ANALISIS QUÍMICO II Ingeniería Biotecnológica 37

UNIDAD # 3

ESPECTROFOTOMETRIA DEL VISIBLE

FUNDAMENTO
Los métodos colorimétricos y espectrofotométricos probablemente son lo más importantes
del análisis cuantitativo y también los que se emplean más a menudo. Se basan en la
absorción de luz visible o de otro tipo de energía radiante por una solución, la cantidad de
energía radiante absorbida es proporcional a la concentración del material en la solución
que realiza la absorción de tal manera que midiendo la absorción de la luz o de otro tipo
de energía radiante es posible determinar cuantitativamente la cantidad de sustancias
absorbentes presentes.
La espectroscopia de absorción molecular se basa en la medida de la transmitancia T o de
la absorbancia A de disoluciones que se encuentran en cubetas transparentes que tienen
un camino óptico de b cm. Normalmente, la concentración “c” de un analito absorbente está
relacionada linealmente con la absorbancia.

NOMENCLATURA
Durante el desarrollo de la espectroscopia de absorción ha surgido alguna confusión en la
terminología de tal forma que para un concepto o una propiedad existen diferentes
nombres en las obras de los distintos autores. Recientemente se ha hecho un considerable
esfuerzo por la American Society for Testing Materials (ASTM) para crear una nomenclatura
uniforme, los términos y símbolos que se señalan están basados en estas
recomendaciones.

ESPECTRO VISIBLE
Región que corresponde a la zona coloreada que comprende radiaciones de luz entre 400-
750 nm de longitud de onda ó 4 000 - 7500 ángstrom, es la región más pequeña del
espectro electromagnético.
La sensación de color es una respuesta a una serie de estímulos físicos, químicos y
biológicos del ciertas partes de la retina del ojo para la energía radiante de las determinadas
longitudes de onda, los colores del espectro son visibles simples, o sea que no se
descomponen en otros colores, la luz blanca es la superposición de las radiaciones del
espectro visible. La luz blanca contiene radiación de todas las longitudes de onda de la
región visible, la luz blanca es una mezcla compleja de fotones de energías diferentes. Es
posible seleccionar la luz de una sola longitud de onda (radiación monocromática) a partir
de la luz blanca (por ejemplo, con un prisma), si la luz blanca se priva de uno de sus colores
(generalmente, por absorción), la luz blanca resultante aparecerá como el complemento de
ese color, es decir, si de la luz blanca se separa la luz azul (450 a 480 nm), la radiación
resultante será amarilla.

Los colores del espectro visible son:

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ESPECTRO VISIBLE

U.V.- VIOLETA - AZUL - VERDE - AMARILLO - ANARANJADO - ROJO - I.R.

400 450 480 560 590 625 750 nm

DONDE: UN MILIMICRÓN mµ ES IGUAL A UN NANÓMETRO

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METODOS COLORIMETRICOS Y ESPECTROFOTOMETRICOS

Son de mayor uso o importancia del análisis cuantitativo, se fundamentan en la absorción
de la luz y de otro tipo de energía radiante, midiendo la cantidad de energía absorbida se
determina la concentración de las sustancias absorbentes.

1.- El análisis colorimétrico o colorimetría, es la determinación cuantitativa de una

sustancia colorida basándose en su capacidad de absorber la luz de una determinada
longitud de onda, se tiene dos tipos:

a. La colorimetría visual, que se basa en la comparación de una solución colorida

de concentración desconocida con otras soluciones del mismo color pero de
concentraciones conocidas (utiliza como detector al ojo humano).
b. La colorimetría fotométrica, mide la relación entre el haz luminoso saliente y el
incidente mediante detectores de tipo de fotoceldas, se denomina métodos
fotométricos y el instrumento fotómetro opera solamente en la región visible.

2.- Los métodos espectrofotométricos, miden esta relación a una determinada longitud de
onda, el instrumento se llama Espectrofotómetro opera en la región del visible, ultravioleta o
infrarrojo.

Los métodos espectrofotométricos no se limitan al uso de la luz visible, sino que también
incluye a aquellos que emplean energía radiante de otras regiones del espectro
electromagnético, como el ultravioleta o el infrarrojo. Se ha desarrollado métodos de
análisis colorimétricos y espectrofotométricos para la mayoría de elementos y compuestos
orgánicos de muchas clases. Los métodos que se basan en la absorción de la luz sirven
perfectamente para determinar constituyentes de las muestras desde cantidades mínimas
hasta cantidades de 1 % aproximadamente, pero no se usan con tanta frecuencia para
analizar cantidades mayores (macrocantidades) de sustancias. Por ejemplo: es mejor
determinar un analito usando métodos de valoración cuando su concentración es elevada.
La determinación colorimétrica de la muestra implica aplicar las diluciones necesarias para
que la concentración del analito se reduzca al intervalo en el cual se aplica los métodos
colorimétricos.
En espectrofotometría hay dos formas principales de analizar, una de ellas es empleando el
color natural de un ión o compuesto. Las sustancias muy coloridas como el permanganato,
el bicromato, y las tinturas orgánicas se determinan con facilidad. La otra forma es utilizando
la radiación ultravioleta e infrarroja para la determinación espectrofotométrica de sustancias
(especialmente de sustancias orgánicas), que no presentan color en la región visible (y por
consiguiente no absorben la luz visible) pero si absorben fuertemente en las regiones
espectrales del infrarrojo o del ultravioleta.
Los iones o moléculas que tienen poco o ningún color natural pueden determinarse
espectrofotométricamente después de hacerlas reaccionar con un reactivo apropiado que
las convierta en producto muy colorido.
Con respecto a la región visible la solución tendrá un color que corresponde a las longitudes
de onda que la solución no absorbe, es decir el color que observamos es el color
complementario del color de la luz que absorbe. Por ejemplo, una solución absorbe la luz
azul del espectro a 475 nm el color visible de la solución es el color amarillo que es el color
complementario del azul.

COLORES DE LA REGION VISIBLE

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Long. de Onda nm Color que se absorbe Color complemento que se observa
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----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
400 - 435 Violeta Verde amarillo

435 - 480 Azul amarillo

480 - 490 Azul verde rojo naranja

490 – 500 Verde azuloso rojo

500 - 560 Verde rojo púrpura

560 - 580 Amarillo verdoso violeta

580 – 595 amarillo azul

595 - 650 naranja azul verdoso

650 - 750 rojo azul verde

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Métodos de trabajo En Espectrofotometría

El método de operar en colorimetría o Espectrofotometría se basan en que una muestra desconocida
se compara con muestras conocidas o patrones que actúan como soluciones de referencia
estándares, pero difieren en el modo de hacer esta comparación. El método de mayor uso es el que
corresponde al de las series patrones.

Método de las series patrones

Se prepara una serie de soluciones estándares o patrones del constituyente que se
analiza; la concentración siguiente en una cantidad adecuada, se desarrolla el color en la
muestra desconocida del mismo modo que en las soluciones patrón y la desconocida se
compara con los patrones. Esta comparación se hace por uno de los dos métodos
siguientes:

A) Comparación Directa
Se mide las soluciones patrón y la muestra desconocida mediante la observación de
estas soluciones y se determina la solución patrón que es semejante a la
desconocida; ésta, por tanto, contiene la misma cantidad del constituyente que se
desea determinar que el patrón que se asemeja. Debido a que el método esta
basado en el criterio subjetivo del operador, los errores personales pueden llegar a
ser considerables.

B) Comparación Indirecta
En este método el “color” se mide como porcentaje de transmitancia o absorbancia
en un aparato usando algún tipo de detector (fototransformador) en lugar del ojo.
Cada serie de patrones se mide en tandas, y las lecturas, o alguna función con ella
relacionada, se representa en función de la concentración obteniéndose así una
curva de calibrado. El problema preparado en la misma forma que los patrones, se
mide también y la lectura del instrumento se convierte en concentración con auxilio
de la curva de calibración o por métodos analíticos de cálculo.

El método está exento de los errores personales de comparación visual de color. Es posible
obtener una exactitud del orden del 0.5 % de error relativo. El método, por tanto, se puede
comparar favorablemente con los mejores métodos gravimétricos y volumétricos de análisis
y es incluso superior a esos métodos para la determinación de pequeñas cantidades del
constituyente deseado.
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PASOS DE UN ANALISIS ESPECTROFOTOMETRICO

Las etapas a seguir en el análisis son:

1. Formación de especies coloreadas

Para medir en la región del visible la absorbancia de una especie absorbente es indispensable que la
solución problema presente color, este color puede ser propio del ion o sustancia. Pero algunos iones
presentan un color no muy definido o débil, otros no presentan coloración, entonces es necesario
agregarle un reactivo cromóforo de tal manera que al reaccionar formen un complejo colorante que
será el responsable de la absorción de la radiación. El reactivo agente formador de color debe tener
las siguientes exigencias:

a) El reactivo que forma color debe presentar cierta selectividad o especificidad para el
constituyente que se analiza. Las sustancias extrañas no deberían impedir la reacción de
formación del color, ni dar otros productos coloreados. Estos interferentes deben ser eliminados
mediante un cambio de condiciones, tales como pH, temperatura, disolventes, si esto no
sucede, se debe proceder a enmascarar o separar el elemento interferente.

b) El color que forma debe ser estable para que permita realizar repeticiones de las mediciones

c) La formación del color deberá ser rápida. Cuando se forma la especie coloreada se debe
estudiar y tener en cuenta los siguientes factores:

* El efecto de exceso de reactivo, si la reacción formadora de color es prácticamente

completa cuando están presentes cantidades estequiométricas a los reactivos, la adición de
más cantidad de reactivo dará lugar a pequeños incrementos de la absorbancia si es que la
hace aumentar algo.

* Efecto del tiempo algunas reacciones de formación de color son más rápidas, otras son
muy lentas, además algunas especies coloreadas experimentan “desvanecimientos “debidos
a la descomposición por la luz y/o por el calor o por reposo. Lo ideal es que la reacción de
formación de color sea rápida, y que las especies coloreadas sean estables en el tiempo, de
modo que no sea necesario realizar el análisis en un tiempo prefijado, y que permita
realizar mediciones repetidas.

* Efecto de temperatura, se requieren a veces temperaturas elevadas para acelerar la

formación del producto coloreado; pero puede también aumentar la velocidad de
decoloración. El control de la temperatura puede ser necesario no solo para el desarrollo del
color, sino también durante la medida de la absorbancia, esto es muy importante cuando se
utilizan disolventes orgánicos que tienen un elevado coeficiente de dilatación.

 Efecto del pH debería existir un amplio margen de pH en el cual la absorbancia no

variase. Cuando el control de pH es muy crítico, se deben utilizar soluciones adecuadas de
gran capacidad reguladora; o bien, se ajusta el pH de la solución al valor deseado mediante
un pHmetro.

2. Selección de la longitud de onda analítica

Cada especie coloreada presenta una curva de absorción o espectral característica en una
determinación espectrofotométrica, deberá obtenerse siempre una curva de absorción de las especies
absorbentes para seleccionar en ellas la longitud de onda apropiada que permite realizar la medición
cuantitativa.

Para encontrar la curva de absorción se irradia a la solución coloreada con energía radiante de una
gama de longitudes de onda de tal manera que a cada longitud de onda se mide su valor de
absorbancia o porcentaje de Transmitancia, esta energía absorbida se traduce en un espectro de
absorción que es obtenido en función de los valores Absorbancia o porcentaje de Transmitancia frente
a las longitudes de onda, en la curva se ubica el máximo pico que corresponde a un máximo de
absorbancia el cual corresponde a una longitud de onda determinada, esta longitud de onda a la cual
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la especie coloreada absorbe con mayor intensidad la energía radiante, se llama longitud de onda
máxima, óptima, analítica o de trabajo.

En la selección de la longitud de onda de trabajo que ha de usarse para una determinación

cuantitativa dada, tienen importancia los siguientes factores:
 La radiación habrá que restringirse, en la medida de lo posible, a una banda
de longitudes de onda que sean absorbidas por el componente deseado.
 La longitud de onda escogida ha de ser una a la cual la absortividad permita
llegar a un compromiso entre la sensibilidad y el intervalo de concentración de la
sustancia deseada.
 La longitud de onda ha de ser una en la cual un ligero desplazamiento en la
longitud de onda no cause cambio apreciable en la absortividad molar.
 La longitud de onda escogida habrá de ser idealmente una a la cual el
componente desconocido es el único componente de la muestra de análisis que
absorbe radiación. Esta condición no se logra a menudo, pero es necesario acercarse
a ella lo más posible.
 Operar con la longitud de onda de trabajo el método adquiere mayor
sensibilidad y mayor precisión y exactitud.

Una aplicación directa de estos factores a la selección de la longitud de onda que ha de

usarse en un procedimiento cuantitativo requiere obtener espectros de absorción del
componente deseado y de otras sustancias que potencialmente pudieran interferir en su
determinación. En ocasiones es posible hacer esta selección de la longitud de onda
empíricamente, en particular cuando se usan instrumentos de filtro. Al ojo humano, una
solución aparece del color que la solución transmite, el cual a su vez es complementario
del color que es absorbido por la solución.
Así, el color del filtro ha de ser el complementario del color aparente de la solución, como
en el siguiente cuadro:

Color de la solución Color del filtro

Púrpura Verde

Anaranjado a rojo Azul a verde azulado

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Amarillo Azul

Violeta a rojo Púrpura

Azul Rojo

Las variables comunes que influyen en el espectro de absorción de una sustancia incluyen
el tipo de disolvente, el pH de la solución, la temperatura, concentración elevada de
electrólitos y la presencia de sustancias que interfieren, se deben conocer los efectos de
estas variables así como las condiciones que se han seleccionado para el análisis, de modo
que la absorbancia del analito no sea afectada materialmente por variaciones incontroladas,
de pequeña magnitud.

3.-Conformidad con la Ley de Beer

El paso siguiente consiste en calibrar el método que se propone, este debe ajustarse a las
leyes fotométricas, específicamente a la ley de Beer. Después de determinar la longitud de
onda a la cual deben de realizarse las medidas, se calibra el método (Lo que incluye el
instrumento que se ha de utilizar)

El método de trabajo consiste:

 En preparar una serie de soluciones estándar o patrones y midiendo de cada una

de ellas su absorbancia a la longitud de onda de trabajo. En algunos casos se debe
ajustar las condiciones para que se desarrolle el color en la forma adecuada y
agregando luego el reactivo formador de color, diluyendo luego con el disolvente al
enrase a un volumen determinado.
 cada solución se mide a la longitud de onda de trabajo, las medidas de
transmitancia o absorbancia se realizan comúnmente ajustando la escala de medida
del instrumento a 100% de transmitancia (absorbancia cero) cuando el haz
luminoso pasa a través de un blanco, que debe ser idéntico a la muestra en todo,
excepto en que no debe contener el constituyente que se ha de determinar. El
blanco deberá contener los reactivos, aditivos, disolvente, etc. en la misma
naturaleza y concentración que las utilizadas en cada muestra desconocida en la
que se desarrolle color; de esta manera, las lecturas de las muestras están
corregidas automáticamente para cualquier absorción pequeña por acción de los
reactivos y del disolvente.
 Con los datos de Absorbancia frente a la concentraciones se gráfica en un sistema
cartesiano y debe obtenerse una curva que corresponde a una línea recta con
pendiente positiva o con pendiente negativa si se gráfica porcentaje de
Transmitancia frente a las concentraciones. Si la gráfica es una línea recta se dice
que el componente activo y el método cumple la Ley de Beer. Esta curva se llama
"Curva de Calibración" y cumple dos funciones fundamentales:

 Verificar la Ley de Beer que relaciona las absorbancias y las concentraciones, es decir,
la cantidad de energía que absorben son función lineal de las concentraciones.
 Permite encontrar las concentraciones de la muestra problema mediante el método
llamado gráfico
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Las concentraciones de los Estándares de acuerdo al error fotométrico no deben ser ni muy
diluidas ni muy concentradas, estas deben tener valores entre 20 - 60% Transmitancia.

4. Análisis de la muestra
La muestra problema tiene un tratamiento conocido de:
 Pesada de la muestra,
 disolución
 separación de interferentes,
 formación de la especie coloreada bajo las mismas condiciones de los estándares.
El reactivo formador de color debería ser específico o muy selectivo para el analito.
Las sustancias extrañas no deberían impedir la reacción de formación del color, ni
dar otro análogo (espectro de absorción).
 Para obtener la solución problema final esta debe encontrarse a una concentración
apropiada, de tal manera que su valor este comprendido en el intervalo de las
soluciones patrones (aproximadamente debe presentar un 37 % de transmitancia).
 El problema consiste en lo que debe hacerse, en la práctica, cuando las soluciones
preparadas para la medida tienen una transmitancia fuera del intervalo de exactitud
máxima.
 Escogiendo un tamaño de muestra y un volumen de solución (por tanto, de
concentración), del trayecto óptico y de la absortividad, puede hacerse unas
variaciones de las condiciones, a fin de que se verifique la medida dentro de los
límites óptimos.
Los distintos métodos para obtener las condiciones de medida son los siguientes:

Si la solución preparada es demasiado diluida (transmitancia demasiada alta o baja

absorbancia):

1.- La solución puede medirse con una celda de un trayecto óptico mayor, por
ejemplo, 5 ó 10 cm. en vez de 1 cm.
2.- Puede utilizarse una muestra mayor, en el mismo volumen
3.- Puede disolverse una muestra del mismo tamaño pero en un volumen menor

Si la solución preparada es demasiado concentrada (transmitancia demasiado bajas o alta

absorbancia):

1.- Puede medirse con un trayecto óptico de menor recorrido

2.- Puede medirse la solución a una longitud de onda a la cual el soluto tenga menor
absortividad.
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5. Cálculo de Resultados
Para determinar la concentración del analito existen dos métodos:

a) Método gráfico
El instrumento sea fotocolorimetro o Espectrofotómetro arroja valores de Absorbancia o
porcentaje de transmitancia y se calcula la concentración de la muestra en la curva de
calibrado, a continuación se toma en cuenta las disoluciones efectuadas, el peso inicial de
la muestra para luego calcular la concentración del componente activo.

b) Método analítico
Se emplea la relación de la ley combinada de Beer

A=ax bxc donde: A= absorbancia

a = absortividad
b = trayecto óptico
c = concentración

Cálculo de la absortividad media

La relación matemática anterior permite ser empleada en el cálculo de la absortividad
específica o molar de cada solución patrón, operando en cada caso con su
concentración y su respectivo valor de absorbancia medido, teniendo en
consideración que el valor del trayecto óptico es constante.

a1 = A1 //b x c1 a2 = A2 / b x c2 a3 = A3 / b x c3

Calculada la absortividad de cada patrón se determina la absortividad media

a m = a1 + a2 + a3

 Cálculo de la concentración de la muestra

Para calcular la concentración de la muestra se emplea la misma ecuación de Beer,
pero tomando en cuenta la siguiente relación matemática:

AM DONDE : CM = CONCENTRACIÓN MUESTRA

CM = ---------- AM = ABSORBANCIA MUESTRA
b x am a m = ABSORTIVIDAD MEDIA

 Cálculo de la concentración para las diluciones

Se toma en cuenta las diluciones efectuadas como volumen inicial, volumen final y si
corresponde el volumen alícuota. Y finalmente se calcula la concentración del analito
relacionando el peso inicial de la muestra. El resultado del analito se expresa como
porcentaje, partes por millón, miligramos por ciento o según corresponda al tipo de
muestra o como se solicita entregar el resultado del análisis.

6. Evaluación del método

Usualmente se hace las mediciones repetidas de una muestra para poder determinar la
precisión y exactitud que presenta mediante un tratamiento estadístico adecuado.
Aplicación de la espectroscopia de absorción en la región visible
Las aplicaciones cualitativas de Espectrofotometría visible son limitadas porque el espectro
de la mayoría de los compuestos en solución consiste de uno o, cuando mucho, unos pocos
picos amplios sin estructura fina que podrían ser requeridos para su identificación precisa.
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En contraste, el método es uno de los más utilizados para el análisis cuantitativo de

sustancias inorgánicas, orgánicas y bioquímicos, presentando buena sensibilidad, límites de
detección de 10-4 a 10 -7 M, selectividad de moderada a elevada, exactitud y precisión
razonables y gran rapidez. Además, los métodos espectrofotométricos son fácilmente
automatizados. Existen sustancias coloreadas por naturaleza, que permiten la aplicación
directa de esta técnica sin necesidad de reacción química alguna, por ejemplo, iones
inorgánicos tales como el bicromato, permanganato, cúprico, férrico, etc. En compuestos
orgánicos también se presenta esta situación en compuestos coloreados, como son los
tintes. Sin embargo, la mayoría de los iones metálicos son incoloros y su determinación
requiere la presencia de un reactivo cromoforo o también llamado reactivo colorimétrico.