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AULA PRÁTICA - ESPECIALIZAÇÃO EM MICROBIOLOGIA CLÍNICA

IDENTIFICACAO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS

Introdução

As bactérias da família Enterobacteriaceae são capazes de se propagar no ambiente

desde que sob condições apropriadas, sendo muitas delas consideradas habitantes da flora
autóctone intestinal de mamíferos, incluindo o homem, e de algumas espécies de aves (Gerlach,
1994).
As enterobactérias são bacilos Gram-negativos, não esporulados, com motilidade
variável, oxidase negativa, e crescem em meios básicos, meios ricos e meios seletivos. São
anaeróbios facultativos, fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase
positivos, e reduzem nitrato a nitrito (ANVISA, 2004)
São encontradas no solo, nas plantas, na água, no trato gastrointestinal de humanos e
dos animais. Alguns são de exclusividade humana como é o caso da Salmonella typhi, e outras
encontradas em todos os lugares como é a K. pneumoniae (ANVISA, 2004)
Algumas também são consideradas enteropatogênicas por causarem infecções
gastrintestinais, como a Salmonella typhi, outras Salmonellas, Shigella spp, Yersinia
enterocollica e vários sorotipos e E. coli. (ANVISA, 2004)
As enterobactérias representam 80% ou mais de todas das gram-negativas de
importância médica. São responsáveis por mais da metade das causas de infecção urinárias e
50% das septicemias. (ANVISA, 2004)
As provas identificação das enterobactérias consiste em sistemas simplificados de provas
bioquímicas. Uma dessas provas é o Rugai modificado que consiste e nove provas em apenas
um tubo de ensaio, que são: indol (tampa), fermentação da sacarose e glicose e produção de
gás triptofanase, ureia, H2S, lisina e motilidade (ANVISA, 2004)
O meio Rugai tem a vantagem de ser prático para inoculação e de baixo custo. Sua
desvantagem é a dificuldade de interpretação de tantas provas, exigindo muita experiência com
o meio. Rugai identificou os principais gêneros de enterobactérias, indicando a presença de
bactérias não fermentadoras e Vibrio. (ANVISA, 2004)
Algumas espécies de Enterobacter, gênero Serratia, gênero e espécie de Pseudomonas
precisam-se de provas complementares para correta identificação. (ANVISA, 2004)

Material necessário
● Bateria de Rugai com lisina
● 5 placas de agar MacConkey\ SS contendo as bactérias A, B, C, D e E
● Alça de plantinha em fio
● Prova da Oxidase
●

Execução

Com o auxílio de um fio de platina, coletar a amostra da colônia a ser pesquisada e inocular
através de picada até o fundo do tubo, realizando estrias na superfície do meio de Rugai.
Incubar em estufa a 36°C por 24 horasIsolamento de estreptococos:
Com uma alça retirar uma amostra e inocular na fita do teste de oxidase.
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Os resultados do teste serão obtidos baseando-se na tabela de

interpretação da figura 1.
Figura 1: Testes para interpretação das provas pelo Rugai
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Leitura dos resultados

O endereço eletrônico abaixo pode ser consultado também para identificar alguns
micro-organismos com o resultado das Provas do Rugai

Com base nos resultados das provas bioquímica apresentadas nos resultados indique
a possível espécie ou gênero de bactéria das placas utilizadas na aula prática.

Prática 2- Utilização do BACTRAY 1,2 . para identificar bactéria Gram-negativas,

oxidase negativa.

Material necessário
● Bateria de Rugai com lisina
● 5 placas de agar MacConkey\SS contendo as bactérias A, B, C, D e E
● Alça de plantinha em fio
● Prova da Oxidase
●

Execução

1. Suspender em água destilada ou deionizada estéril (pH 6,8 a 7,2) a bactéria a ser identificada,
de maneira a se obter uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala Mac Farland. Obs.:
Inóculos com concentrações superiores podem induzir resultados insatisfatórios, assim como o
uso de solução salina.

Preferencialmente, utilize o crescimento de cultura recente (18-24 horas de incubação).

2. A suspensão acima deve ser bem homogênea, sendo aconselhável o uso de um agitador
mecânico.
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3. Inocule 1,0 ml da suspensão bacteriana a cada conjunto (Bactray I e II), após remover a
tampa;

4. Inclinando para trás conjunto, num ângulo de aproximadamente 45°, incline para a esquerda,
após para a direita, repetindo esta operação duas vezes, sempre mantendo o mesmo ângulo de
inclinação. Apoie o tray na mesa de trabalho e incline-o para frente de maneira obter uma
perfeita distribuição do inoculo em todos os substratos;

5.Mantendo-o nesta posição, adicionar 3 gotas de óleo mineral estéril (ou mais
se necessário) às provas bioquímicas sublinhadas (ADH, LDC, ODC, H S, URE)

Obs.: É imprescindível que estes substratos estejam completamente vedados.

6. Recoloque a tampa (de maneira a se obter uma perfeita vedação) e incube o tempo
desejado(neste caso, incubação normal de 18 a 24 horas). Recomenda-se incubar em câmara
úmida para evitar ressecamento.

7. Após a incubação adicione 2 a 3 gotas dos reagentes necessários:

Alfa Naftol e KOH no VP. Observar após 15 a 20 minutos de reação.
Cloreto Férrico no PD. Aguardar 2 a 3 minutos para leitura da reação.
Reativo de Kovac's no IND. Observar a formação de anel dentro de 2 minutos.

Link vídeo
https://www.youtube.com/watch?v=wXo1jisdEOk

RESULTADOS e DISCUSSAO

Anote os resultados para a identificação das espécies ou gêneros das bactérias

A, B, C, D e E, e discorra sobre os testes utilizados no teste de RUGAI e no
BACTRAY