UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA DE BIOANÁLISIS – SEDE CARABOBO
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
ASIGNATURA: ANÁLISIS INSTRUMENTAL

PRÁCTICA N° 7

TURBIDIMETRIA
RECUENTO DE MICROORGANISMOS EMPLEANDO LA ESCALA DE
MCFARLAND

INTRODUCCION
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en
suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es dispersada, parte es absorbida y
parte es transmitida. La nefelometría mide la luz dispersada por una solución de
partículas. La turbidimetría mide la luz no dispersada, es decir, la luz transmitida
a través de la solución.

Los cultivos bacterianos actúan como suspensiones coloidales absorbiendo

y reflejando la luz que incide sobre ellos, por ello, una suspensión bacteriana
aparece turbia a simple vista. Dentro de un rango, la luz dispersada por una
suspensión bacteriana es directamente proporcional a la concentración de células
en el cultivo. Por ello, un procedimiento rápido, fácil y preciso para estimar el
número de bacterias en un cultivo, es la medida de la turbidez. El
espectrofotómetro es el instrumento que se utiliza para medir la turbidez. Este
proporciona luz lo más monocromática posible por medio de un monocromador
que permite sólo el paso de la longitud de onda elegida (normalmente las
longitudes de onda usadas para medir la turbidez bacteriana están en el rango de
540 – 660 nm).

La pérdida de la potencia de la radiación incidente por una suspensión

bacteriana es medida por un detector y se expresa como absorbancia o densidad
óptica. La turbidimetría cuantifica la luz residual transmitida.

Técnicas de Recuento de Microorganismos.

Existen diferentes técnicas para determinar el número de microorganismos
o el peso seco (biomasa) de las células microbianas presentes en un cultivo. Los
métodos en general se agrupan en directos o indirectos. Entre los métodos
indirectos para llevar a cabo el recuento microbiano, se encuentra como ya se
mencionó, el método óptico de turbidimetría, el cual se fundamenta en la medición
de la cantidad de luz no dispersada o transmitida a través de un cultivo microbiano
(Efecto Tyndall). La dispersión es proporcional a la masa del cultivo y solo es
válido para concentraciones superiores a 107 células/mL, donde la
proporcionalidad de la absorbancia y la masa bacteriana se conservan.
 Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas
de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen
casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto quiere
decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al
peso seco, independientemente del tamaño celular del microorganismo.

Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o

por Unidad Formadora de Colonia (UFC) cuando los tamaños de las células
bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de
microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una
suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo de
microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad
Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.

Gráfico 7.1. Absorbancia en función del Peso Seco

De la gráfica se puede deducir que:

Absorbancia = K x Peso Seco

donde,

K: constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del
peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor
de la absorbancia (1/W 0).
Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso
seco (µg/ml-mg/ml).

Hay que tener en cuenta que existe un límite de detección en cultivos con
concentraciones inferiores a 106 UFC/ml, que no presentan turbidez detectable. La
relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para
suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una
absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley
de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede
involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de
absorción.

Gráfico 7.2. Absorbancia en función del Peso Seco

Gráfico 7.3. Absorbancia en función del Número de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos

microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia,
mientras que para el mismo número de microorganismos totales la absorbancia de
cada suspensión es distinta.

Si se mide la absorbancia de un cultivo a distintos intervalos de tiempo, la

curva relaciona los parámetros que representa una curva de crecimiento de
población bacteriana con sus distintas fases. La primera fase se denomina fase de
latencia, en la que la bacteria se adapta a las condiciones de cultivo y el número
de células no aumenta. Tras este período las bacterias comienzan una fase de
crecimiento exponencial en la que la velocidad de crecimiento es máxima y el
tiempo de duplicación constante. Esta fase de crecimiento disminuye por algún
factor limitante, entonces, la velocidad de crecimiento disminuye y la población
comienza un período de equilibrio que se denomina fase estacionaria. Por último,
si se mantiene el cultivo durante más tiempo en esta situación comenzará un
proceso de muerte en el que número de células viables disminuye que es la fase
de muerte.

Una aplicación directa de la turbidimetría es la realización de una curva de

calibración en la que se relaciona la medida de absorbancia con el número de
células viables del cultivo. Simultáneamente a las medidas de absorbancia se
realizan recuentos en placa. De esta forma, a partir de la absorbancia de un cultivo
podemos extrapolar de la curva patrón el número de bacterias viables.

ESCALA DE McFARLAND

Como se ha comentado anteriormente, una aplicación directa de la

turbidimetría y del recuento de microorganismos por diluciones seriadas es la
realización de una curva patrón en la que se relaciona la medida de la absorbancia
con el número de células viables del cultivo. Sin embargo, una mayor
simplificación la ofrece la estandarización de McFarland, útil en análisis
microbiológicos sencillos.

La escala de McFarland se basa en la capacidad de precipitación del

Cloruro de Bario en presencia de Ácido Sulfúrico, y su utilidad es la de poder
elaborar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón y valorando su
concentración; para esto se toma una alícuota de la muestra de bacterias y se
inocula en un tubo que contenga solución salina fisiológica (0,85%). El objetivo es
lograr ajustar una concentración de bacterias a uno de los patrones preparados,
relacionando la turbidez de dichos patrones de sulfato bárico (mezcla de cloruro
bárico al 1% y ácido sulfúrico al 1%) con el número de bacterias presentes en una
muestra. Así, por ejemplo, como se muestra en la tabla 7.1 si la muestra presenta
la misma turbidez que el patrón 1 de la escala McFarland, la carga será
aproximadamente de 3x108* UFC/ml.

Los patrones de McFarland, permiten establecer una relación entre una

precipitación química y una suspensión de bacterias. Se elaboran 10 estándares o
patrones (Tabla 7.1) y por espectrofotometría se elabora una curva de calibración
con la cual se va a poder determinar la concentración de las diluciones
bacterianas elaboradas. La información arrojada es aproximada, ya que la lectura
depende de factores como el tamaño de la bacteria y la forma de las agrupaciones
bacterianas.
 Tabla 7.1 Escala de McFarland, forma de preparación de cada patrón y su
correspondencia en turbidez a una población de bacterias expresada en
UFC/mL

BaCl2 al 1% H2SO4 al 1%
Escala McFarland UFC/ml (x108)
(ml) (ml)
1 0,1 9,9 3
2 0.2 9,8 6
3 0,3 9,7 9
4 0,4 9,6 12
5 0,5 9,5 15
6 0,6 9,4 18
7 0,7 9,3 21
8 0,8 9,2 24
9 0,9 9,1 27
10 1,0 9,0 30

OBJETIVO GENERAL
Determinar la concentración de una población de bacterias de una muestra
problema, suministrada en el laboratorio, por el método turbidimétrico, empleando
una curva de calibración construida a partir de patrones McFarland.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Aplicar una de las metodologías empleadas en microbiología para la
cuantificación indirecta de microorganismos (Turbidimetría).
- Preparar los patrones de McFarland según el procedimiento indicado para
elaborar la curva de calibrado.
- Elaborar la curva de calibrado de dichos patrones, obteniendo la representación
gráfica de las absorbancias o densidades ópticas en función de las
concentraciones de cada patrón preparado en el laboratorio, las cuales son
equivalentes a la concentración bacteriana (UFC/ml).
- Determinar la concentración bacteriana de una muestra problema aplicando las
técnicas de dosificación utilizadas en el laboratorio clínico, empleando el
método gráfico (curva de calibrado).

INSTRUMENTOS
- Espectrofotómetros.
- Fotocolorímetros
CRISTALERÍA
- Pipetas volumétricas y serológicas
- Vasos de precipitado.
- Tubos de ensayo

REACTIVOS
- Cloruro de Bario al 1%
- Ácido Sulfúrico al 1%
- Agua destilada.

PROCEDIMIENTO

Ajuste de concentraciones bacterianas mediante patrones de McFarland

1. Prepare cada patrón McFarland según el esquema indicado en la Tabla 7.1

2. Determine la turbiedad (Densidad Óptica) de cada patrón McFarland
mediante el uso de un espectrofotómetro a 540 nm. Tenga en cuenta
realizar el ajuste del equipo con agua destilada.
3. Determine la Densidad Óptica de una muestra problema (que será
suministrada en el laboratorio).
4. Grafique las lecturas obtenidas de la siguiente forma: En el eje Y
(ordenada) los valores de Densidad Óptica registrados, y en el eje X
(abscisa) el número aproximado de bacterias representado para cada
patrón McFarland (Tabla 7.1).
5. Concluida la calibración con los diferentes patrones, proceda a calcular la
concentración de bacterias de la muestra problema en UFC/mL (la cual
será suministrada en el laboratorio).

BIBLIOGRAFÍA

Manual de Microbiología: Conceptos y práctica de Microbiología General. Alberto

Rojas-Triviño. Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira. 2011, p. 42.

Manual práctico de Microbiología, Carlos Gamazo y Eduardo López, España,

2005, p. 39
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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS
ASIGNATURA: ANÁLISIS INSTRUMENTAL

INFORME DE LA PRÁCTICA N° 7

TURBIDIMETRIA
RECUENTO DE MICROORGANISMOS EMPLEANDO
LA ESCALA DE MCFARLAND

CÁLCULOS Y RESULTADOS

Resultados obtenidos en la actividad practica:

Estudiante: _______________________________________________
Fecha: ____________________
Instrumento: _______________________________________________
Observaciones: _____________________________________________________
__________________________________________________________________

Patrón McFarland UFC/ml (x108) Lectura Obtenida Absorbancia

1 3
2 6
3 9
4 12
5 15
6 18
7 21
8 24
9 27
10 30
Muestra Problema X

Concentración de
la Muestra
Problema/UFC.mL-1
ANALISIS DE LOS RESULTADOS: