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Bacterias lácticas no fermento y
calidad de quesos
Jornadas
5 y 6 de junio de 2014
Dra. Erica Hynes
Bacterias lácticas no fermento y calidad de quesos
Las bacterias lácticas no fermento se desarrollan en todos

los quesos madurados
Predominan en los productos de maduración media y
prolongada
Pueden crecer en las condiciones ambientales del queso:
• Humedad 30 - 60 %
• pH 5,0-5,4 10
10
10
9
no fermento
• % de NaCl en la humedad entre 2-6
UFC g-1
8
10
7
10
• Bajo potencial redox (Eh –150 mV) 10
6
• Ausencia o cantidades muy bajas de 10

5
fermento
4
azúcares fermentables 10
3
10
• Bajas temperaturas de maduración 10 2
(7- 12 ºC) 10
0 50 100 150 200
Días de maduración
Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II
Lactobacillus casei /paracasei – Lactobacillus plantarum -

Lactobacillus pentosus - Lactobacillus rahmnosus, etc.
También se pueden considerar NSLAB:
• Lactobacilos heterofermentativos del grupo III

Lactobacillus fermentum, Lactobacillus brevis
• Bacterias lácticas termófilas no agregadas con el fermento
(Streptococcus thermophilus, Lactobacillus helveticus)
• Leuconostoc spp., pediococos y enterococos
Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso

Leche cruda
Fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
La elaboración de queso en condiciones asépticas o extra higiénicas
reduce sólo levemente la contaminación con NSLAB (McSweeney, 1994)
Se han encontrado cepas NSLAB que se recuperan luego de 72°C -
90 seg al ser incubadas en leche estéril (De Angelis et al., 2004)
4
3,5
3
Recuperación de células de
L. plantarum DPC2739 2,5
Log UFC / ml
(ca. 7,0 log UFC/ml) 2
calentadas 72 °C 90 seg, 1,5
en leche estéril a 7 °C por 20 días 1
0,5
0
0 5 10 15 20 25
Tiem po (días)

La leche cruda
Es la fuente mayoritaria de NSLAB en el queso
Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurización

– 73°C 15 seg - y termización – 60 °C 5 min) (Christiansen et al., 2006)
La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos

plantas distintas comparte gran parte de las cepas
(Poznanski et al., 2004)
Las leches con muy baja contaminación inicial desarrollan NSLAB

mucho más lentamente o alcanzan menores números, al igual que
leche de quesería microfiltrada (Crow et al., 2001)
La contaminación post pasteurización

También contribuye al desarrollo de las NSLAB en el queso
A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de

leche cruda, en la unidad de ultrafiltración, el fondo de la tina, la cinta
de cheddaring y la torre formadora de bloques (2-4 log UFC/ml)
(Sommers et al., 2001; Agarwarl et al., 2006)
La tecnología
y el medioambiente que ésta define
Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo
Tratamiento térmico de la leche
Fermento primario
Temperatura de maduración
Proteólisis primaria por coagulante y plasmina

La tecnología
tratamiento térmico
termización, pasteurización y cocción
La pasteurización introduce una 11
acción de selección sobre la 10
biota inicial de la leche de
g-1
9
10CFU
quesería. 8
log
7
En los quesos de leche cruda el
número inicial de NSLAB es más 6
7 22 37 52 67
alto (Bude Ugarte et al., 2006) Ripening time (days)
Fermento y NSLAB para quesos Pategrás

(♦) y semiduro de leche cruda (■)
La tecnología
tratamiento térmico
termización, pasteurización y cocción
Tanto los quesos de leche cruda como los de leche pasteurizada se han
encontrado comunidades bacterianas diversas (Babini et al., 2010).
En los quesos duros donde existe cocción, esta etapa también puede
tener un impacto en la composición de la flora no fermento, aunque la
temperatura no influye en el recuento promedio (Sheehan et al., 2007)
La tecnología
fermento primario
Si existe galactosa disponible, el crecimiento de las NSLAB correlaciona
con la disminución de galactosa en el queso
Lactobacillus
rahmnosus Exp
9 30
NSLAB control
8
recuento de lactobacilos (Log
25 Galactosa E
Galactosa (mmoles/Kg)
7
Galactosa C
6 20
cfu/g)
5
15
4
3 10
2
5
1
0 0
0 1 2 3 4 5 6
tiempo de maduración (meses)
Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus

además de L. lactis
La tecnología
temperatura de maduración
Tiene un fuerte impacto en la velocidad de crecimiento
Cheddar 1 ºC 8 ºC 12 ºC
6 meses 8 * 104 UFC g-1 1 * 107 UFC g-1 1 * 108 UFC g-1
9 Leche cruda
8 1ºC
7
6 Leche
log UFC g-1
5 pasteurizada
1ºC
4
Leche cruda
3
8ºC
2
1
Leche
0 pasteurizada
0 30 60 90 120 150 180
8ºC
Tiempo (días)
Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000

La distribución temporal y espacial
Fitzimons, 2001
El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos
En quesería industrial generalmente se las asocia a los defectos
Formación de gas
Cristales de de lactato de calcio
Off flavours
Inconstancia de la calidad
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no

deben presentar ojos o aberturas
Quiberoni et al., 2004

La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben
presentar ojos o aberturas
Causas
• Contaminación elevada en la leche cruda
Leuconostoc sp
Lactobacilos heterofermentantes obligatorios
Lb. brevis y Lb. fermentum
• Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador –

períodos de trabajo muy largos, contaminación del equipo con S.
thermophilus
• Fermento poco activo, consumo lento de la lactosa
No se han informado fallos asociados a lactobacilos

heterofermentantes facultativos, como Lb. paracasei y Lb.
plantarum.
La calidad

Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformes

o levaduras – que se produce muy tempranamente en la
maduración – y del defecto de hinchazón tardía en quesos
duros.
La calidad

• No afecta negativamente el aroma o

sabor de los productos – nota
intensa a manteca
• No trae problemas de inocuidad
• Deprecia el producto por su aspecto
y características físicas: aceptación
por parte del consumidor y
operaciones como corte y
empacado.
La calidad

Los sustratos para la producción de gas por NSLAB
• Lactosa residual
• Galactosa residual
• Citrato
• Aminoácidos
• Lactato (?)
La calidad

la fermentación proceso biológico
puede ser afectado de distinta forma por la actividad de

los microorganismos presentes y la tecnología de
elaboración,
distintas velocidades de desaparición de lactosa y sus

componentes, glucosa y galactosa
La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Sample descriptions Lactose determination by D-galactose

enzyme kit determination by
(mg 100 g-1) enzyme kit
Jarlsberg (Norwegian) <10 <10
Tesco Continental Gouda 140 <10
Sainsbury’s Dutch Gouda 30 <10
Asda Edam Wedge 20 <10
Sainsbury’s Mature West Country 30 <10
Farmhouse Cheddar
Tesco Continental Jarlsberg <10 <10
Asda West Country Farmhouse Cheddar 30 <10
Asda Gouda Wedge 100 20

Sainsbury’s Extra Mature West Country 60 <10
Farmhouse Cheddar
Tesco Fresh Italian Parmesan 30 <10
Sainsbury‘s Mature Gouda 40 <10
Portnoi & McDonald, 2009

La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o aberturas
Cheddar
Portnoi & McDonald, 2009

La calidad
Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o

aberturas
capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y

formar CO2
especie y cepa dependiente
vinculada a la presencia de azúcares en el medio y al

estado fisiológico de las células
La producción no deseada de CO2 debería

controlarse a través de:
la microbiota
la composición
la temperatura de enfriado del queso y de

maduración
Metabolismo del lactato

La calidad
Cristales de lactato de calcio
• Pequeños cristales visibles en superficies de corte

• son inocuos pero pueden ser confundidos con hongos por el
consumidor lo que provoca rechazo
• en general se consideran un defecto, aparecen en quesos
duros
• las bacterias lácticas del fermento producen L-lactato pero
muchas NSLAB producen directamente D-lactato, menos
soluble, o lo forman a partir del L- lactato
• este defecto se ve favorecido por enfriado lento de bloques
grandes de queso, bajo pH y alta temperatura de
maduración, así como el ahumado natural.
La calidad
Cristales de lactato de calcio
Pyruvate
Oxidation of L-lactate Reduction to D-lactate by

to pyruvate by L-lactate dehydrogenase D-LDH (NSLAB)
H H
C C
HO OH
COOH HOOC
H3C CH3
L(+)-Lactic acid D(-)-Lactic acid
McSweeney, 2003
La calidad
En quesería artesanal o productos de alto valor agregado (con

denominación de origen o productos probióticos, por ejemplo)
el rol de las NSLAB se revaloriza
Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour

Aceleración de la maduración
Degradación de péptidos amargos
Diversificación de notas de aroma
Potencial probiótico
AROMA Y SABOR DEL QUESO
McSweeney & Sousa, 2000

AROMA Y SABOR DEL QUESO
Sólo starter
Starter +
NSLAB1
Starter + Starter +
NSLAB2 NSLAB3
James Steele, 2012

desarrollo de flavour durante la maduración de quesos
Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos
principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por
aminotransferasas
GDH
Amino acids (Glutamate deshidrogenase)
α-ketoglutarate Glutamate
AT
(Aminotransferase) Glutamate
α-keto acid
Benzaldehyde (Phe)
Methylthioacetaldehyde (Met)
α -keto acid
dehydrogenase α -ketoacid
Hydroxyacid decarboxylase
Acyl-CoA Aldehyde Methanethiol (Met)

P-Cresol (Tyr)
Skatole (Trp) alcohol
dehydrogenase Dimethyldisulphide
Carboxylic Dimethyltrisulphide
Acid Alcohol
Tanous et al. (2002)
Antonie van Leeuwenhoek
82: 271–278, 2002.
desarrollo de flavour durante la maduración de quesos
Las bacterias lácticas inician la transformación de aminoácidos
principalmente a través de una reacción de transaminación, catalizada por
aminotransferasas
Aspartate GDH
α-ketoglutarate Glutamate
Asp-AT
Glutamate
Oxaloacetate
Oxaloacetate
descarboxilase
CO2 CO2
Acetaldehyde TPP Piruvate

Diacetyl
Acetolactate NADH
synthase CO2
Diacetyl reductase
O2 NAD
2-acetolactate
Acetolactate
descarboxylase Acetoin Butanediol
CO2
NADH NAD
Le Bars and Yvon (2008)

J Appl Microbiol 104 ,171–177
Alcoholes isohexanal Ésteres metileno bis(metilsulfuro)
1,2-butanodiol 2-metilbutanal acetato de etilo Compuestos nitrogenados
2-butanol 3-metilbutanal benzoato de etilo 2-acetil-1-pirrolina
AROMA Y SABOR etanol
2-etilbutanol
2-metilpropanal
Nonanal
butirato de etilo
hexanoato de etilo
Pirazinas
2,3-dietil-5-metilpirazina
DE QUESOS 2-etilhexanol (E,E)-2,4 nonadienal isobutanoato de etilo 2-etil,3-5-dimetil-pirazina
2-heptanol (Z)-2-nonenal octanoato de etilo 2-metoxi-3-
isopropilpirazina
hexanol (E)-2-nonenal 2-metilbutanoato de etilo Furanos
isobutanol octanal butanoato de isobutilo 2-etil-4-hidroxi-5-metil-
3(2H)furanona
3-hidroxi-4,5-dimetil-
2(5H)furanona
4-hidroxi-2,5-dimetil-3-
Compuestos aislados 2-metilbutanol pentanal acetato de 3-metilbutilo
(2H)furanona
Compuestos fenólicos
como componentes 3-metilbutanol propanal metil-2-metilbutanoato p-cresol
2-metilpropanol propenal 3-octil acetato Ácidos grasos
de “flavour” en varios 2-nonanol thripfen-2-aldehído acetato de pentilo acetato
(Z)-1,5- Cetonas acetato de fenetilo butirato
tipos de quesos octadien-3-ol
(Marilley & Casey, 2003) 2-octanol Acetoína butirato de propilo caproato
1-octen-3-ol Acetona Lactonas decanoato
2-pentanol 2,3- butanodiona δ-lactona isobutirato
(diacetilo)
feniletanol 2-butanona γ-lactona metilacetato
2- feniletanol h-damaescenona δ-dodecalanctona ác. 2-metilbutírico
1-prropanol 2-heptanona δ-octalactona ác. 3-metilbutírico
2-propanol 2-hexanona (Z)-6-dodecen-γ-lactona octanoato
Aldehídos 3-metil-2-butanona Compuestos azufrados fenilacetato
acetaldehído 2-nonanona dimetil disulfuro propionato
decanal 3-octanona dimetil sulfuro valerato
heptanal 1-octen-3-ona trimetil disulfuro
(Z)-4-heptenal 2-pentanona metanotiol
hexanal 2-tridecanona metional
2-hexenal 2-undecanona hexanotiol
Se conocen los compuestos que se necesitan para formar el
flavour del queso, pero no cómo combinarlos de manera
adecuada para conseguir la percepción global deseada en una
determinada matriz
La sinfonía del flavour:
“…… stimuli such as flavour compounds, notes of music, or

colours in a picture do not generate the same response when
they act singly, as when they act together in a rapid sequence
(e.g., an arpeggio) or even simultaneously (e.g., in a chord,
which can be harmonious or not).” “In each case, the whole ‘matrix’ or
environment must be considered”
Bosset, J. O. & Gauch, R. (1993) International Dairy Journal, 3, 359 –
377
“ We have our flavour orchestra:
• Chamber – cheese structure
• Flavour instruments – processes to
create flavour notes
• Flavour notes – cheese flavour compounds
The challenge is to conduct the orchestra to

deliver the symphony of cheese flavour”
Holland & Coolbear, 2012

La calidad
• Si se agrega α-cetoglutarato al queso, el aroma general

aumenta significativamente.
• Si se utilizan cepas de lactococos donde se inhibió la síntesis
de aminotransferasas, el aroma y sabor del queso disminuye.
Si la síntesis de aminotranferasas, por el contrario, se
aumenta, el sabor y aroma del queso se incrementan
Controlar el catabolismo de los aminoácidos por los

microorganismos del queso promete ser una manera
eficaz de controlar la formación de aroma y sabor en
el queso
Yvon & Rijnen, 2001

La calidad

En quesos madurados únicamente con bacterias lácticas, la
mitad de los componentes clave en el flavour provienen del
catabolismo de los aminoácidos.
Patentes:
• FR 97 05133, PCT/FR98/00828 – 2000 - M. Yvon y J-C Gripon.
Utilización de cetoácidos para incrementar el flavour de productos a base
de queso
• WO2003056025 - 2003 - M. Yvon, E. Chambellon, A. Gori. Selección y
utilización de cepas de bacterias lácticas capaces de producir a-
cetoglutarato a partir de citrato y de glutamato a lo largo de la maduración
de quesos para la transformación de aminoácidos en moléculas de
aroma.
• EP1789542 - 2006 - M. Yvon, C. Tanous, E. Chambellon, M. Nardi .
Gene que codifica una glutamato dehidrogenasa, plásmido conteniendo
dicho gene y sus utilizaciones.
La calidad
La calidad
Á r e a ( u n id a d e s a r b it ra ria s )
2000
Diacetilo
1500 Acetoína
1000
Peralta et al., 2010
500
0
C1-60 días E1-60 días C2-60 días E2-60 días
Tipo de queso
Wolf et al., 2009

La calidad
Adjunto de Lb. paracasei I90
En queso cremoso mini

La calidad
Adjunto de Lb. paracasei I90
En modelo de queso Reggianito

La calidad
Potencial probiótico
Algunas cepas de origen NSLAB han demostrado potencial

probiótico in vitro y se han probado exitosamente en matrices
alimentarias
500
450
Nº IgA+ cells/10 fields

400
350
300
250
200
Control Control cheese Cheese + Lp I90 Cheese + Lp I91
Burns et al., 2012

La estrategia de los fermentos adjuntos
Busca reunir las ventajas de la presencia de las NSLAB

en quesos, incrementando el control sobre la maduración
Cepas de bacterias lácticas aisladas de quesos de buena

calidad, identificadas y caracterizadas.
Se agregan a la leche de elaboración además del fermento
primario (starter)
Fermentos adjuntos
Requisitos de un adjunto
Obligatorios
No contribuir a la acidificación
Proliferar rápidamente en la cuajada y mantener la
viabilidad durante la maduración del queso
No producir ningún defecto
Facultativos
Aumentar la proteólisis secundaria
Disminuir el gusto amargo
Incrementar la bioformación de flavour
Tener potencial como probiótico
Fermentos adjuntos
“Gracias a un mejor conocimiento, a través de la investigación en

todo el mundo, la industria quesera tiene hoy acceso a una serie de
herramientas para obtener quesos de calidad y mejores ingredientes
de flavour para quesos. Una aplicación exitosa es la mejora en la
constancia del flavour mediante el agregado de fermentos adjuntos
de origen NSLAB, con propiedades de formación de flavour
comprobadas, a quesos con una mínima cantidad de NSLAB
adventicias; esto quiere decir: quesos limpios”
Johnston et al., 2010, Fonterra

Materia prima adecuada + fermentos primarios y

adjuntos adecuados + manejo de la temperatura
+ bajo contenido inicial de
lactosa/galactosa/citrato
Mayor control de la maduración

Troubleshooting
Problema Causa Solución
Producción de CO2 con ojos y Altos recuentos de bacterias lácticas Mejora de la calidad microbiológica
aberturas no deseadas en leche cruda de la leche cruda (Buenas prácticas
provocado por bacterias lácticas Funcionamiento prolongado del de ordeño, Microfiltración)
no fermento pasteurizador Ciclos adecuados de trabajo y
Fermento primario lento limpieza
Agregado de polvos o retentados para Fermento primario adecuado
aumentar rendimiento Fermento adjunto
Enfriado lento de las hormas, cortes en Lavado de la cuajada
cadena de frío, altas temperaturas de Adecuada capacidad de
maduración salado/enfriado
Mantenimiento de la temperatura
consigna
Producción de cristales de Altos recuentos de bacterias lácticas Mejora de la calidad microbiológica
lactato de calcio en leche cruda de la leche cruda (BPO, MF)
Valores de pH bajos Mantenimiento de pH y temperatura
Altas temperaturas de maduración de maduración adecuados
Producción de off flavors Altos recuentos de bacterias lácticas Mejora de la calidad microbiológica
en leche cruda de la leche cruda (BPO, MF)
Predominio de cepas que producen Fermento adjunto
notas de flavour no buscadas
Sabor poco intenso (mild/flat) Bajos recuentos de bacterias lácticas Fermento adjunto
en leche cruda
Predominio de cepas que no producen
flavour
Control de las NSLAB: las tres K
Las tres K Causa

Keep them out Minimizar la contaminación:
Mantenerlas fuera Calidad de la materia prima
Sanitización de la planta
Kill them Pasteurizar

Matarlas
Keep them from growing Temperatura

Mantenerlas en bajo número Condiciones ambientales
Nutrientes
Bacteriocinas
James Steele, 2012

Muchas gracias!

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Bacterias lácticas no fermento y

Las bacterias lácticas no fermento se desarrollan en todos

• Ausencia o cantidades muy bajas de 10

Lactobacilos heterofermentativos facultativos del grupo II

Lactobacillus casei /paracasei – Lactobacillus plantarum -

También se pueden considerar NSLAB:

• Lactobacilos heterofermentativos del grupo III

Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso

(ca. 7,0 log UFC/ml) 2

calentadas 72 °C 90 seg, 1,5

en leche estéril a 7 °C por 20 días 1

Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso

Varias cepas de NSLAB sobreviven a tratamientos de pasteurización

La flora NSLAB de quesos elaborados con la misma leche en dos

Las leches con muy baja contaminación inicial desarrollan NSLAB

Origen de las bacterias lácticas no fermento en el queso

La contaminación post pasteurización

A partir de bioflims que se hallan en plantas sanitizadas, en el silo de

Influyen en la flora NSLAB y su desarrollo

Tratamiento térmico de la leche

Proteólisis primaria por coagulante y plasmina

La pasteurización introduce una 11

acción de selección sobre la 10

biota inicial de la leche de

Fermento y NSLAB para quesos Pategrás

Crecimiento de NSLAB adventicias en quesos Cheddar elaborados con S. thermophilus

Shakeel-Ur-Rehman et al., 2000

La distribución temporal y espacial

El impacto de las NSLAB en la calidad de quesos

En quesería industrial generalmente se las asocia a los defectos

Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no

Quiberoni et al., 2004

• Problemas asociados al funcionamiento del pasteurizador –

No se han informado fallos asociados a lactobacilos

Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

Este defecto es diferente del causado por bacterias coliformes

Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

• No afecta negativamente el aroma o

Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

Los sustratos para la producción de gas por NSLAB

Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben

la fermentación proceso biológico

puede ser afectado de distinta forma por la actividad de

distintas velocidades de desaparición de lactosa y sus

Sample descriptions Lactose determination by D-galactose

Asda Gouda Wedge 100 20

Portnoi & McDonald, 2009

Portnoi & McDonald, 2009

Producción no deseada de gas (CO2) en variedades que no deben presentar ojos o

capacidad de las NSLAB para degradar el citrato y

especie y cepa dependiente

vinculada a la presencia de azúcares en el medio y al

La producción no deseada de CO2 debería

la temperatura de enfriado del queso y de

Metabolismo del lactato

• Pequeños cristales visibles en superficies de corte

Oxidation of L-lactate Reduction to D-lactate by

L(+)-Lactic acid D(-)-Lactic acid

En quesería artesanal o productos de alto valor agregado (con

Metabolismo de aminoácidos y formación de flavour

McSweeney & Sousa, 2000

James Steele, 2012

Acyl-CoA Aldehyde Methanethiol (Met)