fácilmente. La luz ocasiona reacciones fotoquímicas las cuales
modifican la estructura original de la astaxantina. Las altas temperatura acelera las reacciones
térmicas de degradación, disminuyendo así el compuesto de interés. Y el oxígeno favorece la
la oxigenación de los enlaces dobles transformándolos en hidroxilos, epóxidos, entre otros.
Por todas las razones mencionadas anteriormente, se debe extraer astaxantina en condiciones
completamente sin luz, a temperatura ambiente (25 - 28C) y en un ambiente en ausencia de
oxígeno (Lababpour et al., 2005). Así como también a penas el cultivo este en la fase de
aplanospora aplicar el procedimiento lo más rápido posible, es decir utilizar siempre un
material biológico fresco para evitar que compuestos externos degraden el compuesto de
interés (Martínez, 2003). También se debería deshidratar completamente al cultivo de algas
para extraer y retirar por completo toda el agua presente, esto se puede realizar mediante la
liofilización para que así no afecte el agua en la solubilización del compuesto (Córdoba,
2015).

11. Conclusión y Recomendaciones

En conclusión, los métodos aplicados para la extracción de astaxantina no fueron los
adecuados ya que el procedimiento del rompimiento celular no fue exitoso. Sin una buena
lisis celular, las algas no pueden liberar el compuesto presente en su interior dificultando el
proceso de extracción. La exposición de las muestras durante doce horas a bajas temperaturas
es uno de los puntos claves para el rompimiento de la pared celular. Es de suma importancia
purificar el cultivo de algas para evitar contaminantes externos, así como también el resto de
factores ambientales mencionados que podrían estar implicados en el procesos de extracción
de la astaxantina.

12. Anexos
Anexo 1.- Microalga Haematococcus pluvialis obsequiada por Andes Spirulina

Anexo 2.- Fases de crecimiento de las microalgas verdes productoras de astaxantina

A: célula vegetativa, B: palmella, C: aplanóspora (Hagen et.al., 2002)
Anexo 3.- Rotavapor usado en el método 2
 13. Bibliografía
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