Introducción

El francés Felix D’Herelle en 1918 definió el término bacteriófago para referirse a un microbio invisible
antagonista de los bacilos de la disentería, los cuales más tarde se definirían como virus que infectan
bacterias. Los bacteriófagos sin la forma de vida más abundante en la Tierra, diez veces más que las
bacterias. Estos pueden encontrarse en todos los ambientes donde las bacterias crecen, desde los
desiertos, los mares, e incluso las aguas frías del Ártico. Los bacteriófagos son los responsables del 10 al
80% de la mortalidad de todas las bacterias en los ecosistemas acuáticos y son un importante factor
limitante para las poblaciones bacterianas [1].

Los bacteriófagos son los virus más estudiados y han contribuido enormemente al desarrollo de la Biología
Molecular. Con las tecnologías recombinantes emergentes como la tecnología de presentación sobre
fagos filamentosos (TPFF) se desarrollan nuevas oportunidades para el desarrollo de péptidos y
anticuerpos con fines terapéuticos.

Phage display technology

La tecnología TFPP fue desarrollada por Smith in 1985, ha atraído mucha atención debido a su poder y
simplicidad. Las principales herramientas son los fagos filamentosos (f1, fd, M13), estos son muy estables
a una variedad de condiciones que emplean generalmente para la selección de ligandos como pH extremo,
altas temperaturas, presencia de DNasa, enzimas proteolíticas, entre otras. Estas y otras características
hacen de los fagos filamentosos una herramienta extremadamente poderosa para la bioingeniería, por
ejemplo: desarrollo de nuevas dianas terapéuticas, vacunas, diseño de moléculas, entrega de
medicamentos dirigidos o biosensores.

Sistema TFPP

Los bacteriófagos filamentosos de E. coli son los más usados en la presentación de fagos. La mayoría de
los anticuerpos y péptidos se muestran en las proteínas del fago p III y p VIII. La principal proteína de la
cubierta (p VIII) es un producto de la expresión del gen 8 y se presenta en casi 3000 copias, por lo tanto
se utiliza para mejorar la señal de detección cuando el fago muestra anticuerpos asociados con el antígeno.
Más modificaciones de p VIII se hacen para aumentar la eficiencia de la presentación. En comparación, la
proteína de la cubierta menor (p III) consiste en 406 residuos de aminoácidos y se produce en la punta del
fago en 3 a 5 copias. La gran mayoría de péptidos y proteínas plegadas se muestran como fusiones con
la proteína p III, en lugar de p VIII, para preservar su funcionalidad, generalmente se acoplan con péptidos
de cisteína cortos (6-7 residuos). La pérdida de la funcionalidad de la proteína de la cubierta fue la limitación
principal de la tecnología de presentación en fagos, sin embargo, este problema fue superado por los fagos
híbridos y las modificaciones de la proteína de cubierta [2].

La tecnología TFPP consiste en viriones de genoma de tipo silvestre completo y una copia del gen de
fusión que podría aparecer como inserto en el genoma del fago o como fagémido. Un fagémido es un
vector que contiene los orígenes de la replicación del fago y su hospedador, el gen III u VIII con sitios de
clonación apropiados y un antibiótico (resistencia genética). Además, la fusión del fagémido que codifica
el polipéptido p III requiere un híbrido con el fago auxiliar para el empaquetamiento en la partícula M13. El
fago auxiliar contiene un origen de replicación ligeramente defectuoso (como M13KO7 o VCSM13) y
suministra todas las proteínas estructurales necesarias para generar un virión completo. Por lo tanto, tanto
la proteína p III salvaje como la proteína de fusión polipéptido-p III estarán presentes en la superficie del
fago [3].
 Figura 1 Esquema de un Vector fagémido [3]

La relación de proteína de fusión polipéptido-pIII a pIII de tipo salvaje puede oscilar entre 1 a 9 y 1 a 1000
dependiendo del tipo de fagémido, las condiciones de crecimiento, la naturaleza del polipéptido fusionado
a pIII y la escisión proteolítica de las fusiones de anticuerpo-pIII. Esta relación asegura que la proteína de
fusión, como un componente menor del recubrimiento del fago, no afecta la viabilidad del fago. Sin
embargo, debe tenerse en cuenta que cuando se utiliza hiperfago, no es necesario alcanzar esta
relación.El hiperfago tiene un fenotipo pIII de tipo salvaje, pero debido a la falta del gen pIII funcional, la
fusión de pIII y anticuerpo es la única fuente de pIII para el ensamblaje del fago [3].

Biopannig

Es el procedimiento de selección de ligantes específicos, es esencial para enriquecer el nivel de molécula

deseada. El método de biopanning se basa en ciclos repetidos de incubación, lavado, amplificación y re-
selección del fago unido. La molécula diana se inmoviliza en soporte sólido como pocillos de placa de
microtitulación, membrana de PVDF, matriz de columna o inmunotubos, perlas magnéticas e incluso en
células completas. Las diversas rondas de ciclo de selección son necesarias para lograr la actividad de
unión deseada de anticuerpo monoclonal. Para determinar esta actividad se utilizan varias pruebas, por
ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). El tipo de soporte sólido, el tiempo de la
unión y el lavado, así como la concentración de antígeno han afectado el nivel de selección. Un diseño
apropiado del procedimiento de biopanning permite la selección de anticuerpos para epítopes únicos se
muestra a continuación [4]:
Figura 2 Representación esquemática de un proceso biopanning
Referencias

[1] Vispo, N. S., Camacho, F., Antúnez, M. P., Toledo, R., & Ramos, O. S. (2016). Display
technology on filamentous phage in the search for anti-infective biological
agents. Bionatura, 1(1), 23-30.

[2] Bazan, J., Całkosiński, I., & Gamian, A. (2012). Phage display—A powerful technique for
immunotherapy: 1. Introduction and potential of therapeutic applications. Human vaccines
& immunotherapeutics, 8(12), 1817-1828.

[3] Qi, H., Lu, H., Qiu, H. J., Petrenko, V., & Liu, A. (2012). Phagemid vectors for phage
display: properties, characteristics and construction. Journal of molecular biology, 417(3),
129-143.

[4] Garet, E., Cabado, A. G., Vieites, J. M., & González-Fernández, Á. (2010). Rapid isolation
of single-chain antibodies by phage display technology directed against one of the most
potent marine toxins: Palytoxin. Toxicon, 55(8), 1519-1526.