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FIGMMG
E.P. INGENIERIA AMBIENTAL
LABORATORIO N° 2 - BIOQUIMICA
INTEGRANTES:
DOCENTE:
LIMA – 2018
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
OBJETIVOS
Determinar de manera experimental la velocidad máxima (Vmax) y Km por medio de la gráfica
de Lineweaver – Burk.
Reconocer la acción de una enzima y algunos factores que afectan la actividad enzimática.
PROCEDIMIENTO
EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO
Preparamos 7 tubos con agua destilada, HCl y Albumina y un tubo (8) con Pepsina.
Sustrato: Albumina
Enzima: pepsina
TUBOS N° 1 2 3 4 5 6 7 8
Agua 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5
destilada (ml)
HCl (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Albumina (ml) 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
Pepsina (ml) 8.0
Concentración 10 20 30 40 50 60 70
del sustrato []
Lectura inicial 0.025 0.027 0.032 0.096 0.114 0.142 0.169
de la DO
Lectura final 0 0.015 0.005 0.013 0.003 0.003 0
de la DO
𝑪𝟏 ∗ 𝑽𝟏 = 𝑪𝟐 ∗ 𝑽𝟐
Teniendo los datos de la densidad óptica a 450 nm inicial y final, hallaremos la velocidad:
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METODO DE MINIMOS CUADRADOS
El método es aplicable solo para ajustes lineales con los datos xi (concentración) y yi (velocidad)
𝑛𝛴𝑥𝑖𝑦𝑖 − (𝛴𝑥𝑖)(𝛴𝑦𝑖)
𝑚=
𝑛𝛴𝑥2 − (𝛴𝑥𝑖)2
(𝛴𝑦𝑖)(𝛴𝑥𝑖2) − (𝛴𝑥𝑖)(𝛴𝑥𝑖𝑦𝑖)
𝑏=
𝑛𝛴𝑥2 − (𝛴𝑥𝑖)2
Datos obtenidos de las inversas de la concentración y velocidad
1 1 1 1 1
𝑋𝑖 = 𝑌𝑖 = 𝑋𝑖. 𝑌𝑖 = . 𝑋𝑖2 = ( ) 2
[] 𝑉 [] 𝑉 𝑋𝑖
0.1 40 4 0.01
0.05 83.333 4.167 0.0025
0.0333 37.037 1.233 0.0011
0.025 12.048 0.3012 0.0006
0.02 9.009 0.180 0.04
0.167 7.194 0.120 0.0278
0.0142 5.917 0.084 0.0001
𝜮 = 𝟎. 𝟐𝟓𝟗 𝜮 = 𝟏𝟗𝟒. 𝟓𝟑𝟖 𝜮 = 𝟏𝟎. 𝟎𝟖𝟓 𝜮 = 𝟎. 𝟎𝟏𝟒𝟗
𝑌 = 𝑚𝑋 + 𝑏
(7)(10.085) − (0.259)(194.538)
𝑚= = 501.4874
(7)(0.01491) − (0.259)2
(194.538)(0.01491) − (0.259)(10.085)
𝑏= = 9.2493
(7)(0.01491) − (0.259)2
𝑌 = 501.4874𝑋 + 9.2493
Según Murray, Bender, Botham, Kennelly, Rodwell & Weil: “[…]Cualquier cosa que aumente la
frecuencia o energía de colisión entre sustratos aumentará el índice de la reacción en la cual
participen.” (Murray et al.,2010, p.64)
Stryer, Berg & Tymoczko mencionan: “La constante de Michaelis (Km) es la concentración de
sustrato cuando la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, es decir,
Vmax/2” (Stryer et al.,2015, p.231)
Esto se puede verificar en la gráfica. Aunque ellos no se miden con precisión, por ello
pasaremos a la gráfica 2.
-Gráfica 2: Se obtuvo con las inversas de la gráfica 1, es decir la inversa de la concentración del
sustrato en el eje X y la inversa de la velocidad de reacción en el eje Y.
Stryer et al. indican: “Una representación doble recíproca de la cinética de una enzima se
genera representando 1/Vo en función de 1/[S]. La pendiente es Km/Vmax la intersección con
el eje vertical es 1/Vmax y la intersección con el eje horizontal es -1/Km.” (Stryer et al.,2015,
p.235)
CONCLUSIONES
En este laboratorio se pudo aprender que la actividad de la enzima (pepsina) actúa sobre el
sustrato (albumina) de manera secuencial ya que para que pueda actuar esta enzima requiere
trabajar en un pH ácido por eso se usa HCl y a una cierta temperatura en esta caso fue a 37°C.
Y para poder medir esta reacción se tuvo que detener mediante un baño de hielo.
La actividad enzimática o velocidad se determinó mediante la diferencia de las lecturas de
densidades ópticas (DO) estas con ayuda del espectrofotómetro. Estas velocidades varían de
acuerdo con como se desarrolló en el laboratorio.
Para tener una mayor exactitud utilizamos el método de mínimos cuadrados para tener una
recta más exacta en la gráfica de Lineweaver-Burk. En esta grafica hallamos el Km ya que en
esta grafica es más factible hallarla a diferencia de la gráfica de Michaelis-Menten (la gráfica
se asemeja a la logarítmica la cual dificulta hallar el Km).
REFORZAR
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Ecuación de Michaelis-Menten: La ecuación de Michaelis-Menten es capaz de describir el
cambio sufrido por la velocidad de una reacción catalizada por una enzima al variar la
concentración del sustrato.
Ecuación de Lineweaver-Burk: El Km y Vmax está menos afectado por el margen de error ya
que se asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier concentraciones sustrato o
velocidad de reacción.
Km: Es la concentración de sustrato en Vmax la cual no se puede medir exactamente, las
enzimas se caracterizan por la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es
la mitad de su máximo. Esta concentración de sustrato se llama constante de Michaelis-
Menten (KM). Muchas enzimas obedecen a la cinética de Michaelis-Menten.
Velocidad máxima (Vmax): La velocidad máxima (Vmax) de la enzima, en este estado todos
los sitios activos de la enzima están saturados con sustrato. Esto fue propuesto en 1913 por
Leonor Michaelis y Maud Menten. Dado que la concentración de sustrato en Vmax no se
puede medir exactamente, las enzimas se caracterizan por la concentración de sustrato a la
que la velocidad de reacción es la mitad de su máximo.
Isoenzima: son proteínas con diferente estructura pero que catalizan la misma reacción. Con
frecuencia, las isoenzimas son oligómeros de diferentes cadenas peptídicas, y usualmente
difieren en los mecanismos de regulación y en las características cinéticas. Desde el punto de
vista fisiológico, la existencia de isoenzimas permite que haya enzimas similares con diferentes
características, personalizadas de acuerdo a los requerimientos especificos del tejido o a
determinadas condiciones metabólicas.
2.- Las características químicas de la albumina y de la pepsina. Busque otros sustratos y sus respectivas
enzimas.
Albumina (sustrato) Grupo de proteínas, polímero de galactosa, Teb. 412 °C, Tf. 167 °C,
Densidad 1.8gr/cm3, solubilidad en agua 25g/l a 20°C.
Pepsina (enzima) es una enzima que se secreta en el estómago, hidroliza las proteínas. Actúa
principal, entre sobre los enlaces peptídicos de naturaleza hidrófoba.
Ejemplos: Grasas(sustrato) y Bilis(enzima); ARN(sustrato) y ribonucleasa; Triglicéridos y lipasa.
BIBLIOGRAFÍA:
-Lubert Stryer, Jeremy M. Berg & Jhon L.Tymoczko (2015) BIOQUÍMICA con aplicaciones
químicas. Barcelona: Reverté
- Robert K. Murray, David A. Bender, Kathleen M. Botham, Peter J. Kennelly, Victor W. Rodwell
& P Anthony Weil (2010) HARPER Bioquímica Ilustrada. Mexico D.F.: Mc Graw Hill
-Jose Lopez, Francisco Garcia (2015) Los cuatro mosqueteros de la cinética enzimática, Revista
Eubacteria. Cien años de avance en la ciencia de la vida. N°34.
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