INFORME DE LABORATORIO

Ácidos Nucleicos

13 DE ABRIL DE 2018
BOTTINI WILCHEN IRINA, FUENTES JOSUÉ, TORRES OCTAVIO
Química Biológica
 Electroforesis en gel de agarosa
Introducción.

La electroforesis en gel es un método que se emplea para separar macromoléculas en

función de su carga eléctrica. La velocidad de migración electroforética depende de la
densidad de la carga de la molécula relación (carga/masa), de la Fuerza del campo, del Tamaño
y forma de las moléculas, de la Fuerza iónica y temperatura del buffer en que se desplazan.

Las separaciones electroforéticas se realizan generalmente sobre geles que sirven

como un tamiz molecular que permite la separación antes mencionada. La manera de emplear
este método es aportándole energía eléctrica al campo, colocando 2 electrodos en los
extremos opuestos de la cubeta. Por un lado, el extremo negativo (cátodo) hacia donde
migraran las moléculas cargadas positivamente, por otro lado, el extremo positivo (ánodo)
hacia donde migraran las moléculas cargadas negativamente.

Los geles de agarosa son utilizados para analizar muestras de ADN, porque permite la
resolución de fragmentos de 20pb hasta 20.000pb, esto se debe a la porosidad del gel, aunque
también se podrían utilizar geles con mayor poder de resolución que es el de poliacrilamida,
pero tiene menor rango de separación de bases.

Las moléculas de ADN, cargadas negativamente (esto lo sabemos gracias a que

conocemos su composición y la existencia de sus grupos fosfato), migrarán hacia el polo
opuesto de su carga (el polo positivo o ánodo). La relación carga/masa de las moléculas de
ADN es constante, dado que cada unidad monómera que se agrega aporta la misma carga y
masa, sin modificar la relación, por lo que la relación q/m es la misma para todas las
moléculas. Por lo tanto, la determinación del desplazamiento en el gel depende del tamaño
molecular del ácido nucleico.

La electroforesis en gel de Agarosa es un método normalizado que se utiliza para separar

e identificar fragmentos de ADN. Se trata de una técnica sencilla de realizar que permite
diferenciar ADN o ARN previamente fragmentado, ya que en general son demasiado grandes
para separarlos en una velocidad razonable. Para que la técnica sea exitosa hay que agregar
previamente un colorante en el gel que solo marque a la molécula y las bandas puedan ser
visibles. En general se utilizan colorantes intercalantes como Bromuro de Etidio o GelRed, pero
en este caso utilizaremos SYBR-Green que no es un agente intercalente sino que se inserta en el
surco menor del ADN, aumentando la fluorescencia unas 1000 veces más.

Objetivos.

Los objetivos de utilizar esta técnica son poder separar moléculas de ADN por su tamaño y
determinar los pares de bases, haciendo una recta patrón con fragmentos de DNA de peso
molecular conocido (curva de calibración).

Preparación de Materiales.

1. Preparación de gel de agarosa (1%)

a. Reactivos: Agarosa (1gr), Buffer TAE (40ml) y SYBR-Green (4 µl).

b. Preparación: Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa
seca en polvo en un tampón acuoso, en este caso el Buffer TAE
(determinación del pH), tras lo cual se hace hervir la mezcla, hasta que la

1
 agarosa se funde y se convierte en una solución transparente. Se deja
templar y se agrega el colorante SYBR-Green. A continuación, se vierte
esta solución en un molde para gel que deberá tener un peine
previamente colocado para formar los pocillos donde se sembrara las
muestras de ADN, se utiliza un bastidor plástico adecuado para preparar el
gel con las cantidades correspondiente a la cuba electroforética a utilizar,
el mismo debe tener los bordes sellados correctamente, estar limpio y
seco, y se deja enfriar a temperatura ambiente, hasta que se forma un gel
rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene
determinada por su concentración, entre mayor concentración de agarosa
mayor será su densidad.

2. Preparación de buffer de corrida.

a. Teniendo en cuenta el tamaño de la cuba electroforética, ya habiendo

preparado el gel de agarosa, procedemos a rellenar de buffer TAE la cuba.
Esta solución está compuesta por Trizma 242gr, EDTA 100ml*, Ácido
acético glacial 57.1ml y Agua MilliQ 500ml.

*Es un conocido agente quelante de cationes divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+.Dado que el
Mg2+ es un cofactor requerido por la mayoría de nucleasas, su secuestro por el EDTA evita la
degradación del DNA durante la preparación y la electroforesis.

3. Preparación de la muestra.

a. Reactivos: 1ml Buffer TAE 1X, 5 ml de Glicerol,15 mg Azul de bromofenol y

10 ml de Agua Milli Q c.s.p.

b. Preparación: Las muestras de ADN, antes de ser sembradas en el gel de

agarosa serán tratadas de la siguiente manera: 15µl de ADN + 3µl de buffer
de muestra empleando una micropipeta. Dentro de los componentes de
este buffer nos encontramos con el azul de bromofenol que representa el
frente de corrida de las muestras y el glicerol que le aporta densidad a la
muestra para que esta precipite en los pocillos y se mantenga en su
respectiva calle. Es necesario tener en cuenta que al ladder (patrón de
peso molecular) no es indispensable agregarle buffer, porque ya viene
preparado para utilizarse en la corrida y tiene la cantidad de buffer justa.

Desarrollo

1) Teniendo preparados los materiales lo primero que vamos a utilizar será nuestro gel
de agarosa el cual debemos retirarlo cuidadosamente del bastidor plástico, quitarle el
peine y colocarlo en la cubeta de electroforesis.
2) Añadir buffer de corrida a la unidad de electroforesis, de modo que el gel quede
cubierto por una capa de aproximadamente 2-5mm.
3) Una vez acomodado el gel en la cuba, lo primero que debemos hacer es sembrar el
patrón de peso molecular en la primera calle empleando una micropipeta, luego en

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 las siguientes calles sembramos el resto de las muestras de ADN, empleando el
mismo proceso. Recordamos que cada vez que cambiamos de muestra debemos
cambiar el tip de la micropipeta.
4) Luego de sembrar todas las calles, debemos cerrar la tapa de la cuba y conectar los
electrodos para que el ADN migre hacia el ánodo, conectando el cátodo, en el
extremo donde hicimos las siembras. Configuramos la fuente de alimentación para
que pueda hacer correr la muestra con una potencia de 80v y encendemos la
corriente.
5) Hacer la electroforesis hasta que el azul de bromofenol haya corrido la distancia
adecuada a través del gel (aproximadamente la mitad).
6) Desconectar la corriente, retirar los cables y la tapa de la cubeta. Introducir el gel en
el transiluminador UV para poder ver los resultados de corrida del gel, ya que
anteriormente lo único visible era el frente de corrida.
7) A partir de los resultados obtenidos, realizar una curva de calibración con los datos
del patrón muestra y calcular a partir de ella los pares de bases del resto de muestras.
Para hacer la curva de calibración debemos medir la distancia de migración del
Ladder, luego realizar un gráfico relacionando la distancia de migración de las bandas
conocidas en cm en función del logaritmo de los pesos moleculares conocidos.

Resultados.

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Curva de Calibración.

CALLE DISTANCIA DE MIGRACION LOGARITMO DE pb CANTIDAD DE BASES

2 9,05 cm 1,97 093
3 - - -
4 8,40 cm 2,10 126 pb
5 7,25 cm 2,33 214 pb
6 8,70 cm 2,00 100 pb
7 8,70 cm 2,00 100 pb

PATRON DE PESOS DISTANCIA DE CANTIDAD DE PARES LOGARITMO DE pb

MOLECULARES MIGRACION DE BASES
BANDA A 5,40 cm 500 pb 2,69
BANDA B 5,90 cm 400 pb 2,60
BANDA C 6,60 cm 300 pb 2,47
BANDA D 7,25 cm 200 pb 2,30
BANDA E 8,70 cm 100 pb 2,00

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Conclusión

Dentro del gel obtuvimos dos bandas que corrieron la misma distancia que la banda de 100
pares de bases del patrón de peso molecular, fueron las que se encontraban en la calle 6 y 7.
Podemos concluir que estas muestras de ADN posiblemente sean las mismas y tienen el mismo
peso molecular.
No fue posible obtener resultado de las calles 3 y 8 ya que no tienen visibilidad, esto pudo
haber ocurrido por variedad de razones, como por ejemplo que se haya pinchado el gel o que
se haya sembrado mal la muestra, entre otros.

La banda que representa la calle 5 fue la que menos corrió, lo que nos da a entender que es la
muestra con mayor cantidad de pares de bases.

En la calle 4 encontramos una muestra que corrió 8,4cmy que contiene 126 pares de bases;
datos que se pudieron obtener gracias a la curva de calibración

En la calle 2 nos encontramos con una muestra que migró 9,05cmque es un valor que
sobrepasa el valor mínimo de pares de bases que nos muestra nuestro Ladder, siendo la
muestra de menor tamaño.

Esta técnica nos permite clasificar cada muestra según su cantidad de pares de bases, y así
poder determinar su peso, su composición de base, su estructura, y también podemos
compararlas con un patrón de nuestro interés. Es un método fácil, sencillo y práctico, por el
cual es posible realizar varias determinaciones.

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 Determinación de las Curvas de Melting (Tm)
Introducción.

Cuando se calienta una muestra de ADN, la energía aumenta produciendo la debilitación de

los puentes de hidrogeno que mantienen unida la doble hélice de la molécula. Cuando la
energía es suficiente para romper los puentes de hidrógenos y así, separar la doble hélice se
trata de la desnaturalización del ADN. Un método utilizado para calcular la desnaturalización
del ADN se realiza midiendo la Absorbancia en función de la temperatura. En este sentido, la
absorbancia es producida porque los electrones absorben luz en determinadas ondas; en este
caso 260nm. A medida que la molécula de ADN se desnaturaliza los electrones deslocalizados
de las bases nitrogenadas interactúan en mayor proporción con los fotones de la luz en
consecuencia del aumento de la nube electrónica producida por la ruptura de los puentes de
hidrogeno y uniones de apilamiento de bases. Durante un rango bastante amplio de
temperatura no se modifica sustancialmente el nivel de absorbancia, pero a partir de cierta
temperatura, aumentándola un poco, la absorbancia se incrementa mucho indicando que la
molécula comenzó a desnaturalizarse, hasta que llega a un valor máximo cuando se completó
la desnaturalización. La temperatura en la cual la mitad del ADN se desnaturalizó se denomina
Temperatura de fusión o Temperatura de Melting (Tm), que depende de:

 pH
 Porcentaje de bases C≡G
 Concentración de Iones
 Presencia de agentes que desestabilizan la unión puentes de hidrogeno

En la práctica podemos determinar la Temperatura de Melting graficando una Curva de

Melting, que relaciona el aumento de la absorbancia en función de la temperatura.

Objetivos.

Determinar la Temperatura de Melting y realizar una Curva de Melting a partir de una muestra
de ADN desconocido en solución con 3 diferentes solventes.

Desarrollo.

Primero se coloca agua destilada en la cubeta. Utilizaremos una cubeta de cuarzo porque no
absorbe los fotones de luz entonces no modifica los resultados del experimento. Luego se
ajustará el espectrofotómetro en 260nm y con la cubeta de cuarzo ya preparada se seteara en
0.

La muestra de ADN se mezclará con 3 solventes diferentes en las siguientes concentraciones y

volúmenes:

 150µl ADN dil 1:7 + 240 µl H2O

 150µl ADN dil 1:7 + 240 µl UREA 3M
 150µl ADN dil 1:7 + NaCl (concentración y volumen desconocido)

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Se calentará en un termobloque una de las muestras de ADN hasta alcanzar una temperatura
de 65°C, luego se trasladará a la cubeta de cuarzo vacía y se introducirá en el
espectrofotómetro. El espectrofotómetro arrojara el dato de la absorbancia de la muestra
midiendo la luz incidente(I0) y la luz trasmitida (I); las cuales se relacionan de la siguiente
manera:

Transmitancia = I / I0

Absorbancia = -log ( T ) = -log ( I ⁄ I0 )

Este proceso se repetirá aumentando la temperatura en un intervalo de 5°C, hasta llegar a los
125°C. A la vez se repetirá en cada muestra con los mismos valores de temperatura.

Con los resultados obtenidos se realiza una Curva de Melting con cada muestra de ADN y a su
vez se determina la Temperatura de Fusión aproximada, teniendo en cuenta el aumento
abrupto de la curva toma un valor máximo (hebra completamente desnaturalizada) y un valor
mínimo (hebra comenzándose a desnaturalizar) en ese rango. Dividiendo estos valores
previamente sumados, se determina la Temperatura de Melting.

Resultados.

H2O
0.9

0.85
Absorbancia

0.8

0.75 H2O

0.7

0.65
105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125

Temperatura (°C)
Tomando como valor mínimo 110°C y como valor máximo 115°C realizamos el cálculo de la
Temperatura de Melting, (110 + 115) / 2 = 112,5°C.

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 UREA
0.85

0.8
Absorbancia

0.75

0.7 UREA

0.65

0.6
100 105 110 115 120 125

Temperatura (°C)
Eligiendo como rango de temperatura considerable para el estudio, al que va desde los 105°C a
los 110°C, se realizó el mismo cálculo y se obtuvo que la Temperatura de Melting correspondió
a 107,5°C.

NaCl
0.9

0.85
Absorbancia

0.8

0.75
NaCl

0.7

0.65
110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125

Temperatura (°C)

Para determinar la Temperatura de Melting correspondiente a la solución con NaCl se

consideraron los valores que van desde los 116°C a los 119°C, arrojando 117,5°C como el valor
de la temperatura de fusión de las moléculas.

8
 0.9

0.85

0.8
Absorbancia

0.75 UREA
NaCl

0.7 H2O

0.65

0.6
95 100 105 110 115 120 125

Temperatura (°C)

Se puede observar que la Temperatura de Melting de la muestra con NaCl es mayor a la que
contiene H20, y a su vez, esta es mayor a la solución con urea.

Conclusiones.

La diferencia de Temperaturas de Melting, se debe a los medios en que se encuentra la

muestra. La muestra con menor Punto de Fusión es la que contiene urea; esto se debe a que la
urea tiene facilidad para formar puentes de hidrógenos, y lo hará con las bases nitrogenadas
facilitando la desnaturalización de ADN. Por lo tanto, es de suponer que la Tm del ADN con
urea va a ser menor que Tm del ADN con H20 y se puede comprobar en el experimento; la
muestra con urea tiene una Tm igual a 107,5°C y la solución con H20 una Tm de 112.5°C

Luego observamos que la muestra que tiene agua tiene una menor Tm que la muestra con
Cloruro de Sodio; 112,5°C y 117,5°C respectivamente. Este resultado era el esperado, porque
el NaCl estabiliza los grupos fosfato del ADN. Los grupos fosfatos del ADN tienen una repulsión
que es producida por su carga eléctrica negativa, de este modo el NaCl se disuelve en el agua y
el Na+ se adhiere al fosfato eliminando la repulsión.