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14 DE MAYO DE 2018

RECUENTO DE CELULAS
RECUENTO DE CÉLULAS. DETERMINACIÓN DE CÉLULAS MUERTAS POR AZUL DE METILENO

DOCENTES:
STELLA, LAURA INES
GARCIA, ROCIO

ALUMNO: NOLTE RAFAEL


COMISIÓN 5
UTN FRRe
1 Biotecnología Recuento de Células – Determinación de Células muertas por Azul de Metileno UTN FRRe

Objetivos
 Determinar el número de células de levaduras por recuento directo en cámara de Neubauer.
 Determinar el porcentaje de células viables por recuento directo.

Introducción
Cuando se pretende emplear microorganismos a un proceso industrial, es crucial tener
conocimiento y el mayor control sobre las condiciones físicas y químicas del medio en que se
dispondrán para su desarrollo. El ciclo vital de un microorganismo se basa en el crecimiento del
mismo para su posterior replicación o reproducción, llevando consigo a un aumento en el número
de células o de masa celular en un medio determinado. Como dicho medio es en esencia un medio
de cultivo rico en nutrientes y factores de crecimiento, es de esperarse que, durante un cierto lapso
de tiempo ocurra un aumento en el número de microrganismos de la muestra tomada.

Como resulta de interés poder analizar y controlar los rendimientos asociados a procesos
biotecnológicos donde se emplean ciertos microorganismos, como ser las levaduras, han surgido
métodos y técnicas para realizar un conteo de las células presentes en una muestra. Una de estas
técnicas implica la utilización de una cámara especial para el contaje de células junto con el
microscópico óptico, siendo la cámara mencionada conocida como cámara de Neubauer. Como este
método no permite distinguir células cuya actividad metabólica es baja o nula de aquellas que si son
activas, se complementa la técnica mencionada anteriormente con el empleo de azul de metileno.
Este colorante se utiliza a fin de determinar el porcentaje de células viables en una muestra a partir
de la identificación de células muertas o inactivas.

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Materiales
 Tubos de ensayo
 Tubos capilares
 Pisetas
 Portaobjetos

Instrumentos
 Microscopio óptico
 Cámara de Neubauer
 Cubre cámara

Reactivos y/o sustancias


 Agua destilada
 Azul de metileno
 Alcohol etílico
 Suspensión de levaduras

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Desarrollo
Parte A: empleando la cámara de Neubauer se procedió a realizar el conteo de células de levaduras
provenientes de una muestra preparada a partir de levadura fresca. En primera instancia se trabajó
con una solución de levadura a razón de 1:10 partes, siendo la misma proporcionada por la catedra.
Utilizando un tubo capilar, se recolecto una pequeña porción de muestra de la solución para
colocarla en la cámara de Neubauer, con el cubre objetos posicionado por encima de la cuadricula
de la cámara. Por capilaridad el fluido contenido en el tubo capilar descendió del mismo, ubicándose
en el volumen determinado por la cámara y el cubreobjetos.

Para la observación al microscopio fue necesario darle un tiempo a la muestra dispuesta en la


cámara para que las levaduras sedimenten. Pasado dicho tiempo, se procedió a ubicar la cámara de
Neubauer en la platina del microscopio para las observaciones y conteo de células. Para esta tarea
se ajustó el microscopio a fin de obtener un aumento de 400x, logrado por el ocular que da un
aumento de 10x junto con el lente objetivo ajustado a un aumento de 40x. Una vez ajustado el
microscopio correctamente, se realizó el conteo de las células en cinco áreas específicas de la
cuadricula trazada en la cámara. En esta ocasión se decidió trabajar con el cuadro central y los
correspondientes a los cuatro vértices del cuadro tomado.

Parte B: para esta parte del práctico se utilizó azul de metileno como colorante para la visualización
diferencial de levaduras muertas. Las mismas retienen dicho colorante, siendo distinguibles al
microscopio de aquellas células de levadura que si están activas metabólicamente. Se procedió
aplicando el colorante a la suspensión de levadura durante un tiempo de cinco minutos, de modo
que se asegure la coloración de las células inactivas. Cumplido el tiempo establecido, con ayuda de
un portaobjetos se fijó la suspensión para realizar las observaciones correspondientes con ayuda
del microscopio óptico. En esta ocasión el microscopio fue ajustado a modo de emplear el lente
objetivo a razón de 40x y lograr, junto los oculares (10x), un aumento total de 400x.

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Resultados:
Parte A

Sección del cuadro observada N° de células observadas


Superior izquierda 26
Superior derecha 33
Central 32
Inferior derecha 32
Inferior izquierda 23

Para el conteo de células se siguieron las normas estandarizadas:

1. Las células que tocan o reposan en las líneas divisorias superior y lateral derecho no se
cuentan; las que toca o reposan en las líneas divisorias inferior y lateral izquierdo sí se
cuentan.
2. Las células brotadas se cuentan como una, si el tamaño del brote no supera el 50% del
tamaño correspondiente a la célula madre, si este valor es superado se cuentan como dos.
3. Para un recuento preciso, se recomienda contar no menos de 75 células en el mm2 y no
más de 48 células en uno los 25 cuadrados.
4. Si la muestra original fue diluida no olvidarse de corregir el resultado final por el factor de
dilución.

Cálculo:
𝑁° 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝒄𝒆𝒍𝒖𝒍𝒂𝒔
= 146 ∗ 10 ∗ 10000 ∗ 5 = 𝟕𝟑𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎𝟎
𝑚𝑙 𝒎𝒍

Observaciones
Parte A Parte B

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Conclusión/es
Los objetivos propuestos fueron alcanzados parcialmente. En primera instancia lograron asimilarse
las técnicas para el conteo de células de una muestra empleando la cámara de Neubauer y el
microscopio óptico como instrumentos para la tarea de la parte A. Se logró apreciar la facilidad que
trae utilizar dicha cámara gracias a su diseño preciso y practico, junto con la sencillez de la técnica
para visualizar con ella las células de una muestra en secciones perfectamente determinadas en
cuanto a sus dimensiones.

Ahora bien, para la parte B del práctico, si bien lograron visualizarse células de levadura ligeramente
teñidas, no se procedió al conteo de las mismas debido a que las mismas eran provenientes de una
muestra de levadura diferente de la utilizada de la parte A. Para la muestra de la parte A se utilizó
una suspensión de levadura fresca mientras que en la parte B se utilizaron levaduras “viejas”. No
obstante, la utilización de estas dos suspensiones de levaduras de diferentes características,
permitió asegurar la asimilación de las diferencias existentes entre las dos técnicas vistas para esta
experiencia.

Bibliografía
 http://www.fmed.uba.ar/depto/microbiologia/catedra2/sem101.pdf