INSTRUCTIVO

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LA TEMPERATURASOBRE LA VELOCIDAD
DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA

1. OBJETIVOS
1.1 Demostrar el efecto o influencia del pH sobre la velocidad de reacción de la
amilasa.
1.2 Demostrar el efecto o influencia de la temperatura sobre la velocidad de
reacción de la amilasa.

2. INTRODUCCION

Las enzimas, en general, al actuar como biocatalizadores, aceleran reacciones químicas

específicas, experimentando cambios físicos durante ellas, pero recuperando su estado
original cuando la reacción química ha terminado. Sin embargo dada la naturaleza
proteica de la molécula enzimática, diferentes factores físicos y químicos pueden
modificar la actividad de una enzima, siendo lo más importante la temperatura y el pH.
Las enzimas transforman rápidamente los sustratos a temperaturas y a valores de pH
óptimos característicos para cada una respectivamente.

Respecto al pH, las enzimas requieren, para actuar con máxima eficiencia, una
determinada concentración de iones hidrogeno en el medio, por tanto, cada enzima tiene
un pH óptimo de acción. El efecto del pH se explica por la acción de la concentración
de protones en la disociación de distintos grupos del sustrato y en especial de la enzima,
que participan tanto en la unión enzima-sustrato y en el mecanismo catalítico mismo,
como en el mantenimiento de la determinada conformación de la enzima. A valores de
pH por encima o por debajo del pH optimo, disminuye la actividad enzimática por lo
que, generalmente se describe una curva en forma de campana.

Respecto a la temperatura, al igual que el pH, existe un rango, algunas veces muy
pequeño, donde es máxima la actividad enzimática, que está determinado por la
magnitud de las variaciones de la velocidad inicial en función de la temperatura del
medio, lo que significa que la velocidad inicial de reacción aumentará con la
temperatura hasta que se haga prácticamente imposible de medir debido a una
activación. La mayoría de las enzimas son completamente inactivadas por encima de los
70 °C.

La temperatura óptima de reacción enzimática es el resultado de un balance entre el

incremento en la actividad y la velocidad de destrucción de la enzima. La temperatura
óptima no es un valor constante para una enzima dada, sino que depende del tiempo
durante el cual se hace la medición de la actividad. Mientras más corto sea el tiempo de
medición, más alta será la temperatura óptima.

Las moléculas deben poseer cierta energía de activación para que puedan reaccionar y
las enzimas actúan disminuyendo la energía de activación, permitiendo que la reacción
avance rápidamente. Se puede determinar fácilmente el efecto de la temperatura,
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exponiendo la enzima a diferentes temperaturas y se mide la cantidad de actividad

residual.

Para estudiar el efecto de estos factores sobre una reacción enzimática, se debe trabajar
en condiciones de operación bien determinadas. Los otros paramentos o factores, deben
permanecer constante respecto al factor determinante. Para ello se trabajará como
sustrato almidón y se determinara las variaciones del almidón según procedimiento de
identificación y cuantificación de sustrato residual, utilizando solución iodada.

3. MATERIAL METODOS
3.1 Material Biológico :
Amilasa

3.2 Materiales:
Pipetas
Tubos de ensayos
Baño maría
Cocina eléctrica
Balanza

3.3 reactivos
Solución buffer acetato.
Solución buffer fosfato.
Solución buffer carbonato.
Solución de almidón al 1%.
Solución de enzima al 1%.
Solución NaCl 0.1M
HCl 0.05 M
Solución Iodada
Sol. Cúprico alcalino

4. PROCEDIMIENTO:

4.1. OBTENCION DE ENZIMA AMILASA

 En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30 mL
 Mezclar a la misma proporción con buffer fosfato
 Con una gasa o algodón proceder a filtrar la mezcla
 El filtrado corresponde a la enzima
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4.2. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA

AMILASA SALIVAL.
A. Sistema de Incubación:
SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
1 2 3
Soluc. Almidón 1% 1.0 1.0 1.0
Buffer pH 2.5 3.0 - -
Buffer pH 6.8 - 3.0 -
Buffer pH 9.0 - - 3.0
Soluc. de NaCl 0.1N 0.5 0.5 0.5
Mezclar y Pre-Incubar a 37 °C por 5 minutos.
Soluc. Amilasa 0.5 % 0.5 0.5 0.5
Mezclar y Pre-Incubar a 37 °C por 15 minutos.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada sistema, prepara y

seguir con el siguiente sistema.

B. Valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual:

SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
Blanco 1 2 3
Soluc. HCl 0.5N 4.0 4.0 4.0 4.0
Agua destilada 0.5 - - -
De los tubo 1-3 parte A - 0.5 0.5 0.5
Solucion Iodada 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de manera

cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o bien de manera
cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el fotocolorímetro con filtro
verde, o bien en espectrofotómetro a 660 nm).
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4.3. EFECTO DE la TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION

DE LA AMILASA SALIVAL.
A. Sistema de Incubación:
SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
1 2 3
Soluc. NaCl 0.2N 0.5 0.5 0.5
Soluc. Amilasa salival. 0.5 0.5 0.5
Mezclar y colocar los tubo por 2 minutos en:
Baño de agua helada SI - -
Baño maría a 37 °C - SI -
Baño maría 65 °C - - SI
Soluc. Almidón 1%. 1.0 1.0 1.0
Incubar por 15 minutos a las mismas temperaturas.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada sistema, prepara y

seguir con el siguiente sistema.

B. Valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual:

SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
Blanco 1 Blanco 2 1 2 3
Soluc. HCl 0.5N 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Agua destilada 0.5 - - - -
Soluc. Almidón 1% - 0.5 - - -
De los tubo 1-3 parte A - - 0.5 0.5 0.5
Solucion Iodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de manera

cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o bien de manera
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cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el fotocolorímetro con filtro

verde, o bien en espectrofotómetro a 660 nm).

5. RESULTADOS:

5.1. Cuadro N°01: pH

INDICADOR T1 T2 T3
pH 4 pH 7 pH8

Color resultante Amarillo Amarillo Amarillo

Presencia de sustrato No No No
residual (Almidón)

Actividad amilásica Si Si Si

5.2. Cuadro N°02: Temperatura °C

INDICADOR T1 T2 T3
0°C 37°C 100°C

Color resultante Amarillo - azulado Amarillo Azulado

Presencia de almidón Si No Si
residual

Actividad amilásica No Si No
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6. DISCUSIONES:

En la primera experimentación que realizamos con la influencia del pH al medio en

actividad enzimática de la α-amilasa hubo un gran error. Ya sea por los resultados
que nos dio en la coloración de los tubos que eran los tres de color amarillenta, lo
cual no podría darse en una experimentación correcta. Lo correcto que se hubiera
presentado que el pH en extremos (es decir, muy ácidos o muy básicos) la enzima
no funcionaria, o al menos disminuyera notablemente su actividad. Ente los pH 6 y
7 tendría que aparecer el efecto acromático para su dilución óptima. Sin embargo,
a un pH 4 (más ácido), no se encontraría cambios (es decir, no hubo efecto
acromático). Igualmente con un pH 12 (más básico) no hubiera un efecto
acromático. Por lo que los tubos de los pH extremos se hubieran teñido de color
azul y el único tubo que se hubiera teñido de amarillo sería el de pH neutro.

En la segunda experimentación que realizamos con la influencia de la temperatura

al medio en actividad enzimática de la α-amilasa se dio resultados positivos a lo
esperado. Ya sea por la teoría que explica que la estructura proteica es la que
determina la actividad enzimática, cualquier causa que perturbe esta estructura
puede llevar a una pérdida de actividad en este caso la temperatura. Aunque el
rango general de temperaturas adecuadas para las reacciones enzimáticas es muy
estrecho, los cambios ligeros suelen tener una considerable influencia. En la
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experimentación las temperaturas 0° C y a 100° C, al momento de poner la

solución yodada se presentaron cambios de color en los tubos de la gradilla, es
decir que el color azul apareció en estos tubos. Por lo tanto, se podría decir que la
amilasa no actuó. En cambio, a temperatura ambiente se presentaron cambios al
momento de poner la solución yodada, es decir que el color amarillo se presentó en
este tubo. Esto era de esperarse, ya que cada enzima tiene un rango de
temperatura óptima y, en el caso de la amilasa, al encontrarse ésta en el cuerpo
humano (que siempre tiene una temperatura de 37° C), se supone que a
temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero sí disminuirla, ya que los
choques intermoleculares van a ser menores dándose el efecto acromático.

7. CONCLUSIONES

 Se logró demostrar que la temperatura es un factor influyente en cuanto a la

velocidad de reacción de la amilasa.
 No se logró demostrar que el pH es un factor influyente para determinar la
velocidad de la amilasa. Por lo que existió un error al momento de realizar
la experimentación.

8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Propiedades generales de las enzimas. [En línea]. Recuperado el 12 de

setiembre del 2014, de http://www.monografias.com/trabajos-
pdf900/actividad-enzimatica-amilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf
 Actividad enzimática de la amilasa. [En línea]. Recuperado el 11 de setiembre
del 2014, desde
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/
schmidth02/parte02/02.html
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CUESTIONARIO:

1. Explique qué ocurre en cada uno de los sistemas de incubación preparados,

tanto en efecto del pH como de la temperatura.
2. Grafique el efecto del pH y la temperatura sobre la velocidad de reacción de
la amilasa salival y otras enzimas.
3. Investigue los pH y las temperaturas óptimas de otras enzimas importantes.
4. Defina que es estabilidad enzimática y explique la pH estabilidad y
termoestabilidad de una enzima.
5. Defina el punto isoeléctrico (pI) de una enzima (proteína).
6. Describa un procedimiento para demostrar (pI) de una enzima. Ejemplo
amilasa salival.
SOLUCION DEL CUESTIONARIO
SOLUCIÓN CUESTIONARIO:

1. A valores de pH por encima o por debajo del pH optimo, disminuye la

actividad enzimática por lo que, generalmente se describe una curva en
forma de campana.

La velocidad inicial de reacción de la enzima aumentará con la

temperatura hasta que se haga prácticamente imposible de medir
debido a una activación. La mayoría de las enzimas son completamente
inactivadas por encima de los 70 °C.
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2.

Efecto de pH

Efecto de
Temperatura

3.

Enzima Rango óptimo de Rango óptimo de Función

temperatura PH
Fitasa 30 - 52°C 4.4 - 5.5 Baja el PH del mash.
Ninguna otra utilidad
Beta Glucanasa 37 - 45°C 4.5 - 5.0 -

Peptidasa 45 - 57°C 4.6 - 5.2 Produce Nitrógeno libre

de Aminoácidos

Proteasa 45 - 57°C 4.6 - 5.2 Rompe grandes

proteínas que producen
turbiedad
Beta Amylasa 54 - 66°C 5.0 - 5.6 Produce azúcares
altamente fermentables
Alpha Amylasa 68 - 75°C 5.3 - 5.8 Azúcares menos
fermentables
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4.
- La estabilidad enzimática es la medida en que una enzima mantiene su
actividad o conformación estructural cuando es sometida al
almacenamiento, aislamiento y purificación o varias otras
manipulaciones físicas o químicas incluyendo enzimas proteolíticas y
calor.
- El pH es una medida del grado de acidez o alcalinidad de una
sustancia; el grado de acidez o alcalinidad afecta la estabilidad de
algunas sustancias, en particular, sustancias orgánicas
- Las enzimas son proteínas que frecuentemente son inactivadas
cuando son expuestas a temperaturas demasiado altas

5. El Punto Isoeléctrico está definido como el pH en el cual las cargas

positivas igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un
campo eléctrico. Las funcionalidades de las proteínas se ven afectadas
cuando se aproximan al pI, debido a la atracción electroestática de los
grupos con carga opuesta. Las enzimas son activadas en una zona muy
restringida de pH, y presenta un punto óptimo de pH donde su actividad
es mayor.

6. . Un fenómeno físico importante es que cuando una molécula está en su

punto isoeléctrico tiende a precipitarse, el cual representa un principio
importante de separación de proteínas. Si se quiere determinar con
exactitud el pI de una proteína se usa frecuentemente isoelectroenfoque,
en el cual se usa un gradiente de pH creado por anfolinas. Sin embargo,
esta técnica resulta costosa y es casi de uso exclusivo para los
laboratorios de investigación. Por otro lado, si se conoce la secuencia de
una proteína existen programas que permiten conocer el punto
isoeléctrico, tales como el EditSeq de DNA star.
Ya que una proteína precipita en su punto isoeléctrico, en esta práctica
determinaremos el punto isoeléctrico aproximado de la caseína
(proteína mayoritaria en la leche) al colocarlos en soluciones con
diferentes valores de pH.