11.

RECUENTO DE GÉRMENES LIPOLÍTICOS

11.1. Primera Técnica: Método de la tributirina y de la mantequilla

11.1.1. La utilización del agra tributirina sólo sirve para poner en evidencia las
especies que hidrolizan los ácidos grasos de más bajo peso molecular pero no
las que actúan sobre las grasa comlejas. Por ello, se realiza un recuento sobre
agar tributirina para determinar las bacterias hidrolizantes y las colonias
correspondientes a estos microorganismos, se resiembran en un medio con
mantequilla. La fórmula del medio es la siguiente:

Peptona 5g

Extracto de levadura en polvo 3g

Tributirina (tributirato de glicerol) 10 g

Agar 15 g

Agua destilada 1 000 ml

El pH debe ser de aproximadamente 7,5. Esterilizar a 121ºC durante 20minutos

11.1.2. Los diferentes tipos de colonias que hidrolizan la tributirina se

resiembran sobre medio de Crossley. Al agar nutritivo; por ejemplo, el medio
base para la prueba de la hidrólisis de la tributirina, se el añade un 5% de
mantequilla que contenga 75 mg de Azul Victoria por cada 100 gramos, es
decir 3,5 mg por cada 100 ml de medio. Llevar a un abaño a 90ºC. Agitar hasta
la completa disolución. Filtrar. Esterilizar a 115ºC durante 10 minutos.
Emulsionar la mantequilla con Azul Victoria ene l medio por agitación manual,
o, preferiblemente utilizando un homogeneizador y a continuación distribuirlo en
placas de Petri. Dejar que solidifique. La superficie de la placa aparecerá
sembrada de pequeños puntos que son las colonias tributirina + .

Preparación del Azul Victoria

Azul Victoria 2a3g

Agua Corriente 200 ml

Hervir hasta su disolución. Añadir aproximadamente 1 ml de una solución de

sosa al 10% por gramo de colorante para que desaparezca el color. Esperar
hasta la precipitación del colorante. Filtrara. Aclarar el filtro ene le que ha
quedado el colorante con agua ligeramente amoniacal. Secar a 30ºC. el polvo
así obtenido es estable.

Las colonias lipolíticas aparecen de color azul después de la incubación de las

placas a 30ºC entre 3 y 7 días. Considerar para el recuento las placas que
contengan entre 6 y 60 colonias

Puede utilizarse también el agra T. B. A. (Trebucyn agar) preparado por Oxoid.

Depositar en las placas de Petri 1 ml de cada una de las diluciones (1/10,
1/100, 1/1000, 1/10 000). Verter en las placas 10 ml de medio. Una vez
solidificado, incubar las placas a 20/22ºC durante 5 días o a 30ºC de 3 a 7 días.
Contar las colonias rodeadas de una zona clara que tenga al menos 1 mm a
partir de su borde. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 48)

11.2. Segunda técnica: método del sulfato de cobre

11.2.1. Fórmula del medio

11.2.1.1. Medio base

Peptona de caseína 10 g

Extracto de levadura 5g

Glucosa 2g

Agar 25 a 25 g

Agua destilada 1 000 ml

Esterlizar 15 minutos a 120ºC.

11.2.1.2. Tampón fosfato

Fosfato monopotásico 6g

Fosfato dipotásico 16 g

Agua destilada 1 000 g

Esterilizar 15 minutos a 121ºC

11.2.1.3. Mantequilla

Esterilizar 30 minutos a 121ºC.

Mezclar, a partes igulaes, la base y el tampón fosfato. Añadir un 23% de

mantequilla , agitando fuertemente. Distribuir la mezcla en unas placas de Petri
colocadas sobre un bloque de hielo. Sembrar las distintas diluciones por
extensión en superficie. Incubar durante 3 dias a 30ºC. Recubrir el medio con
una solución saturada de sulfato de cobre (unos 20g de SO 4 Cu 5H2O por litro
de agua). Dejar 15 minutos. Retirar esta solución, aclarar la superficie del
medio y comprobar si en el agar han aparecido o no manchas azules que son
los precipitados de las sales de cobre de los ácidos grasos libres formados en
la lipolisis microbiana. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 50)

12. RECUENTO DE LA FLORA LÁCTICA

Se pueden estudiar específicamente cuatro grupos de bacterias lácticas:

1) Streptococcus lactis, cremoris y diacetylactis

2) Streptococcus thermophilus
3) Leuconostoc
4) Lactobacillus

12.1. Streptococcus lactis, cremoris, diacetylactis

El recuento de estos microorganismos se efectúa en medio M.17 con ácido

nalidíxico:

Medio base:

Peptona de caseína 2,50 g

Peptona de carne 2,50 g

Peptona papaínica de soja 5,00 g

Extracto de levadura 2,50 g

Extracto de carne 5,00 g

Glicerofosfato sódico 19,00 g

 Sulfato magnésico, 7H2O 0,25 g

Ácido ascórbico 0,50 g

Agar (según propiedades gelificantes) 9 a 18 g

Agua destilada 950 ml

Disolver los ingredientes en el agua a ebullición. Dejar enfriar a 50ºC. si es

necesario, ajustar el pH para que después de la esterilización sea de 7,1/7,2.
Repartir fracciones de 95 ml en frascos de 125 ml. Esterilizar a 121 + 1ºC
durante 20 minutos

Solución de lactosa

Lactosa 10 g

Agua 100 ml

Disolver la lactosa ene l agua. Esterilizar a 121 + 1ºC durante 20 minutos.

Medio completo:

Medio base fundido en un baño de agua hirviendo y enfriado a 48/50ºC: 95 ml

Solución de lactosa: 5 ml

Mezclar por agitación

El medio se convierte enselectivo mediante la adición de ácido nalidíxico (0,004

g por litro). Verter en placas Petri; realizar la siembra con la leche o sus
diluciones decimales. Incubar a 25ºC y observar el cultivo cada día.

Identificación y recuento de S. diacetylactis y de L. citrovorum.

Hay que considerar las siguientes características:

El cultivo de S. lactis y S. cremoris no se desarrolla si en el medio se

añade un 5 por 1 000 de lactato cálcico.

S. diacetylactis y L. citrovorum poseen en general una citratasa que al

cultivar los microorganismo en un medio con citrato cálcico, origina la
aparición de zonas claras alrededor de las colonias.
Pueden recomendarse dos fórmulas que son modificaciones a las propuestas
por GALESLOOT. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 51)

12.1.1. Agar- lactato-jugo de tomate.

Medio base

Agar jugo de tomate 15 g

Lactato cálcico hidratado 5g

Bacto agar Difco 9g

Agua destilada 1 000 ml

Disolver los ingredientes calentando la mezcla ene l autoclave durante 5

minutos a 121ºC. repartir alícuotas de 15 ml en tubos de 20 x 200. Esterilizar
en autoclave 15 minutos a 121ºC.

Citrato cálcico

Añadir 10 g de citrato cálcico a 100ml de agua destilada. Agitar hasta poner las
partículas en suspensión y distribuir en tubos de 16 x 160, a razón de 10 ml por
tubo. Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC. para obtener una suspensión
más homogénea, se puede disolver el citrato cálcico en una solución de
carboximetilcelulosa al 1,5% en agua destilada.

Medio final

Agitar bien y añadir 1 ml de la suspensión de citrato cálcico a 15 ml del medio

base fundido previamente en baño de agua hirviendo. Agitar hasta conseguís
una mezcla homogénea y verter en placas de Petri. (Beerens, H; Luquet, F.
1990, pág 51)

Medio de NICKELS y LEESMENT (1964)

Medio base

Triptona 2,5 g
 Glucosa 5g

Lactosa 5g

ClNa 4g

Citrato trisódico 2H2O 2g

Lactato cálcico 5H2O 8g

Bacto agar Difco 15 g

Agua destilada 1 000 ml

pH antes de la esterilización = 6,7

una vez disueltos los ingredientes (a ebullición o en autoclave 5 minutos a

120ºC), repartir fracciones de 100 ml en frascos de 250 ml. Esterilizar en el
autoclave 15 minutos a 120 ºC.

Citrato cálcico

suspender 10 g de citrato cálcico cristalizado en 100 ml de una solución de

carboximetilcelulosa al 1,5 % en agua destilada a 50ºC. mezclar en el
homogeneizador, distribuir en tubos o frascos y esterilizar en autoclave 15
minutos a 120ºC

Suero de leche

Añadir un cultivo de estreptococos lácticos a la leceh desnatada para su

coagulación. Recoger el suero y esterilizarlo por filtración (en ampolla
Chamberland o membrana filtrante). Distribuir asépticamente entubos o
frascos.

Medio final

Fundir en un bañño de agua hirviendo 100 ml del medio base y enfriar a 50ºC;
añadir entonces 1 ml de suero de leche y 0,5 ml de la suspensión de citrato
cálcico. Llenar las placas de Petri.

Una vez solidificado el medio, secar la superficie y extender sobre ella de forma
homogénea en una de las placas 0,1 ml de la muestra no diluida y en las otras,
0,1 ml de sus diluciones decimales. Incubar a 25ºC. controlar el cultivo cada
día. Las colonias de S. diacetylactis y de L. citrovorum aparecen rodeadas de
una neta zona clara después de 2 a 4 dias de incubación. (Beerens, H; Luquet,
F. 1990, pág 52)

12.2. Streptococcus thermophilus

Proceder como en el apartado anterio (medo M.17 preferentemente) pero

incubando a 45ºC con el fin de eliminar los demás estreptococos lácticos.

12.3. Leuconostoc

Medio hipersacarosado con azida sódica

Medio base

Triptona 10 g

Extracto de levadura 5g

Sacarosa 100 g

Citrato sódico 1g

Glucosa 5g

Gelatina 2,5 g

Bacto agar Difco 15 g

Agua destilada 1 00 ml

Disolver los ingredientes excepto la glucosa y el agar en 800 ml de agua

destilada caliente. Añadir los 200 ml de agua destilada restantes y el agar.
Calentar en el autoclave 5 minutos a 120ºC. a continuación añadir la glucosa.
Cuando se haya disuelto, repartir el medio en frascos de 200 ml, poniendo 100
ml en cada uno. Esterilizar en el autoclave 15 minutos a 120ºC

Azida sódica

Azida sódica 1g

Agua destilada 100 ml

Distribuir en tubos de 16 x 160, a razón de 10 ml por tubo. Esterilizar en
autoclave 15 minutos a 120ºC

Medio final

En el momento del empleo, fundir el medio base en un baño de agua hirviendo

y por cada 100 ml, añadir 0,75 ml de la solución de azida. La concentración
final debe ser de 0,75 por 1000. Mezclar bien. Repartir en placas petri.

Después de la solidificaion y el secado de la supericie de las placas, distribuir

sobre ellas de forma homogénea, 0,1 ml de leche y 0,1 ml de las diferentes
diluciones decimales. Incubar a 25 ºC. examinar los cultivos cada día.

Este medio es de granutilidad para la detección de todas las especies de

Leuconostoc; L. mesenteroides y L. dextranicum dan colonias mucosas
(dextranos) y L. citrovorum pequeñas colonias no mucosas. (Beerens, H;
Luquet, F. 1990, pág 53)

12.4. Lactobacillus

Se utiliza el medio M. R.S. (DE MAN. ROGOSA, SHARPE):

Proteosa-peptona nº3 10 g

Extracto de carne 10 g

Extracto de levadura 5g

Glucosa 20 g

Tween 80 1g

Citrato amónico 2g

Acetato sódico, 3H2O 5g

Sulfato magnésico, 7H2O 0,1 g

Sulfato de manganese, 4H2O 0,05 g

Fosfato dipotásico 2g
Disolver calentando suavemente. Ajustar el pH con ácido acético paraqué
después de la esterilización sea 5,4. Añadir 12 g de agar. Fundor a ebullición.
Distribuir en frascos de 125 ml a razón de 100 ml por frasco. Esterilizar en
autoclave a 121ºC durante 20 minutos.

Poner en las placas de Petri 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en

trptona-sal. Verter encima el agar previamente fundido y enfriado a 45/46ºC.
mexclar. Dejar que solidifique. Incubar a 37ºC durante 72 horas en una jarra de
anaerobiosis. Contar las colonias. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 54)

13. RECUENTO DE BACTERIOFAGOS

13.1. Prueba de la acidificación (test de ANDEERSON y MEANWELL)

Sembrar un tubo de leche con una cepa de Streptococcus thermophilus e

incubarlo a 301C de 15 a 18 horas.

Sembrar 1 ml de este cultivo en un atraz que contenga 100ml de leche estéril.

Prepara 4 tubos esteriles con 10 ml de la leceh sembrada:

Añadir a 2 de los tubos 1 ml de solución de Ringer (testigos)

Añadir a los otros 2 tubos 1 ml de la muestra a examinar diluida a 1/100

en solución de Ringer.

Después de haber mezclado bien el contenido de los tubos, colocarlos todos al

mismo tiempo en un abaño termostatizador a 30ºC. tras 6 horas de incubación,
sacar los tubos y valorar su acidez con sosa N/9; si la cidez en los tubos que
contienen la muestra es inferior en más de un 10% a la desarrollada en los
tubos testigo, se puede sospechar la presencia de fagos. (Beerens, H; Luquet,
F. 1990, pág 54)

13.2. Detección y recuento de fagos en medio leche-resazurina

Sembrar un tubo de leche con una cepa de Streptococcus thermophilus e

incubarlo a 30ºC de 15 a 18 horas.
Preparar una solución de resazurina, bien disolviendo 1 pastilla de 2,5 mg de
resazurina en 50 ml de agua estéril, o bien disolviendo 0,005 g de resazurina
en 100 de agua estéril.

La solución se debe conservar al abrigo de la luz y en la cámara fría.

Añadir 10 ml de la solución de resazurina a 100 ml de leche. Esterilizar los

frascos. Sembrar con 1ml del cultivo de Streptococcus tjermophilus. Mezclar.

Centrifugar la muestra a analizar a 4 500 rpm durante 20 minutos. Del

sobrenadante, prepara diluciones decimales en solución de Ringer hasta 10-8
en tubos de 16 x 160. En tubos del mismo tamaño, tomar 1 ml de cada una de
estas diluciones y preparar además otro con 1 ml de solución de Ringer para
que sirva de testigo. En todos los tubos así preparados, incluido el testigo,
añadir 9 ml de leche + resazurina. Agitar, incubar a 30 ºC en un baño de agua.
Seguir la evolución de los diferentes tubos en comparación al testigo. Observar
si hay o no reducción del indicador, y en caso afirmativo, si tras la reducción
hay una recoloracion. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 54)

13.3. Recuento en medio sólido

Llenar dos placas con agar de recuento y secarlas en la estufa a 37ºC. prepara
un cultivo de Streptococcus thermophilus en un caldo de la misma composición
que el medio. Incubar a 30ºC de 15 a 18 horas.

Sembrar las placas añadiendo en su superficie 1 ml del cultivo. Eliminar el

exceso de inóculo. Secar las placas invertidas y abiertas en la estufa a 30ºC
durante 30 minutos. Dividir la superficie e cuatro partes. A partir de la muestra
centrifugada, preparar las diluciones decimales en solución de Ringer estéril
(de 10-1 a 10-8). Con una pipeta graduada, depositar 0,05 ml de cada una de
las diluciones, comenzando por la mas diluida, sobre cada una de las porciones
de las placas con agar. Secar las placas como se ha indicado anteriormente.

Incubar las placas invertidas a 30ºC de 15 a 18 horas.

Contar las zonas de lisis en las partes de las placas en las que se encuentren
más aisladas. Calcular el número de fagos en 1 ml. (Beerens, H; Luquet, F.
1990, pág 55)

14. DETECCIÓN DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Este análisis se puede realizar de dos formas: por examen microscópico

directo, o por cultivo.

14.1. Detección de los bacilos ácido-alcohol-resistentes presentes en la

leche por examen microscópico directo

14.1.1. Obtención del precipitado

Centrifugar 40 ml de leche a 2 500 rpm durante 20 minutos. Se obtienen tres

capas superpuestas: una de grasa, una capa de lactosuero y un precipitado.
Decantar para obtener sólo el residuo sólido. Preparar dos frotis con este
precipitado, tomando con el asa de siembra una pequeña cantidad y
extendiéndola sobre un porta-objetos previamente desengrasado, de forma que
cubra una superficie rectangular de 1x 2 cm.

Para el aislamiento a partir del precipitado obtenido en la centrifugación, se

procede también como se acaba de indicar. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág
55)

14.1.2. Coloración de Ziehl modificada por Tan Thiam Hok

Reactivos – el colorante: fuchina fenicada

-fuchina básica para bacteriología 10 g

-acido fénico 50 g
-alcohol de 90º 100 g
-agua destilada 1 000 ml

La presencia de un agente humectante no tiene ninguna utilidad

Modo de preparación: verter en un mortero de 2 l los 100 g de alcohol. Disolver

el colorante poco a poco y a continuación añadir el ácido fénico en pequeñas
cantidades y triturar bien. Trasvasar la mezcla a un frasco de vidrio oscuro.
Aclarar varias veces el mortero con el agua destilada, hasta utilizar un volumen
total de 1 litro, que se añadirá a la solución en el frasco. Dejar en reposo en la
estufa a 37ºC durante24 horas. Filtrar a través de un papel. Las indicaciones
sobre el modo de preparación deben ser estrictamente respetadas y son
válidas para todos los colorantes de este tipo. (Beerens, H; Luquet, F. 1990,
pág 56)

El decolorante

Azul de metileno 10 g

Alcohol absoluto 300 ml

Ácido sulfúrico de 60 ºB 200 ml

Agua destilada 500 ml

Preparación del decolorante: disolver 10 g de azul de metileno en 300ml de

alcohol absoluto (en el mortero). Por otra parte, preparar la mezcla de SO4H2
puro en 500 ml de agua destilada. Enfriar en agua. Guardar al abrigo de la luz.
Todos los productos utilizados para la preparación de los colorantes y
decolorantes deben ser puros.

Coloración:

Los colorantes y decolorantes se distribuyen en tubos de Borrell provistos de

un prisma de vidrio llamado “porta-cuchillo” que sirve para separar los portas (3
portas por tubo). Los portas se colocan con la cara al exterior hacia al
concavidad del tubo par evitar cualquier rozamiento.

Estos tubos se colocan en dos pisos sobre un soporte especial de madera:

Una hilera inferior para la fuchina,

Una hilera superior para el decolorante.

Un tubo puede servir para teñir unos 100 portas (es decir, de tres en tres, unas
treinta veces) sin necesidad de cambiar el líquido. Así, un soporte clásico de
dos pisos con 7 departamentos permite la coloración de 650 a 700 portas. A
veces hace falta añadir un poco de colorante para mantener el nivel constante.
Antes de poner los portas a teñir, limpiar los tubos y los prismas con agua de
lejía, aclarar abundantemente con agua corriente y secar.

Introducir los portas en la fuchina fenicada. La permanencia en el baño debe

ser durante 24 horas. Los portas se retiran con una pinza de Debrand y se
aclaran con un chorro de agua fría teniendo cuidado de no despegar la
extensión.

A continuación, se sumergen las preparaciones en el decolorante durante 5

minutos y se aclara de nuevo. Dejar secaral aire libre sobre un soporte, sin
utilizar papel secante para absorber el agua.

Una preparación correctamente teñida, debe presentar un color azulado

uniforme, ligero y translúcido. No debe haber zonas opacas, depósitos de
colorante, ni zonas rojas mal decoloradas.

Lectura: técnica: la búsqueda eficaz del bacio de Koch en el microscopio,

requiere mucho tiempo. Utilizar preferentemente un objetivo de inmersión de
100 y oculares de 10 de campo ancho.

Depositar una gota de aceite de cedro en el ángulo superior derecho del frotis.
La varilla de vidrio que se utiliza para ello, no debe contactar con la superficie
teñida porque podría arrastrar una parte que quedaría ene l aceite y sería
causa de error en análisis posteriores.

La exploración metódica de la extensión se hará recorriendo de arriba abajo

toda la superficie de la porta. La lectura de una muestra muy poblada de
bacilos requiere un tiempo de unos minutos para poder apreciar la densidad en
diferentes puntos.

Si aparentemente no se encuentran bacilos, no se puede concluir la

negatividad del análisis sin haber examinado la extensión durante una media
hora. A partir de este tiempo, que se considera óptimo, no merece la pena
continuar la búsqueda.

Este examen fatiga la atención del observador, por lo que no conviene

permanecer durante mucho tiempo ene l microscopio.
Con este método, solo los bacilos ácido-resistentes aparecen en rojo sobre el
fondo azul del frotis.

No hay que confundirlos con algunos restos que conservan parcialmente la

fuchina. Son más refringentes o están coloreados en una tonalidad naranja.
Aunque sean de tamaño variable, las mycobacterias tienen unos caracteres
morfológicos que permiten diferenciarlas de otros microorganismos.

Se presentan en forma de bastoncitos delgados, generalmente curvos. Su

longitud varía desde una milésima de milímetro para los muy cortos hasta cinco
milésimas de milímetro para los muy largos. En su interior contiene
granulaciones. El color que da el colorante Ziehl es rojo intenso. Se presentan
aisladamente o en agregados. La interpretación de la naturaleza de estos
acúmulos resulta difícil; es conveniente buscar también en su periferia bacilos
aislados de morfología característica. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 57)

14.2. Detección de mycobacterias en leche por cultivo

14.2.1. Fraccionamiento de la leche

Añadir a 125 ml de leche 12 ml de laurilsulfato al 20%. Adicionar unas gotas de

hidróxido sódico al 40% para mantener un pH alcalino. Agitar durante 30
minutos en un agitador de Kahn. Añadir 125 ml de agua destilada estéril.
Centrifugar una media hora a 300 rpm. Retirar la nata y el lactosuero
sobrenadante. Aclarar repetidamente con agua estéril para eliminar por
completo la grasa.

El precipitado de caseína, muy denso y muy adherente, contiene prácticamente

la totalidad de las mycobacterias presentes en la muestra. (Beerens, H; Luquet,
F. 1990, pág 57)

14.2.2. Aislamiento a partir del precipitado

Deshacer el precipitado con una agitador y triturarlo con 6 ml de la siguiente

solución (previamente mantenga a 37ºC):
 Laurilsulfato de sodio puro 30 g

Hidróxido sódico puro en lentejas 10 g

Agua destilada 1 000 ml

Repartir la mezcla en dos partes iguales en tubos de centrífuga estériles.

Agitar durante una hora el primer tubo y durante dos horas el segundo.

El contenido de cada tubo se neutraliza con la siguiente solución:

Ácido sulfúrico 1,5 ml

Púrpura de bromocresol 1/250 2 ml

Agua destilada 1 000 ml

Centrifugar una media hora a 3 000 rpm. Sembrar la totalidad de cada uno de
los precipitados en 6 tubos de medio de Colestos o de Loewenstein-Jensen. La
incubación se realiza a 37ºC y se observarán los cultivos durante cuatro mees,
tiempo que es necesario algunas veces para el desarrollo de cepas disgónicas.
(Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 58)

14.3. Aislamiento a partir de los residuos obtenidos en la centrifugación

de la leche

Se toman dos muestras de 2ml:

La primera se inoculará a un cobaya

Con la segunda se hará un cultivo

1ª etapa: triturar 2 ml del residuo en 6 ml de laurilsulfato alcalino

Laurilsulfato de sodio puro 30 g

Hidróxido sódico en lentejas 10 g

Agua destilada 1 000 ml

Distribuir la mezcla en partes iguales en dos frascos de centrifuga estériles.

Agitar en un agitador de Khan el primer frasco durante una hora y el segundo
durante dos.
Neutralizar hasta el viraje amarillo-grisáceo con la siguiente solución:

Acido fosfórico 1,5 g

Purpura de bromocresol 1/250 2 ml

Agua destilada 1 000ml

Centrifugar 30 minutos a 3 000 rpm

2ª etapa: decantar el contenido de los frascos de centrífuga, conservando el

precipitado.

Añadir a cada uno de ellos 3 ml de ácido oxálico al 5%.

Agitar la primera muestra durante 60 minuto y la segunda durante 120 minutos.

Neutralizar hasta el viraje amarillo grisáceo con la siguiente solución:

Hidróxido sódico 4g

Púrpura de bromocresol 1/125 2 ml

Agua destilada 1 000 ml

Centrifugar 30 minutos a 3 000 rpm

Sembrar la totalidad de los dos precipitados sobre el medio base de Colestos.

Se utilizan los medios de Colestos al huevo o de Lewenstein modificado por
Jensen, que los proveedores especializados suministran ya preparados para su
empleo.

Los bacilos tuberculosos de origen bovino, son sensibles al TCH, nitrasa

negativa y resistentes a la pirazinamida. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 59)

15. DETECCIÓN DE BRUCELLA

Para diagnosticar la brucelosis se pueden utilizar dos procedimientos; el Ring

test y el aislamiento de Brucella.

15.1. El “Ring test”

Se trata de una reacción de aglutinación con un antígeno coloreado con
hematoxilina, preparado con la cepa LONDRES 99. En la reacción la esterilidad
se logra adicionando un 0,5 % de fenol.

La prueba consiste en mezclar 1 gota de antígeno coloreado con 1 ml de leche.

Si la muestra es positiva, los gérmenes coloreados que constituyen el antígeno
se aglutinan y se adhieren a los glóbulos grasos que, al ascender en la leche,
forman un anillo teñido.

La rapidez de la reacción es función del tiempo que hace que se ha obtenido la

leche y de su contenido en materia grasa. Es más rápida en una leche fresca.
Se puede hacer la prueba a temperatura ambiente pero habitualmente se
acelera la reacción introduciendo los tubos en un baño a 37ºC. en este caso, la
lectura se puede efectuar a los 30 minutos.

La prueba es positiva cuando el anillo de nata es de color violeta oscuro y la

leche restante de color blanco; se considera negativa cuando el anillo es de
color blanco y la leche azul-violeta claro.

La intensidad de la reacción depende de la cantidad de aglutininas que

contiene la leche analizada. Así, las leches pobres se tiñen sólo débilmente. La
reacción es positiva cuando el anillo esta mas teñido que la leche y negativa en
el caso contrario. Esta técnica no se puede aplicar a la leche que contenga
calostro ni a la tomada directamente de la ubre.las principales ventajas de este
método son su facilidad de ejecución y su sensibilidad, que hace posible su
utilización ene l análisis de leches de mezcla (basta la leche de una sola vaca
infectada para que sea positivo el resultado de aprueba realizada sobre la
leche recogida en un establo medio, con 15-20 vacas). Este método de
diagnóstico permite localizar rápidamente los rebaños infectados analizando las
leches de mezcla. Sin embargo, es un método que solamente tiene un valor
cualitativo y cualquier reacción positiva, debe implicar un serodiagnóstico
individual. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 60)

15.2. Detección de Brucella por cultivo: aislamiento e identificación

Medio de aislamiento
 Peptona 10 g

Extracto de carne de buey 5g

Glucosa 10 g

Cloruro sódico 5g

Agar 15 g

Agua destilada 1 000 ml

pH: 7,5 (aproximadamente)

Disolver los ingredientes a ebullición. Esterilizar 15 minutos a 121 ºC. Enfriar

50ºC y añadir un 5% de suero de caballo inactivado (el suero debe calentarse
30 minutos a 56 ºC).

Añadir: Bacitracina 25 000 U/l

Polimixina B 600 µg/l

Actidiona 100 mg/l

Mezclar cuidadosamente. Verter en placas de Petri. Lasiembra se realiza con

un hilo o con un asa de cultivo. Los medios se incuban a 37ºC en atmósfera
con un 10% de CO2, obtenida utilizando una vela o una bombona. (Beerens, H;
Luquet, F. 1990, pág 60)

15.2.1. Método de la vela

Los frascos, tubos o placas de Petri, se introducen en un desecador de vidrio

un cuyo interior se coloca una vela. Se enciende la mecha. Se tapa con la
cubierta con el grifo cerrado (si es que hay uno), habiendo engrasado
previamente las superficies esmeriladas (la tapa y el grifo) con un poco de
grasa para vacío. Cuando la vela se apaga, la concentración en CO2 del
entorno ha alcanzado un 10%.(Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 60)

15.2.2. Método de la bombona

Se puede utilizar un tubo metálico que contiene el CO2 comprimido, fabricado y
suministrado por las casas especializadas. En el desecador preparado como se
ha descrito anteriormente, se hace un vacío de un 10% utilizando una bomba
de vacío. Se reemplaza el aire extraído con la misma cantidad de CO2
procedente de una bala provista de un manorreductor regulado a una presión
de 0,5 a 1 kg. el paso del gas al desecador se controla presionando con una
pinza en el tubo de goma de la conexión. El equilibrio se alcanza cuando la
aguja del manómetro indicador de vacio vuelve a señalar el cero.

Lógicamente, en cualquiera de estas operaciones (vela o bala de CO2) los

frascos o tubos deben estar tapados son algodón para conseguir que en su
interior haya la misma riqueza de CO2 que en el exterior. (Beerens, H; Luquet,
F. 1990, pág 60)

15.2.3. Identificación

Las cepas se aíslan por el método clásico y pueden ser identificadas por el
método de CRUICKSHANK (1984), utilizando bandas impregnadas de
colorantes:

- impregnar bandas de papel de filtro con fuchina básica diluida a 1/200 o

tionina a 1/600. Dejar secar.
- Colocar estas bandas paralelamente a la superficie del agar glucosado
con suero y cubrirlas con una fina capa del mismo medio. Dejar
solidificar.
- Realizar la siembra en superficie de las especies de Brucella en forma
de estrías perpendiculares a las bandas.
- Incubar el conjunto de 2 a 3 días a 37ºC en una atmosfera con un 10%
de CO2.
- Examinar los cultivos. Las cepas resistentes crecerán en línea recta sin
interrupción debajo de las bandas, mientras que el crecimiento de las
cepas sensibles se verá inhibido a 10 mm de las bandas. (Beerens, H;
Luquet, F. 1990, pág 61)
La interpretación de la prueba para las tres especies más usuales es la
siguiente:

Fuchina básica al 1/200 Tionina al 1/600

Brucella abortus Cultivo + No cultivo

Brucella melitensis Cultivo + Cultivo +
Brucella suis No cultivo Cultivo +

16. DETECCIÓN DE CAMPYLOBACTER

Esta prueba se realiza extendiendo 0,1 ml de leche en la superficie del

medio selectivo de BUTZLER, cuya fórmula es la siguiente:

Proteasa 15 g

Agar-sangre nº 2 Digerido de hígado 2,5 g

OXOID Extracto de levadura 5g

cod CM 271
Cloruro sódico 5g

Agar 12 g

Agua destilada 1 000 ml

Piruvato sódico 0,250 g

Suplemento para
crecimiento de
Metasulfito sódico 0,250 g
Campylobacter
OXOID SR 84 Sulfato férrico hidratado 0,250 g

Bacitracina 25 000 unidades

Cicloheximida 50 mg
Selección
suplemento de Sulfato de colistina 10 000 unidades
BUTZLER
OXOID SR 85 Cefalozinisodio 15 mg
 Novobiocina 5 mg

Disolver los componentes del agar-sangre en agua destilada a ebullición.

Distribuir en matraces cuya capacidad sea como mínimo dos veces y media el
volumen del medio. Ajustar el pH a 4,7. Esterilizar 121ºC durante 15 minutos.
En el momento del empleo, fundir el medio en un baño de agua hirviendo.
Dejar enfriar a 50-55ºC y entonces añadir:

- Un 7% de sangre de caballo estéril

- El suplemento para Campylobacter en la cantidad apropiada
- La solución de antibióticos, obtenida en una mezcla de agua-alcohol al
50%, en la cantidad adecuada.

Mezclar suavemente. Distribuir en placas de Petri. (Beerens, H; Luquet, F.

1990, pág 62)

Siembra: extender en superficie 0,1 ml de leche.

Incubación: colocar las paletas en atmosferas de CO2 conseguida utilizando

una vela; incubar a 37ºC. se puede hacer también en una atmosfera que
contenga un 6% de oxigeno, un 10% de gas carbónico y unn85% de nitrógeno.
Asimismo pueden utilizarse los saquitos comerciales generadores de gas.

En estas condiciones, es posible aislar las especies Campylobacter fetus sub-

especie jejuni y Campylobacter fetus sub-especie intestinalis. Son bacilos gram
-, curvos y móviles. Campylobacter jejuni es oxidasa +, catalasa +, sensible al
ácido nalidíxico y crece a 42ºC. C. fetus subs fetus es oxidasa +, catalasa +,
resistente al ácido nalidíxico y no crece a 42ºC.

C. jejuni puede provocar intoxicaciones alimentarias (como C. jejuni no es

capaz de multiplicarse en la leche, la dosis infectante es baja; la absorción de
500 Campylobacter es suficiente para causar la intoxicación). Puede producirse
por ingestión de leche cruda. La vacas lecheras pueden ser portadoras
intestinales y producirse la contaminación de la leche; no puede excluirse la
presencia de Campylobacter agentes de mamitis; no se encontrará nunca en
ausencia de coliformes fecales. (Beerens, H; Luquet, F. 1990, pág 62)
 Reacción Numero de células / ml Interpretación
+++ Más de 5x106 Formación de un gel
espeso: mamitis

++ 8x105 – 5x106 Formación de un

floculado espeso y
adherente con partículas
viscosas en el fondo del
cristalizador: mamitis

+ 4x105 – 5x105 Floculado persistente

pero ligero, visible sobre
todo sobre fondo negro

+ 2x105 – 5x105 Ligero floculado que

desaparece en unos 10
segundos

0 - de 2x105 Sin floculación

Bibliografia:

Beerens, H; Luquet, F. (1990). Guía práctica para el analisis microbiológico de

la leche y los productos lácteos. Editorial ACRIBIA, S.A. España.