DIAGNÓSTICO VIRAL

El diagnóstico virológico comprende la detección e identificación del agente etiológico de una

infección viral, clínica o inaparente, y /o de la respuesta inmune específica del huésped.

La primera etapa la constituye el diagnóstico viral clínico, que generalmente tiene un carácter de
orientación. Se basa principalmente en el cuadro clínico y considera los antecedentes personales y
familiares, además de la situación epidemiológica; a menudo se recurre además al laboratorio
clínico general. En muchas circunstancias este diagnóstico clínico puede ser suficiente, como en
sarampión, hepatitis, varicela, etc. Sin embargo, cada día se observa con mayor frecuencia la
asociación de virus con diversos cuadros clínicos, incluso muy severos, en los que el estudio
específico de laboratorio virológico se hace indispensable como medio diagnóstico, de control
evolutivo, con fines epidemiológicos, etc. Hoy día, el avance de las técnicas diagnósticas ha
demostrado que hasta los cuadros más típicamente asignados a una etiología pueden ser
causados por otros agentes: las enfermedades son realmente síndromes. Las aplicaciones del
diagnóstico virológico son variadas y dependen de los medios disponibles y de las circunstancias
que ameriten un diagnóstico etiológico específico. En salud pública se utiliza habitualmente en
programas de vigilancia epidemiológica (ej: poliomielitis, influenza, hantavirus, VIH, etc.) y en el
control de vacunas mediante censos serológicos, como polio, parotiditis y sarampión. En medicina
curativa la necesidad del diagnóstico virológico alcanza a todas las disciplinas: pediatría,
obstetricia, medicina, cirugía, dermatología, etc. El aumento de la población de
inmunocomprometidos ha creado nuevos problemas por la aparición de cuadros clínicos atípicos y
la emergencia de nuevas cepas microbianas. El gran desarrollo de las técnicas de diagnóstico
virológico ha permitido ofrecer actualmente una ayuda directa al médico clínico y ha facilitado la
investigación en salud, posibilitado su aplicación en muchos campos. Actualmente el médico
clínico puede tratar con nuevos antivirales y controlar el curso de muchas infecciones virales,
como SIDA, hepatitis B o C, etc. En el presente existe comercialmente una gran variedad de
técnicas que pueden implementarse en laboratorios clínicos, por lo que se requiere conocer sus
características para seleccionar las de mayor aplicabilidad. El diagnóstico definitivo requiere un
análisis de correlación entre los antecedentes clínicos personales, familiares, epidemiológicos y los
resultados del laboratorio virológico, considerando la oportunidad y calidad de la muestra, las
propiedades de las técnicas utilizadas y la experiencia acumulada al respecto. La conclusión final
depende entonces de un trabajo profesional multidisciplinario, más que de una cifra aportada por
una moderna máquina automatizada.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO

Los métodos de diagnóstico viral se basan fundamentalmente en: a) Detección del agente viral
completo o de sus componentes: por aislamiento viral con observación del efecto inducido por el
virus vivo propagado en un huésped biológico; por visualización de la partícula viral total o parcial;
por detección de sus componentes macromoleculares (antígenos virales o ácido nucleico viral). b)
Detección de la respuesta inmune del huésped mediante el estudio de anticuerpos antivirales
(serología).

TOMA DE MUESTRA
La recolección de la muestra debe considerar inicialmente dos factores: el sitio u órgano lesionado
y el virus presuntamente responsable. Las muestras más comúnmente usadas son las secreciones
respiratorias, deposiciones, sangre y líquido céfaloraquídeo

Para aislamiento viral se precisa mantener la partícula viral viva, por lo que la forma de obtención
y manejo de la muestra es fundamental; frecuentemente se utilizan medios de transporte
especiales y su traslado al laboratorio debe hacerse en frío (en hielo). Otras técnicas de
diagnóstico viral no necesitan el virus “vivo”, pues se basan en la detección del virión o de sus
componentes estructurales, cuya mayor estabilidad facilita la realización del estudio. La forma de
conservación de la muestra depende además de la estructura del virus y del uso posterior de la
misma. En general, los virus deben mantenerse en frío, a temperaturas entre +4 y ‐180º C; los
virus con envoltura son más lábiles (VRS, influenza, CMV, hepatitis B y C, etc.) y los procesos de
congelación y descongelación disminuyen su viabilidad. Por esta razón, en general dependiendo
del virus a estudiar, las muestras se pueden mantener unos pocos días a 4º C y luego, si no se
procesan, deben congelarse temperaturas entre –20º y –180º C. Los virus desnudos, como
enterovirus, rotavirus, adenovirus, etc. se mantienen viables por varios años congelados a –20º
C. El estudio sérico clásico requiere de dos muestras de sangre, una en la etapa aguda de la
infección y otra en la convalecencia, generalmente con 2 a 4 semanas de intervalo entre ellas, para
demostrar una seroconversión. Si se desea diagnosticar infección reciente (IgM) o antigua (IgG) se
puede determinar el nivel del tipo de anticuerpos correspondiente en sólo una muestra de sangre.

DETECCIÓN DEL AGENTE. Se puede realizar de distintas maneras: Aislamiento viral.

Los cultivos celulares constituyen, desde 1950, el sistema más empleado para el aislamiento y
propagación de la mayoría de los virus. Los cultivos de células in vitro consisten en un sistema
formado por células provenientes de un órgano o un tejido, normal o tumoral, mantenidas en
medios de cultivo de composición química definida y en condiciones de temperatura, pH,
atmósfera y humedad controladas. Los cultivos pueden clasificarse en tres tipos: 1. cultivo
primario

2. cepa celular 3. línea celular dependiendo del origen y tiempo de sobrevida de las células in
vitro. Los cultivos primarios se preparan a partir de tejidos normales, jóvenes, que tienen un
cariotipo normal y una capacidad de crecimiento in vitro limitada a 2 ó 3 subcultivos (Ej: pulmón
fetal humano, prepucio de recién nacido, amnios humano, etc.) y son más difíciles de obtener. En
el otro extremo, las líneas celulares provenientes de tejidos tumorales, con cariotipos
heteroploides, pueden subcultivarse en forma contínua y son fáciles de mantener in vitro (Ej: HEp‐
2, Hela, Vero, RK, etc.). Las cepas celulares tienen una constitución cromosómica normal y
permiten 20 a 50 subcultivos (MCR‐5).

etección de la partícula viral completa La aplicación de técnicas de microscopia electrónica ha

permitido observar la morfología de la mayoría de los virus que se conocen. En ciertos casos dicha
morfología es característica (adenovirus, rotavirus, coronavirus) y permite la identificación de la
partícula viral, aunque habitualmente la observación de su morfología sólo sugiere una familia o
grupo viral. El uso de microscopía con tinción negativa mejora la visualización de las partículas
virales presentes en una muestra.
Métodos de estudio de bacterias y virus Métodos diagnósticos

Por ejemplo, si el paciente tiene una neumonía es incorrecto realizar un exudado faríngeo para
aislar el germen causal, porque las muestras respiratorias altas no son representativas de
infecciones del aparato respiratorio inferior; los microorganismos que causan estas infecciones
son habitantes normales de la flora nasofaringea. En esta enfermedad, el microorganismo también
se puede aislar en la sangre del individuo, porque son enfermedades que pueden cursar con
bacteriemia; también en el líquido pleural si están presentes. Tampoco es correcto en enfermos
con otitis media, buscar el microorganismo causal en el exudado nasal por las mismas razones.
Pero en este caso (otitis media), el microorganismo se puede aislar en el líquido del oído medio
por punción de la membrana timpánica

Para los virus, las mejores muestras generalmente son las que se obtienen al inicio de la
enfermedad (dentro de las primeras 72 horas), cuando el virus se excreta a concentraciones
relativamente elevadas y todavía no se ha unido a anticuerpos. Después de transcurridos siete
días, habitualmente no vale la pena realizar cultivos virales cuando se trata de huéspedes
inmunocompetentes. No obstante, en inmunocomprometidos y en infecciones virales persistentes
o crónicas, el virus puede aislarse durante períodos prolongados. La muestra deberá tener un
volumen suficiente para su procesamiento, además de ser recogida en recipiente rotulado y limpio
por fuera. Es imperativo que la muestra se acompañe de datos clínicos. El envío debe realizarse
rápidamente preservando la muestra de temperaturas extremas y de la desecación. Para ello se
usan medios de transporte. Los hisopos son de diferentes materiales: algodón, alginato, etc.

Métodos

MÉTODOS DIRECTOS Son aquellos que detectan: al microorganismo por microscopia, al

microorganismo por cultivo, a los antígenos del microbio y los ácidos nucleicos (reacción en
cadena de la polimerasa). Para la detección de antígenos se usan técnicas inmunológicas como la
inmunofluorescencia (IF), el enzimoinmunoanálisis (EIA) y los test de aglutinación. MÉTODOS
INDIRECTOS Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) que desarrolla el
huésped. Se basan en la detección de anticuerpos específicos mediante técnicas inmunológicas
(EIA, IF, western blot, etc.).

La microscopia óptica es un método sencillo y rápido que muchas veces orienta al diagnóstico
etiológico. Nos informa la cantidad y morfología bacteriana, además de la presencia de
determinados tipos celulares presentes en el preparado que validan o no la muestra para el
análisis microbiológico; por ejemplo: las células epiteliales en muestra de secreciones
respiratorias. El examen microscópico puede realizarse en fresco u obteniendo un frotis fijado y
coloreado. El examen en fresco permite apreciar la existencia de bacterias y la presencia de
movilidad de las mismas y características de esta. Esto último muchas veces orienta a la
identificación de una cepa bacteriana o al diagnóstico etiológico.

La microscopia electrónica usa electrones en lugar de luz. Dicho método de estudio es útil por
ejemplo para el diagnóstico de virus causantes de gastroenteritis. Con el microscopio electrónico
se puede observar la morfología de los viriones presentes en las muestras clínicas. La limitación de
este método, además del costo del microscopio, es que necesita una concentración elevada de
viriones El microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos rápidos
de muestras de materia fecal de pacientes con diarrea. Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y
Calcivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de esta enfermedad.

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS VIABLES El cultivo es aún el gold standard y una

herramienta importante de diagnóstico. Permite además, identificar el microorganismo aislado,
realizar estudios de sensibilidad a los antibióticos y antivirales y tipificar el microorganismo con
fines epidemiológicos.

Los cultivos celulares se dividen en primarios, diploides y líneas celulares continuas. Los primeros
se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y pueden
subcultivarse una o dos veces. Las líneas celulares diploides, crecen en pasajes sucesivos hasta
aproximadamente 50 subcultivos y conservan, por lo menos en un 75%, el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen. Las líneas celulares continuas, permiten un
número finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer
una línea continua, esta debe haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Estas líneas celulares
continuas ofrecen las siguientes ventajas: disponibilidad para todos los investigadores de stocks de
células idénticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa en botella de cultivos, con la
posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento
en todos los laboratorios. Libre de contaminación con agentes extraños. Los distintos cultivos
celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relación
específica entre el huésped y el virus, que está en relación con los datos clínicos y el tipo de
muestra para inocular

MÉTODOS ALTERNATIVOS

Estos ensayos se basan en la detección de anticuerpos (Ac) específicos que permiten señalar a
determinado microorganismo presente en una infección. La otra posibilidad es la detección de
antígenos (Ag) solubles en los materiales a estudiar. Son todas reacciones de tipo antígeno
anticuerpo (Ag-Ac)

La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue una de las primeras técnicas en usarse. Ésta se basa en la
carga negativa que presentan los Ag bacterianos en medio alcalino, cuando son sometidos a una
corriente eléctrica; en cambio, los Ac permanecen neutros. Esta técnica es poco usada en la
actualidad porque es menos sensibles que otras que se desarrollaron posteriormente y de mayor
costo económico.

Técnicas muy usadas y de fácil realización son las que se basan en aglutinación de partí- culas, por
ejemplo la aglutinación de látex o la coaglutinación que usa S. aureus y su proteína A fijadora de
inmunoglobulinas. La prueba de aglutinación es un método sencillo, de un solo paso. Además es
una técnica rápida y barata. Los ensayos de aglutinación dependen de la fijación inicial de Ac o de
los Ag específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la
muestra clínica, en la que se investiga el Ag o los Ac y las partículas se aglutinan si el Ag o Ac
adecuado se encuentra presente. La prueba de aglutinación ha sido usada para detectar el Ag (el
más importante) de Rotavirus en heces, mostrando buena sensibilidad cuando se lo compara con
el EIA para Rotavirus. También se ha usado para detectar Ag de Adenovirus.

Las técnicas de análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) que usan Ac unidos a enzimas
que catalizan reacciones colorimétricas, son de uso corriente. Los ELISA para la detección de Ag se
basan en la “captura” del Ag por Ac específicos unidos a una fase sólida, generalmente el pocillo
de una microplaca o una esfera de plástico pequeña. El Ag viral presente en la muestra clínica se
combina con el Ac fijado a la fase sólida y el Ag viral se detecta mediante la adición de otro Ac
específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina.
En la reacción con peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico
incoloro, que en su forma oxidada tiene un color característico. Si la enzima es fosfatasa, la
desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color.

El radioinmunoensayo (RIA) fue originalmente aplicado para identificar el Ag de superficie de la

hepatitis B (HBsAg) y el Ac anti-HBsAg. Estos ensayos tienen buena sensibilidad y especificidad,
pero la aparición del EIA con mayor tiempo de conservación de los reactivos, costo más bajo y
ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las técnicas de RIA en la mayoría de las
situaciones en las que se requiere la detección de Ag viral. La técnica de western blot (WB) tiene
muchas aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son particularmente útiles para el diagnóstico
del virus de la inmunodeficiencia humana

Dicha técnica se basa en la separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente
inmovilizadas en papel de nitrocelulosa, con el objeto de determinar la presencia de Ac específicos
contra cada una de esas proteínas. Se realiza esquemáticamente en tres pasos. En el primero se
realizan cultivos celulares de grandes cantidades de virus que luego son tratados químicamente
para su disgregación e inactivación. Los Ag resultantes del lisado viral se separan por electroforesis
en gel de poliacrilamida. A continuación se realiza una transferencia (blotting o
electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. Por último se coloca el
suero del paciente en la membrana de nitrocelulosa y se agregan Ac anti-inmunoglobulina humana
unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina); finalmente se agrega el substrato enzimático
para la visualización de las bandas reactivas con un producto final coloreado.