UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
UNIDAD ACADÉMICA DE QUÍMICA ORGÁNICA

GUÍA DEL ESTUDIANTE

Laboratorio de BIOQUÍMICA (QAO-901)
Licenciatura en Química

Periodo Lectivo I-2018

 ÍNDICE DE PRÁCTICAS
CONTENIDO TEÓRICO
Semana Contenido
1y2 Tema 1. Ácidos nucleicos (4 h)
Concepto e interés biológico. Clasificación. Bases púricas y pirimidínicas. Nucleósidos y nucleótidos.
Niveles de estructura en los ácidos nucleicos. Estructura de los polinucleótidos. Ácido
desoxirribonucleico (ADN) y su estructura. Desnaturalización de ADN. Ácido ribonucleico (ARN).
Principales tipos de ARN y sus estructuras.
Introducción a la biosíntesis de ácidos nucleicos. Introducción a la biosíntesis de proteínas. Técnicas de
Biotecnología de ácidos nucleicos. Métodos para trabajar con ácidos nucleicos. Herramientas para la
investigación del ADN. Endonucleasas de restricción. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El
ADN recombinante y la clonación. Determinación de la secuencia de bases de ácidos nucleicos.
3 Tema 2. Técnicas experimentales de análisis de proteínas (2 h)
Técnicas de purificación y caracterización de proteínas. Purificación de proteínas. Centrifugación.
Liofilización. Tipos de cromatografía líquida: exclusión molecular, intercambio iónico, afinidad.
Electroforesis. Introducción a la secuenciación de péptidos.
CONTENIDO EXPERIMENTAL
Semana Contenido
4 PRÁCTICA Nº 1. CARBOHIDRATOS. Reacciones de reconocimiento de carbohidratos.
Aislamiento y
determinación cuantitativa de lactosa en leche. (4 h)
Reconocimiento de carbohidratos en una muestra problema. Determinación cuantitativa de
carbohidratos por colorimetría.
5 PRÁCTICA 2. PROTEÍNAS. Reacciones de reconocimiento de aminoácidos. Aislamiento
y determinación de caseína en leche. Hidrólisis de caseína y determinación cualitativa
de sus aminoácidos mediante cromatografía en papel. (4 h)
Solubilidad de proteínas. Métodos de fraccionamiento de proteína. Determinación cuantitativa de
proteínas. Reacciones de reconocimiento de aminoácidos.
6 PRÁCTICA 4. ENZIMAS Determinación de peroxidasa de rábano (Raphanus sativus)(4 h)
Reconocimiento y estudios enzimáticos en materiales biológicos. Cuantificación de una actividad
enzimática. Caracterización cinética de una enzima (determinación de KM y Vmax). Efecto de temperatura,
pH, concentración de sustrato, entre otros factores que afectan la actividad enzimática.
7 PRÁCTICA Nº 5. LÍPIDOS. Aislamiento de lípidos totales de la yema de huevo y
cuantificación de colesterol (4 h)
Extracción de lípidos totales. Identificación de lecitinas y colesterol. Determinación cuantitativa de
lípidos totales y colesterol
8 PRÁCTICA Nº 1. ÁCIDOS NUCLEICOS. Extracción de ADN de bacterias del suelo (4 h)
Extracción de ADN. Efecto hipercrómico. Reconocimiento de Fosfato y desoxi-ribosa en el ADN.
9 Práctica especial
10 Parcial
 INTRODUCCIÓN
El objetivo de esta guía es el de orientar al alumno de la asigantura Laboratorio de
Bioquímica de la Licenciatura en Química de la Facultad de Ciencias y Tecnología de la
Universidad de Carabobo, en la realización de las prácticas. Se ha diseñado para ello un
esquema de prácticas que permitirá al alumno, mediante la revisión de la bibliografía,
diseñar procedimientos para cumplir con los objetivos planteados en cada práctica.

El laboratorio de bioquímica está enfocado hacia el reconocimiento y la determinación de

biomoléculas (carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) en diferentes muestras
biológicas. Adicionalmente, se plantea una práctica de enzimas, que permite al estudiante
de bioquímica estudiar y entender cómo se realiza un proceso enzimático.
Para cada una de las prácticas se les plantea los objetivos que se deben lograr y se les
proporciona las referencias bibliográficas que deben consultar. En algunos casos se les
plantea diseñar los diferentes procedimientos a emplear, y en otros se les proporciona el
procedimiento completo para que realicen cada experiencia.
PRÁCTICA Nº 1. CARBOHIDRATOS
Reacciones de Reconocimiento de carbohidratos.
Aislamiento y determinación cuantitativa de lactosa en leche.
Objetivos
1. Identificar el carbohidrato presente en una muestra problema mediante diferentes
reacciones de identificación.
2. Aislar lactosa de la leche.
3. Determinar el contenido de lactosa en leche usando el método de la antrona.

EXPERIMENTO 1. Reacciones de reconocimiento para carbohidratos

REACCIÓN DE MOLISH
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2
o 3 gotas del reactivo de Molish, agite los tubos. Seguidamente, por las paredes de cada
tubo, agregue 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. Observe que ocurre. Anote sus
observaciones.

REACCIÓN DE BENEDICT
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 1
mL del reactivo de Benedict, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño
de agua hirviente. Observe que ocurre. Anote sus observaciones.

REACCIÓN DE BARFOED
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2
mL del reactivo de Barfoed, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño
de agua hirviente y controle el tiempo de aparición de un precipitado. Anote sus
observaciones.

REACCIÓN DE SELIWANOFF
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 0,5 mL de la sustancia que se indica y
1 mL del reactivo de Seliwanoff, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un
baño de agua hirviente. Anote sus observaciones.

REACCIÓN DE BIAL
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2
mL del reactivo de Bial, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de
agua hirviente. Anote sus observaciones.
REACCIÓN DEL ÁCIDO MÚCICO
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno aproximadamente 300 mg de los
compuestos que se indican; luego añada 0,2 mL de agua y 1 mL ácido nítrico concentrado,
agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua hirviente. Despues
de 1-2 horas observe al microscopio. Anote sus observaciones.

(Usted solo realizará la reacción del ácido múcico con su muestra problema y un patrón)

REACCIÓN DE LUGOL
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 0,5 mL de la sustancia que se indica y
1-2 gotas del reactivo de lugol, agite los tubos. Observe lo que ocurre. Anote sus
observaciones.

Diseñe un cuadro donde señale (para cada carbohidrato utilizado y su muestra problema)
con positivo (+) ó negativo (-) los resultados de cada reacción o prueba realizada.
Identifique la muestra problema y discuta los resultados.

EXPERIMENTO 2. AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE

LACTOSA EN LECHE
Se realizará el aislamiento de lactosa de la leche y se determinará cuantitativamente
usando el método de la Antrona. Deben investigar el procedimiento a emplear utilizando
la bibliografía que se señala.
El aislamiento de caseína se realiza paralelamente al aislamiento de la lactosa. La caseína
aislada debe guardarla hasta la siguiente semana para realizar la práctica 2.
Debe reportar el porcentaje de lactosa obtenido en la leche y discutir los resultados.
PRÁCTICA 2. PROTEÍNAS
Reacciones de reconocimiento de aminoácidos. Aislamiento y determinación
de caseína en leche. Hidrólisis de caseína y determinación cualitativa de sus
aminoácidos mediante cromatografía en papel.
Investigue sobre:
Solubilidad y precipitación de las proteínas.
Clasificación de proteínas por el criterio de solubilidad.
Reacciones características de los aminoácidos.
Método de determinación de proteínas.
Objetivos
1. Aislar caseína de la leche.
2. Determinar el contenido de caseína en leche.
3. Determinar cualitativamente los aminoácidos presentes en la caseína de la leche.
4. Realizar algunas reacciones específicas de identificación de aminoácidos.

HIDRÓLISIS DE LA CASEÍNA

En un vaso de precipitados adicionar 20mL de HCl al 19%, 20mL de agua y 0,5g de caseína.
Adicionar a la mezcla un agitador magnético, tapa con un vidrio reloj y calentar en una
plancha (dentro de una campana de extracción) durante 35 minutos. Verificar la hidrólisis
de la caseína mediante la realización de la prueba de Biuret* y una vez hidrolizada la
caseína (Tras la verificación mediante la prueba de Biuret) adicionar 0,5g de carbón
activado para posteriormente filtrar por gravedad a un matraz Erlenmeyer de 50mL. Si la
hidrólisis no ha terminado, adicionar 3 o 5 mL más de HCl y calentar por 5min más.
*
Neutralizar el ácido clorhídrico antes de la realización de la prueba de Biuret

Cortar un papel Whatman No.1 con de la forma que se muestra a continuación:

15,5 cm

24 cm
Marcar en un extremo con lápiz (tratar de no manipular el papel directamente), hacer una
línea que una los dos cuadros y hacer puntos con distancia de 1,5cm entre ellos; sobre los
puntos adicionar gotas con los aminoácidos que sirven de patrón (lisina, tirosina, prolina,
cisteína, fenilalanina, arginina) y con la muestra hidrolizada.
Introducir el papel con las muestras dentro de una cámara cromatográfica con una mezcla
de fenol al 80% .

REACCIONES CUALITATIVAS DE AMINOÁCIDOS

Prueba de Sakaguchi

Añadir 1 mL de las sustancias enlistadas en la tabla a distintos tubos de ensayo. Agregar

0,25mL de NaOH al 10%, 0,25mL de α- naftol 0,05%. Luego de 5min de reposo agregue de
3 a 5 gotas de hipobromito de sodio

Tubo 1 2 3 4 5
Sustancia Arginina Caseína Tirosina Agua Muestra

Reacción Xantoprotéica

Añadir 1 mL de las sustancias enlistadas en la tabla a distintos tubos de ensayo. Agregar

0,5mL HNO3 y 2mL de NaOH 8M

Tubo 1 2 3 4 5
Sustancia Fenilalanina Caseína Tirosina Agua Muestra

Reacción de Acree- Rosenheim

Añadir 1 mL de las sustancias enlistadas en la tabla a distintos tubos de ensayo. Agregar

0,5mL de formaldehído y 1mL de H2SO4

Tubo 1 2 3 4 5
Sustancia Triptófano Caseína Cisteína Agua Muestra

Reacción de sulfidación

Añadir 1 mL de las sustancias enlistadas en la tabla a distintos tubos de ensayo. Agregar

1mL de NaOH al 10% y 0,25mL de Pb(NO3)2 al 1% ; posteriormente caliente en baño de
agua hirviente.

Tubo 1 2 3 4 5
Sustancia Triptófano Caseína Cisteína Agua Muestra
Reacción de Biuret

Añadir 1 mL de las sustancias enlistadas en la tabla a distintos tubos de ensayo. Agregar

1mL de NaOH al 10% y 0,5mL de CuSO4 0,5%

Tubo 1 2 3 4 5
Sustancia Biuret Caseína Urea Agua Muestra
PRÁCTICA 3. ENZIMAS
Determinación de peroxidasa de rábano (Raphanus sativus)
Investigue sobre:
Catalizadores biológicos.
Cinética de la catálisis enzimática.
Efecto de temperatura, pH, cantidad de enzima, sustrato entre otros factores, sobre
la
actividad enzimática.
Objetivos
Evaluar la actividad enzimática de peroxidasa en un extracto de rábano (Raphanus
sativus).
1. Comprobar los efectos de la concentración de sustrato, pH, temperatura y tiempo de
incubación sobre la actividad enzimática.
2. Estimar los parámetros cinéticos (KM, VMÁX, CAT) de la peroxidasa para el sustrato
utilizado.
Procedimiento
Basándose en la metodología planteada por Armado (2002) realice lo siguiente:
Prepare el extracto de rábano y determine el contenido de proteínas presente en el
extracto, mediante el método de Biuret.
Determine la actividad del extracto vegetal usando como sustrato el compuesto
orgánico que se le asigne, en presencia de H2O2. Varíe la cantidad de extracto desde 0
hasta 2 mL, y determine donde se obtiene mayor actividad.
Usando la cantidad de extracto donde se observe mayor actividad según el
experimento anterior, diseñe sendos experimentos donde varíe la concentración de fenol
manteniendo constante la concentración de H2O2, por un lado y otro donde manteniendo
fija la concentración de fenol, varíe la concentración de H2O2.
Realice la determinación de la actividad enzimática utilizando soluciones
amortiguadoras a diferentes pH (entre 4 y 9), tomando la cantidad de extracto,
concentración de sustrato y H2O2 donde se obtiene mayor actividad.
Determine con los parámetros anteriormente determinados, la actividad enzimática a
diferentes temperaturas.
NOTA: Para detener la reacción agregue a cada sistema 2 mL de H2SO4 al 20%, en todos los
experimentos.
Resultados
Determine la velocidad de reacción y actividad específica en base a las absorbancias
obtenidas, el tiempo de reacción y la concentración de proteína.
Construya una gráfica para cada parámetro evaluado en función de la
actividadcenzimática. Discuta el efecto de cada parámetro sobre la actividad enzimática.
Obtenga las gráficas de: V vs [S], 1/V vs 1/[S] y V/[S] vs V.
Estime los parámetros cinéticos KM, VMÁX, CAT mediante los tres gráficos anteriores, y
discuta acerca de las posibles diferencias en los valores obtenidos.
PRÁCTICA 4. LÍPIDOS
Aislamiento de lípidos totales de la yema de huevo y cuantificación de
colesterol
NOTA: DEBE TRAER 1 HUEVO Y HIELO PARA LA REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA
Objetivos
1. Aislar los lípidos presentes en la yema de huevo.
2. Determinar el contenido de lípidos totales en la yema de huevo.
3. Separar mediante cromatografía de capa fina los lípidos presentes en la yema de huevo.
4. Realizar el fraccionamiento de lípidos en esteroles y lecitinas.
5. Realizar reacciones de reconocimiento de esteroles y lecitinas.
Experimento 1. Aislamiento de lípidos totales de la yema de huevo.
Siga el procedimiento sugerido por Barreto, J. Chem. Edu. Vol. 82 No. 1, 2005, pg. 103.
Experimento 2. Determinación de lípidos totales en yema de huevo.
Tome una alícuota de 4 mL del extracto clorofórmico y colóquelo en un vaso de
precipitados previamente pesado. Evapore cuidadosamente hasta sequedad (en una
plancha de calentamiento o estufa). Luego de dejar enfriar a temperatura ambiente en un
desecador, pese nuevamente. Determine la cantidad de lípidos en base a 100 g de yema
de huevo.
Experimento 3. Fraccionamiento de lípidos
Realice el fraccionamiento de lípidos de la yema de huevo, para obtener así las fracciones
de lecitinas y esteroles.

Experimento 4. Cuantificación de colesterol

Evapore hasta sequedad la fracción E obtenida en el experimento anterior. Pese la
fracción.
Deje enfriar y disuelva el residuo en ~2 mL de cloroformo.
A continuación, emplee algún método de cuantificación de colesterol. Consulte con el
asistente,
previo al experimento para conocer la existencia de los reactivos químicos necesarios.
PRÁCTICA Nº 5. ÁCIDOS NUCLEICOS
Extracción de ADN de bacterias del suelo
Los ácidos nucleicos constituyen macromoléculas fundamentales para las células, pues
ellas son las encargadas de la transmisión de la información genética, de generación en
generación. El
ADN es la molécula donde se encuentran codificados todos los genes (genoma) que una
célula puede expresar, mientras que el ARN se involucra en los procesos de trascripción y
traducción de la información biológica.
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son polinucleótidos formados por monómeros llamados
nucleótidos. Un nucleótido se compone de un azúcar de 5 átomos de carbono (ribosa en
el ARN y desoxiribosa en el ADN), una base nitrogenada y una molécula de fosfato (PO 43-).
Los genomas presentan una organización diferente en células procariotas y eucariotas.
En las procarióticas, el ADN se encuentra como una larga molécula de dos cadenas
formando el cromosoma bacteriano que se condensa para dar origen a una masa visible
llamada nucleoide.
En la mayoría de los organismos procarióticos, el ADN es circular y, en general, poseen un
cromosoma único. Por esta razón contienen una sola copia de cada gen, por lo que son
genéticamente haploides. La mayoría de los procariotas contienen también pequeñas
cantidades de ADN extracromosómico, dispuesto habitualmente de modo circular, que
constituyen los plásmidos.
En células eucariotas, a diferencia de las procariotas, los ácidos nucleicos se encuentran
compartamentalizados, el ADN se encuentra básicamente en el núcleo, asociado a
histonas, constituyendo nucleoproteinas que conocemos como cromosomas. El ARN se
encuentra mayoritariamente en el citoplasma, (ARNr) constituyendo partículas
ribonucleoproteicas, los llamados ribosomas. Otros tipos de ARN se encuentran formando
ribonucleoproteínas solubles en el citoplasma (ARNm) o prácticamente desprovistos de
proteínas (ARNt).
El contenido de ADN por célula es constante para todas las células del mismo organismo
mientras que el contenido de ARN varía de acuerdo al tejido y a la condición fisiológica de
la célula. Por ejemplo, el contenido de ADN por célula de ratón es de 4,6 pg, equivalente a
3 x 1012 daltons o 4,6 x 109 pares de bases. (B. Lewin, Gene Expresión. Eucaryotic
Chromosomes. J. Wiley and Sons Ltd. 1974. p.7). Se ha reportado ~4.2 fg de DNA/célula
bacteriana, basado en Kubitschek, HE y Friedman, MC (1971) [Chromosome replication
and the division cycle of Escherichia coli B/r. Journal of Bacteriology. 107:95-99.]
OBJETIVOS
- Aislar ADN de una fuente bacteriana.
- Evidenciar algunas propiedades físicas de los ácidos nucleicos, tales como viscosidad,
absorción de luz ultravioleta, efecto hipercrómico.
- Evidenciar mediante reacciones químicas los diferentes constituyentes de la molécula de
ADN.
- Determinar cuantitativamente el contenido de ADN por gramo de bacteria, basado en su
capacidad de absorber luz en la región ultravioleta del espectro electromagnético.
PROCEDIMIENTO
I. EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
Esta práctica se efectuará según el protocolo planteado por: Sims, Branscum, Kao y
Keaveny, J. Chem. Edu., 87(10), 1113, 2010.

II. CARACTERÍSTICAS DE LAS MOLÉCULAS AISLADAS

a. Absorción de luz y efecto hipercrómico
Diluya 1,0 mL de la solución de ADN, con 5 mL de NaCl 0,9%, determine la absorbancia a
260 nm y ajuste la absorbancia a ~1 Unidad/mL. Debe preparar un volumen mínimo de ~6
mL. Luego, determine la absorbancia a 280 y 320 nm.
Disponga de 1 tubo de ensayo y adicione 3 mL de la solución de ADN preparada. Caliente
por 10 min en agua hirviente el tubo 1. Determine la absorbancia a 260, 280 y 320 nm.
Anote sus valores y calcule el cociente A260/A280. ¿A qué se debe el incremento en
absorbancia después del calentamiento?
b. Determinación cualitativa de desoxiribosa
En un tubo de ensayo dispense 0.5 mL de la solución de ADN concentrada, adicione 2,5
mL. De reactivo de Bial y caliente sobre una plancha, a 100 ºC por 10 min. Observe la
coloración verde característica de pentosa.
c. Determinación cuantitativa de fosfato en ADN
En un tubo de ensayo adicione 0,5 mL de la solución diluida de ADN y 1,0 mL de H 2SO4
30% v/v, caliente vigorosamente sobre un mechero. Observe el oscurecimiento de la
solución, adicione 4-5 gotas de peróxido de hidrógeno y continúe calentando hasta que la
solución se torne incolora.
Disponga 6 tubos de ensayo y adicione las soluciones (V en mL) que a continuación se
indican:
Mida la absorbancia a 660 nm a cada muestra, ajustando el espectrofotómetro a cero con
el tubo blanco. En base a los volúmenes, diluciones y patrones usados en esta sección,
calcule la cantidad de fósforo en la muestra de DNA. Haga un duplicado de su muestra de
DNA.

III. CÁLCULOS A EFECTUAR

Tomando en consideración:
a) el peso de su cultivo celular (esta información será suministrada en función de la
turbidez del cultivo)
b) Volumen (mL) de cultivo procesado
c) Las diluciones efectuadas, y
d) las absorbancias determinadas
Calcule:
a) Concentración de ADN (μg/mL)
b) Pureza de ADN
c) Peso de una célula bacteriana.
Notas:
La compañía PROMEGA, informa a sus clientes acerca de lo siguiente:
“DNA concentration can be estimated by measuring the absorbance at 260nm (A 260),
adjusting the A260 measurement for turbidity (measured by absorbance at 320nm),
multiplying by the dilution factor, and using the relationship that an A260 of 1.0 = 50 μg/ml
pure DNA.
Concentration (μg/ml) = (A260 reading – A320 reading) × dilution factor × 50μg/ml
Total yield is obtained by multiplying the DNA concentration by the final total purified
sample volume.
DNA yield (μg) = DNA concentration × total sample volume (ml)
DNA purity can be estimated from the A260/A280 ratio. An A260/A280 ratio between 1.7 and
2.0 generally represents a high-quality DNA sample. The ratio can be calculated after
correcting for turbidity (absorbance at 320nm).
DNA Purity (A260/A280) = (A260 reading – A320 reading) ÷ (A280 reading – A320 reading)
Note: A spectrophotometer is most accurate when measurements are within the
instrument's linear range (generally 0.1–1.0).”

Refrencias
1. Von Hippel, P. H.; Wong, K. Y. J. Biol. Chem. 1965, 240, 3909-3923.
2. Rex, J. H. Focus 2000, 22, 26-27.
3. Boyer, R. Biochemistry Laboratory: Modern Theory and Techniques, 1st
ed.;
Benjamin Cummings: San Francisco, 2006; p 297.
4. Blattner, F. R.; et al. Science 1997, 277, 1453 1474.
5. Güssow, D.; Clackson, T. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 4000.
6. Sandhu, G. S., Precup, J. W., and Kline, B. C. BioTechniques 1989, 7,
689-670.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS GENERALES
Alemany, M. y Font, S. (1982) Prácticas de Bioquímica. Editorial Alhambra, S.A.
Madrid, España. Primera edición.
Arzola, C. y Holguín, C. (2006) Manual de Prácticas de Bioquímica. Universidad
Autónoma de Chihuahua. Facultad de Zootecnia.
GUÍA PRÁCTICAS “BIOQUÍMICA”. 1º Licenciado en Química, Curso 2006/07.
Universidad de Huelva, FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES. Departamento de
Química y Ciencia de los Materiales. Área de Bioquímica y Biología Molecular.
Pavia, D. (1976) Química Orgánica Experimental. Primera edición. EUNIBAR, Barcelona
España. Páginas 77-83, 369-420.
Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. Editorial Interamericana, S. A.
México. Primera edición.
Shriner, R. L.; Fuson, R. C. y Curtin, D. Y. (2001) Identificación sistemática de
compuestos orgánicos. Editorial Limusa, S. A. México.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ESPECÍFICAS

Armado, A. (2002) Metodología para la determinación de fenoles y otros compuestos
aromáticos utilizando extractos vegetales. Trabajo de ascenso. FACYT. Universidad de
Carabobo.
Barreto, J. (2005) Lipid Extraction and Cholesterol Quantification: A Simple Protocol.
Chem. Edu. 82 (1): 103-104.
Sims, Branscum, Kao y Keaveny (2010) J. Chem. Edu., 87(10), 1113.