Determinación de un protocolo para la desinfección de

semillas de Nicotiana tabacum

Giuliette B. Meza1, Pedro J. Yépez2
1 Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura,
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE
2 Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura,
Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE

Palabras clave: Desinfección, Hipoclorito de Sodio, Nicotiana tabacum.

Fecha de presentación: 24/05/2018

RESUMEN

Una característica crítica del cultivo de tejidos es que se debe realizar en

condiciones asépticas, por ello el explante destinado para la proliferación de la
planta debe de someterse a un adecuado protocolo de desinfección para evitar
la contaminación endógena y completar el cultivo. Se realizó una búsqueda
bibliográfica de métodos de desinfección para semillas de Nicotiana tabacum
de los cuales se eligió uno y variando uno de sus componentes se realizó un
diseño experimental para determinar el mejor tratamiento.

INTRODUCCIÓN

La humanidad se ha beneficiado de las plantas durante siglos, obteniendo de

ellas fuentes de alimentación, materia prima para la industria y la construcción
y medicina. Las plantas tienen la capacidad de producir metabolitos
secundarios que las protegen ante bacterias, virus, hongos, insectos y otros
herbívoros (Thaiz & Zeiger, 2006). Muchos de estos metabolitos secundarios
resultan de gran interés para la humanidad ya que satisfacen las necesidades
ya mencionadas. Por esto surge la necesidad de optimizar la forma de cultivo
de especies de interés. El cultivo in vitro permite la producción en masa de
plantas además de permitir la manipulación genética para obtener plantas
transformadas con características específicas de interés (Paliwal, 2001).

En el cultivo in vitro el explante se cultiva bajo condiciones asépticas en un

medio con los nutrientes y fitoreguladores necesarios. Para lograr la asepsia se
debe seguir un protocolo de desinfección al explante que elimine los
organismos que puedan afectar al cultivo, varios compuestos se han
recomendado y usado extensamente entre ellos el hipoclorito de sodio (2-5%) y
calcio (6-12%), también el etanol (70%). También se usan detergentes (Tween
20) para romper la tensión superficial y permitir que el explante tenga mejor
contacto con la solución desinfectante (Abdelnour & Escalant, 1994).
PROTOCOLO

I. Selección de la especie
1. Se eligió una especie de interés, de acuerdo a investigación
bibliográfica.
2. Se describió la importancia de esta planta.
3. Se seleccionó el explante para el trabajo in vitro.
II. Investigación de agentes desinfectantes
1. Se realizó la búsqueda bibliográfica de métodos de desinfección para el
explante de la especie seleccionada.
2. Se seleccionaron cuatro métodos diferentes de desinfección
3. Se eligió uno de los métodos para llevar a cabo un diseño experimental.
III. Diseño experimental
1. Se escogieron dos elementos del proceso de desinfección para variar y
escoger el mejor.
2. Se dibujó una tabla describiendo los tratamientos.
IV. Recolección de datos
1. Se diseñó una tabla con datos para las variables de respuesta:
Contaminación y Oxidación.
2. Se llenó la tabla con datos generados aleatoriamente en Excel.
V. Análisis de datos
1. Se realizó la transformación de los datos a dicotómicos
2. Se realizó el análisis descriptivo
3. Se realizó el análisis inferencial
a. Verificación de normalidad
b. Aplicación de pruebas de hipótesis

RESULTADOS

I. Selección de la especie

Se seleccionó la especie Nicotiana tabacum que pertenece a la familia

Solanaceae, es una planta anual, erguida, de 1 a 3 m de altura. Sus hojas son
grandes y más largas que anchas, tienen un color verde pálido y con pelos.
Sus flores son tubulosas como pequeñas trompetas blancas, rosa o rojas. Con
frutos en forma de cápsulas, de color café, sus semillas son esféricas,
numerosas y pequeñas (Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana,
2009).
 Figura 1. Nicotiana tabacum L. (Holland, 2018)

El cultivo del tabaco tiene un gran importancia en el desarrollo agrícola porque

se adapta a terrenos pobres y con escasez de agua (Valderrama, Granoble,
Valencia, & Sánchez, 2007). Los extractos de hojas de Nicotiana tabacum han
demostrado actividad antiviral inhibiendo la síntesis del Herpes simplex 1
(Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009).

II. Investigación de agentes desinfectantes

Se eligieron 4 protocolos de desinfección para semillas de Nicotiana tabacum

encontrados en investigaciones donde se hacía germinar a las mismas. Se
escogió la semilla como explante porque es la más descrita en bibliografía. Los
protocolos se describen en la tabla a continuación.

Tabla 1. Protocolos de desinfección de semillas de Nicotiana tabacum

Cita Paso1 Paso2 Paso3 Paso4

(Mastretta, y otros, Etanol Enjuague con HOCl- Enjuague con agua
2009) 70% por agua Millipore 42% pro Millipore por 10
30s por 30s 35 min min (tres veces)
(Chaleff & Parsons, Cloro Dodecilsulfato Enjuague -
1978) comercial de Sodio con agua
(Clorox) 0.1% por 5 estéril
(10%) por min
10 min
(Gill & Saxena, Etanol Hipoclorito de Enjuague -
1993) 70% por 3 Sodio 1.5% con agua
min por 20 min estéril
 (cinco
veces)
(Schmitt, Oakeley, & Hipoclorito Lavado con - -
Jost, 1997) de Sodio agua estéril
1.4% por
5 min

III. Diseño experimental

Se eligió el protocolo de Gill y Saxena (1993) y para el diseño experimental se

varió la concentración del Hipoclorito de sodio y el tiempo se exposición del
explante al mismo. Los diferentes tratamientos se describen a continuación:
Tabla 2. Variaciones del tratamiento de desinfección

Tratamiento %Hipoclorito Tiempo (min)

de
desinfección
1 1 10
2 1.5 20
3 2 10
4 1 20
5 1.5 10
6 2 20

IV. Recolección y análisis de datos

 Contaminación
o Análisis descriptivo

Los datos obtenidos fueron la base para generar datos dicotómicos, se le

asignó el valor de 0 si el cultivo no presenta contaminación y 1 al que presenta
cualquier porcentaje de contaminación.
Tabla 3. Resumen estadístico de los datos de contaminación

Mínimo Q1 Mediana Media Q3 Máximo SD

0 0 55 47,38 80,5 99 37,17

Siendo la media 47,38 y la mediana 55 se observa que los datos de

contaminación presentan una asimetría negativa o hacia la izquierda por la
cantidad de muestras contaminadas. El tener una desviación estándar de 37,17
nos indica que los datos están dispersos respecto a la media y que tenemos
una gran cantidad de variación en el grupo de estudio.

La frecuencia de contaminación en cada tratamiento se puede observar en la

figura 2

Figura 2. Contaminación según tipo de tratamiento

En base a la figura dos el mejor tratamiento sería el TD1 por tener menor
porcentaje en contaminación.

Figura 3. Histograma de contaminados para cada tratamiento

En la figura 3 podemos observar que el tratamiento con un menor porcentaje
de contaminación es el primero (1% de NaClO, 10 min) teniendo un 50 % de
contaminación. Los tratamientos dos (1.5% de NaClO, 20 min) y seis (2% de
NaClO, 20 min) presentan un alto porcentaje de contaminación del 80%.

Las pruebas de hipótesis nos ayudarán a verificar si el tratamiento que tiene un

menor porcentaje de contaminación es significativamente el mejor para evitar la
contaminación.

o Análisis inferencial

Realizamos las gráficas de densidad de los datos (figura 4) para determinar si

los datos se ajustan a una distribución normal.

Figura 4. Función de densidad para los datos de contaminación

La función de densidad de los datos de contaminación presenta dos picos y por

lo tanto esta no se ajusta a una distribución normal. La gráfica de los residuales
contra los valores ajustados del modelo lineal (figura 5) nos ayuda a
comprobar esta afirmación.

Figura 5. Gráfica de residuales vs valores ajustados para contaminación

Si los datos siguen una distribución normal estos se ajustan a la recta
graficada. Nuestros datos no siguen esta tendencia rectilínea por lo que se
puede afirmar que no siguen una distribución normal y se tienen que aplicar
pruebas no paramétricas.

Realizamos la prueba de Shapiro para comprobar la normalidad y se obtuvo un

p valor =3,7x10-6 menor que el nivel de significancia establecido de α=0.05 por
lo cual se afirma que los datos no siguen una distribución normal y debemos
aplicar pruebas no paramétricas.

Pruebas de hipótesis

Con la prueba de Kruskal-Wallis determinamos si existen diferencias

significativas en los tratamientos e identificar cuál es el mejor tratamiento para
reducir la contaminación.

Las hipótesis son:

𝐻0 : µ1 = µ2 = µ3 = µ4 = µ5 = µ6

𝐻1 : 𝐴𝑙 𝑚𝑒𝑛𝑜𝑠 𝑢𝑛𝑎 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑒𝑠 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒

Con un ∝= 0,1

Tabla 3. Resultados de la prueba de Kruskal-Wallis para contaminación

Valor crítico (χ2) Grados de libertad Valor-p

6,46 5 0,26

Según la tabla 3 el valor_p = 0,26 siendo mayor al nivel de significancia por lo

que no existe información estadística suficiente para rechazar la hipótesis nula.

 Oxidación
o Análisis descriptivo

Los datos obtenidos fueron la base para generar datos dicotómicos, se le

asignó el valor de 0 si el cultivo no presenta oxidación y 1 al que presenta
cualquier porcentaje de oxidación.
Tabla 4. Resumen estadístico de los datos de oxidación

Mínimo Q1 Mediana Media Q3 Máximo SD

0 0 33,5 34,02 56,75 96 29,27

Siendo la media 34,02 y la mediana 33,5 se observa que los datos de

contaminación presentan una asimetría positiva o hacia la derecha por la
cantidad de muestras oxidadas. La desviación estándar de 29,27 nos indica
que los datos están ampliamente dispersos respecto a la media.

Figura 6. Histograma de oxidación para cada tratamiento

En la figura 6 podemos observar que el tratamiento con un menor porcentaje

de oxidación es el primero (1% de NaClO, 10 min) teniendo un 50 % de
oxidación. El tratamiento tres (2% de NaClO, 10 min) presenta el mayor
porcentaje de oxidación, del 100%.

Las pruebas de hipótesis nos ayudarán a verificar si el tratamiento que tiene un

menor porcentaje de contaminación es significativamente el mejor para evitar la
oxidación.

Análisis inferencial

Realizamos las gráficas de densidad de los datos (figura 7) para determinar si

los datos se ajustan a una distribución normal.

Figura 7. Función de densidad para los datos de oxidación

La función de densidad de los datos de oxidación presenta dos picos y por lo
tanto ésta no se ajusta a una distribución normal. La gráfica de los residuales
contra los valores ajustados del modelo lineal (figura 8) nos ayuda a
comprobar esta afirmación.

Figura 8. Gráfica de residuales vs valores ajustados para oxidación

Si los datos siguen una distribución normal estos se ajustan a la recta

graficada. Nuestros datos no siguen esta tendencia rectilínea por lo que se
puede afirmar que no siguen una distribución normal y se tienen que aplicar
pruebas no paramétricas.

Realizamos la prueba de Shapiro para comprobar la normalidad y se obtuvo un

p_valor =2,4x10-4 menor que el nivel de significancia establecido de α=0.05
por por lo cual se afirma que los datos no siguen una distribución normal y
debemos aplicar pruebas no paramétricas.

Pruebas de hipótesis

Con la prueba de Kruskal-Wallis determinamos si existen diferencias

significativas en los tratamientos e identificar cuál es el mejor tratamiento para
reducir la oxidación.

Las hipótesis son:

𝐻0 : µ1 = µ2 = µ3 = µ4 = µ5 = µ6

𝐻1 : 𝐴𝑙 𝑚𝑒𝑛𝑜𝑠 𝑢𝑛𝑎 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑒𝑠 𝑑𝑖𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒

Con un ∝= 0,1
 Tabla 5. Resultados de la prueba de Kruskal-Wallis para contaminación

Valor crítico (χ2) Grados de libertad Valor-p

7,78 5 0,16

Según la tabla 5 el p_valor = 0,16 siendo mayor al nivel de significancia

determinamos que no existe información estadística suficiente para rechazar la
hipótesis nula.

DISCUSIÓN

BIBLIOGRAFÍA

(s.f.).

Abdelnour, A., & Escalant, J. (1994). Conceptos básicos del cultivo de tejidos vegetales. CATIE.

Biblioteca Digital de la Medicina Tradicional Mexicana. (2009). Biblioteca Digital de la Medicina

Tradicional Mexicana. Recuperado el 22 de Mayo de 2018, de
http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/monografia.php?l=3&t=Tabaco&id=7765

Chaleff, R., & Parsons, M. (1978). Direct selection in vitro for herbicide-resistant mutants of Nicatiana
tabacum. Genetics , 5104-5107.

Gill, R., & Saxena, P. (1993). Somatic embryogenesis Nicotiana tabacum L.: induction by thidiazuron of
direct embryo differentiation from cultured feal discs. Plant Cell Reports , 154-159.

Holland, D. (2018). Missouri Botanical Garden. Recuperado el 22 de Mayo de 2018, de

http://www.tropicos.org/Image/83423

Mastretta, C., Taghavi, S. T., Van der Lelie, D., Mengoni, A., Galardi, F., Gonelli, C., y otros. (2009).
Endophytic bacteria from seeds of Nicotiana tabacumcan reduce cadmium phytotoxicity. International
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Paliwal, R. (2001). El Maíz en los trópicos: mejoramiento y producción. Organización de las Naciones
Unidas para la Agricultura y la Alimentación.

Schmitt, F., Oakeley, E., & Jost, J. P. (1997). Antibiotics Induce Genome-wide Hypermethylation in
Cultured Nicotiana tabacum Plants. The Journal of Biological Chemestry , 1534-1540.

Thaiz, L., & Zeiger, E. (2006). Fisiología Vegetal. Ediciones de la Universidad Jaume I.

Valderrama, K., Granoble, J., Valencia, E., & Sánchez, M. (2007). Nesidiocoris tenuis (Hemiptera:
Miridae) depredador en el cultivo de tabaco (Nicotiana tabacum). Revista Colombiana de Entomología ,
141-145.