UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

LICENCIATURA EN FARMACIA
ASIGNATURA: GENÉTICA
GRUPO: 1001
SEMESTRE: 2018- I

REPORTE No. 2
“Aislamiento y purificación de DNA por la técnica de perclorato de sodio y
electroforesis de DNA”

ASESORES:
BQD. LARISA ANDRE GONZÁLEZ SALCEDO

EQUIPO 1:
Aguirre Vidal Pablo
Corpus Casias Gustavo
García Ramírez Francisco Javier
Salmerón Rodríguez Ángel Abdiel

FECHA DE ENTREGA DEL REPORTE:

03 octubre 2017
Abstract
The DNA molecule is the carrier of genetic information, is the key of hereditary traits that are
passed from the mother cell to daughter cells. Each individual has their own genetic
information. In the experimental session we extract DNA from peripheral blood. For said
extraction, we used the technical of perchlorate of sodium with the intention to meet and
visualize the fibrilar estructure of DNA and its degree of packing in the cell nucleus. Once
extracted DNA we proceeded to perform a horizontal electrophoresis for DNA using agarose
gels which allowed separate, identify and purify DNA fragments.

Keys words: DNA extraction, sodium perchlorate, electrophoresis DNA, agarose gels

Resumen
El DNA es la molécula portadora de la información genética, donde se encuentra la clave
de los caracteres hereditarios que se traspasan de la célula madre a las células hijas. Cada
individuo tiene su propia información genética. En la sesión experimental se realizó una
extracción de DNA a partir de sangre periférica. Para dicha extracción se utilizó la técnica
de perclorato de sodio, esto con la intención de conocer y visualizar la estructura fibrilar del
DNA, así como su grado de empaquetamiento en el núcleo celular. Una vez extraído el
DNA se procedió a realizar una electroforesis horizontal para DNA utilizando para ello geles
de agarosa lo cual permitió separar, identificar y purificar fragmentos de DNA.
Palabras clave: Extracción de DNA, perclorato de sodio, electroforesis de DNA, geles
agarosa.

Objetivos mediante marcadores moleculares,

segmentos de DNA con o sin función
1. Llevar a cabo la extracción de
conocida que proporcionan información
DNA a partir de una muestra de
sobre la variación alélica y permiten
sangre, mediante la técnica de
distinguir individuos. La aplicación de
perclorato de sodio, para revelar
técnicas moleculares inicia con la
su estructura.
extracción de DNA y la obtención exitosa
2. Realizar una electroforesis
de datos confiables y reproducibles
horizontal, mediante los
depende, en gran medida, de la
conocimientos básicos, para
extracción de DNA íntegro y puro.
conocer la concentración de DNA
en una muestra sanguínea. El DNA está constituido por dos cadenas
de nucleótidos unidas entre sí formando
una doble hélice. Los nucleótidos están
Introducción
integrados por un azúcar (desoxirribosa),
En la actualidad, el estudio de la variación un grupo fosfato y una base nitrogenada
genética entre individuos, poblaciones y (adenina, guanina, timina o citosina). La
especies para explicar patrones y unión de los nucleótidos ocurre entre el
procesos ecológico-evolutivos se aborda grupo fosfato y el azúcar, mediante
enlaces fosfodiéster, dando lugar al
esqueleto de la molécula. Las bases de La electroforesis es una de las técnicas
cadenas opuestas se unen mediante más empleada en bioquímica y biología
puentes de hidrógeno y mantienen molecular, usada para separar y a veces
estable la estructura helicoidal. purificar macromoléculas, especialmente
proteínas y ácidos nucleicos, Cuando las
La importancia de la obtención y
moléculas cargadas son sometidas a un
purificación de material genético es
campo eléctrico, migran hacia el polo
recobrar el producto máximo de DNA de
positivo (ánodo) como es el caso de los
alto peso molecular lleno de libre de
ácidos nucleicos.
proteínas, fenol, e inhibidores de las
enzimas de restricción de la Taq
polimerasa.

Resultados
Imagen 1. Resultados de electroforesis

M 1 2 3 5 4

5 4 3 2 1 M
En esta imagen se puede observar la migración de DNA a través de un Gel de
agarosa.
Imagen 2. Simulación de un Resultado correcto de electroforesis

Tabla 1. Resultados grupales de electroforesis

 Equipo Concentración (ng/μL)
1 112.18
2 147.3814
3 26.653
4 133.442
5 18.1
En esta tabla se muestran los resultados obtenidos de electroforesis por cada equipo,
teniendo así la concentración de DNA por cada muestra con una proporción 260/280.
Discusión
Inicialmente se realizó la extracción del
DNA de una muestra sanguínea. La cual
consiste en el aislamiento y purificación
de moléculas de DNA y se basa en las
características fisicoquímicas de la
molécula. Una de ellas es que los grupos
fosfato están cargados negativamente y
son polares, lo que le confiere al ADN una
carga neta negativa y lo hace altamente
polar, características que son
aprovechadas para su extracción.
En la sección practica se realizó la
obtención de una capa de leucocitos para
la obtención de DNA, resultado de
centrifugar la muestra, a la que
posteriormente se le agrego el buffer de
lisis 1 que participa en la lisis de los
eritrocitos presentes en la muestra.
Durante el proceso de lisis las
interacciones entre las moléculas que
conforman la pared, la membrana celular
y nuclear se modifican o destruyen
permitiendo que los ácidos nucleicos se
liberen (Alejos. L, Aragón .M y Cornejo. A).
La adición del buffer, así como la
centrifugación se llevaron a cabo hasta
obtener una pastilla blanquecina y un
sobrenadante transparente que nos
indicaban que solo se tenía la presencia
de leucocitos en la muestra.
Por consiguiente, se agregó el buffer de
lisis 2, para llevar a cabo la lisis de
leucocitos y obtener el DNA contenido en
ellos. Esta clase de buffer contiene EDTA,
que forma un complejo con los iones de
260/280
1.867
1.902
1.596
1.896
1.5008
Mg2+ e impide el funcionamiento de las
DNAsas (Enzima que cataliza la rotura de
los enlaces fosfodiéster en el DNA).
También para la extracción de DNA se
emplea el uso de SDS que es un
detergente que despolariza las proteínas,
además de perclorato de sodio que
precipita las proteínas asociadas al DNA.
Los grupos fosfato tienen una fuerte
tendencia a repelerse, debido a su carga
negativa, lo que permite disolver al DNA
en soluciones acuosas y formar una capa
hidratante alrededor de la molécula. Pero,
en presencia de etanol, se rompe la capa
hidratante y quedan expuestos los grupos
fosfato. Bajo estas condiciones se
favorece la unión con cationes como Na+
que reducen las fuerzas repulsivas entre
las cadenas de nucleótidos y permiten
que el ADN precipite (Rada .t, Taboada.
G. 1998).
Una vez que se ha eliminado el etanol, el
paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de
emplear agua estéril, el pH debe ser de 7
para permitir la redisolución completa del
ADN y evitar una hidrólisis ácida.
En la segunda parte de la práctica
experimental se realizo la electroforesis
de las muestras de DNA. El principio de la
electroforesis consiste en la migración
proporcional de las moléculas a través de
un gel u otro tipo de matriz porosa, según
su peso molecular o tamaño; movimiento
generado por un campo eléctrico
(Armendáriz, J.Sandoval, A. 2003).
Para realizar una electroforesis se
requiere de una cámara de electroforesis
que es un dispositivo que permite la
generación de un campo eléctrico
alrededor de un gel en donde se
depositan las muestras, el gel sirve como
medio de soporte con la finalidad de evitar
perturbaciones mecánicas durante la
separación. Los geles pueden ser de
agarosa empleados para la separación de
ácidos nucleicos, (gel empleado en la
práctica), o poliacrilamida (separación de
proteínas y ácidos nucleicos).
Para la realización de la electroforesis se
empleó TAE como buffer. El TAE
constituye la mejor alternativa (en
comparación al TBE) para el análisis
electroforético de fragmentos grandes (>
20 kb) de DNA. Una de las desventajas
del TAE como buffer de electroforesis es
que no permite reciclarlo por más de tres
corridas electroforéticas seguidas, a
diferencia del TBE cuya efectividad
permanece inalterada durante 3 o 4 días,
sin importar el número de corridas
electroforéticas realizadas.
Se utilizó azul de bromofenol (u otro
colorante como el xileno-cianol) se usó
como marcador del frente de avance de la
electroforesis. Asimismo, su color es una
ayuda visual durante la carga de muestra
en los pocillos.
En la electroforesis, por su menor tamaño,
se mueve más rápido que las proteínas o
que la mayoría de moléculas de DNA
(siempre que éstas sean superiores a 300
pb), es decir, marca el "frente de avance".
Puesto que su color azul-violeta es bien
visible, permite detener la electroforesis
con la confianza de que las moléculas de
proteína o DNA no se hayan salido del gel.
Tras la electroforesis, se visualizó el gel
con una lámpara de luz UV, y se
observaron diferentes bandas
correspondientes a las muestras de DNA
aplicado y los marcadores de peso
molecular.
En la imagen 1 se pueden ver las bandas
de las muestras de DNA de los 5 equipos,
de los cuales se puede ver que ninguno
puedo tener una banda bien identificada
como esta en la imagen 2, ya que en esta
nos muestra las distintas bandas y bien
identificadas (por asi decirlo un resultado
correcto de una electroforesis), lo que se
puede decir de la imagen 1 de resultados
experimentales, es que el marcador no
pudo dar una banda correspondiente esto
se puede deber a que este tipo de
marcador pueda estar en malas
condiciones o que ya esté en mal uso para
su funcionamiento. Ahora las muestras de
los equipos se puede observar gran
cantidad de proteínas en la parte superior
de todos las muestras, por lo que esta
interfirió para que la muestra de DNA se
mostrada en la banda, las muestras de los
equipos 2, 3 y 4 bajaron partes pequeñas
de muestra, esto no quiere decir que sea
DNA, estos son fragmentos de RNA que
pudieron colocarse en esa parte de las
bandas anterior mente señaladas.
Es importante señalar que las diferentes
formas de ADN se mueven a través del
gel a diferentes velocidades, el DNA
plásmido superenrollado, debido a su
conformación compacta, se mueve a
través de la más rápida en gel, seguido
por un fragmento de ADN lineal del mismo
tamaño, con la forma circular abierta
viajar el más lento.
Al aplicar un marcador de peso molecular
(fragmentos de DNA de tamaño conocido)
puede ser calculado el tamaño
aproximado del DNA en estudio. Se
puede observar en la imagen 1 de las
muestras de DNA que ninguna de estas
corrio en primera posicion al lado del
marcador de peso molecular, por lo cual
no pudo determinarse el tamaño
aproximado del DNA

Como parte final de esta práctica se
realizó una cuantificación del DNA
presente en nuestras muestras
purificadas utilizando un
espectrofotómetro EPOCH UV/Vis, el cual
nos permitió en base a la
espectrofotometría conocer la cantidad de
DNA presente), se calculó la
concentración de 112.18 ng/µL y ya
haciendo los cálculos correspondientes
nos dio un resultado de 5.609 x 10^-03 mg
y esto nos demuestra la presencia de
DNA y que la cantidad de DNA obtenida
pudo variar por el volumen de sangre
utilizado así como por errores en la
aplicación de la técnica de purificación.
Calculo
112.18 ng/ µL (50 µL) = 5609 ng
convertimos a mg 5.609 x 10^-03 mg de
DNA
La concentración del ADN se puede
calcular utilizando un espectrofotómetro
de luz ultravioleta (UV) a una longitud de
onda de 260 nm, tal como se realizó en la
práctica, debido a que las bases puricas y
pirimidicas del ADN tienen la propiedad
de absorber la luz UV a esa longitud de
onda. Es importante tener en cuenta que,
dado el emparejamiento de sus bases
(puentes de hidrogeno) el ADN
bicatenario absorbe menos que el
monocatenario. La determinación de la
pureza del ADN se estableció mediante la
relación de las lecturas de las
absorbancias de 260 y 280nm. Es así
como una unidad de densidad óptica (DO)
a 260 nm equivale a 50mcg/ml de ADN de
doble cadena, a 40 mcg/ml de ARN y ADN
de cadena simple y a 20 mcg de
oligonucleótidos. Las preparaciones
puras de ADN y ARN tienen una relación
de DO 260/280 nm de 1.8 a 2.
Una parte importante en la cuantificación
del DNA es el cociente 260/280, como el
máximo de absorbancia de las proteínas
es a 280nm, el cociente de absorbancias
a 260/280 se utiliza para valorar la pureza
del DNA en la disolución. Se consideran
cifras óptimas de pureza aquellas que
presentan n cociente de 1.7 a 2.
Cocientes menores indican la presencia
de proteínas en el medio y cocientes
mayores indican la presencia de otras
sustancias contaminantes como el etanol.
(JIMENEZ, 2003). En base a esto se
observa que nuestra muestra tiene un
cociente dentro del valor considerado
como optimo, indicándonos que la
muestra tiene una pureza aceptable sin
presencia de impurezas.
CONCLUSIONES
1. Se logró realizar una extracción de
DNA a partir de sangre periférica
para la cual fue utilizada la técnica
de perclorato de sodio, con dicha
técnica fue posible observar la
estructura fibrilar del DNA así
como su empaquetamiento en el
núcleo celular.
2. Se obtuvieron fibras de DNA con
una muestra de sangre,
obteniendo para ella en disolución
una concentración de 112.18
ng/μL y lo que corresponde a 5.609
x 10^-03 mg de DNA en nuestra
muestra.
3. Se evaluó la pureza del DNA
purificado utilizando el cociente
260/280 de una técnica de
espectrofotometría, con dicha
técnica se reconoció que la
primera disolución de DNA
estudiada tiene una pureza
 adecuada, mientras que la
segunda disolución puede tener
presencia de proteínas como
impurezas. Referencias
4. Se conoció como evaluar el
tamaño de las cadenas obtenidas 1. Alejos, V., Aragón,
por electroforesis y utilizando un M. y Cornejo, A.
marcador de peso molecular. (2010). Extracción
y purificación de
DNA [Archivo
PDF].
Recuperado de
http://www2.inecc.
gob.mx/publicacio
nes/libros/710/extr
accion.pdf.
Consultado 02-10-
2016
2. Puerta, B. (1998). Prácticas de
biología molecular. Ed.
Javeriana. Madrid España.
3. Rada .t, Taboada. G.
(1998).Métodos de obtención
y purificación de ADN humano
para su aplicación en genética
molecular. Disponible
en :http://www.ops.org.bo/text
ocompleto/rnbiofa98060610.p
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