UNIVERSIDAD TÉCNICA DEL NORTE

FACULTAD DE INGENIERÍA EN CIENCIAS

AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES
ESCUELA DE INGENIERÍA AGROINUSTRIAL

NOMBRE: Cristian Lita

FECHA: 31/05/2018

TEMA:

Extracción de proteína unicelular con la levadura kluyveromyces marxianus a partir del mucilago de café
en la Zona de Intag Cantón Cotacachi.
 Contenido
CAPITULO I ................................................................................................................................................ 4

1. INTRODUCCIÓN............................................................................................................................ 4

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................................... 4

1.2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 4

1.3. Objetivos ...................................................................................................................................... 4

1.3.1. Objetivo general ....................................................................................................................... 4

1.3.2. Objetivos específicos ................................................................................................................ 5

CAPITULO II .............................................................................................................................................. 5

2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................................... 5

2.1. Mucilago de café .......................................................................................................................... 5

2.2. Composición química del mucilago de café ................................................................................. 5

2.3. Usos del mucílago de café ............................................................................................................ 5

2.4. Proteína unicelular ........................................................................................................................ 6

2.5. Usos de la biomasa y la proteína unicelular. ................................................................................ 6

2.6. Bioquímica básica y pretratamiento de obtención de la SCP ....................................................... 7

2.7. Ventajas y desventajas del uso de proteína unicelular en procesos productivos .......................... 8

2.7.1. Ventajas ................................................................................................................................ 8

2.7.2. Desventajas ........................................................................................................................... 8

2.8. Aminoacidos presentes en la proteina unicelular ......................................................................... 9

2.9. Perspectivas futuras de la proteína unicelular .............................................................................. 9

CAPITULO II ............................................................................................................................................ 10

3. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................... 10

3.1. DISEÑO DEL PROYECTO ...................................................................................................... 10

3.1.1. Diseño experimental ........................................................................................................... 10

3.1.2. Factores y niveles ............................................................................................................... 10

3.2. MÉTODOS................................................................................................................................. 10

3.2.1. Preparación del mucílago de café ....................................................................................... 10

3.2.2. Tipo de levadura y condiciones de almacenamiento. ......................................................... 10

 3.2.3. Preparación del inóculo ...................................................................................................... 10

3.2.4. Esterilización del equipo e inoculación .............................................................................. 10

3.2.5. Proceso de fermentación..................................................................................................... 11

3.2.6. Evaluación del rendimiento de la biomasa. ........................................................................ 11

Bibliografía................................................................................................................................................. 11
 CAPITULO I
1. INTRODUCCIÓN
1.1.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

El mucilago es un subproducto obtenido de la elaboración del café (Coffea arabica), el cual tiene un
aprovechamiento agroindustrial para la obtención de mieles, proteína unicelular, pectina, etc. En
Imbabura la producción de café es alrededor de 3500 quintales anuales obtenidos de 600 ha del cual
35000 kg son de mucilago retirado por medio mecánico. Existen investigaciones para el aprovechamiento
de este residuo pero los costos de equipos tecnológicos hacen que sea difícil la viabilidad para la
obtención de nuevos productos.

Los residuos obtenidos del beneficio húmedo del café son pula y mucilago siendo este segundo un
hidrogel (sistema coloidal líquido liofílico) que posee una carga orgánica, según agua del primer lavado,
expresado en DQO de 26,535 mg. OZ/Litro, equivalente a 3.64 Kg. Oz/quintal oro producido. El
mucílago representa entre el 20 y el 22% del peso del fruto y conforma una importante proporción de la
carga orgánica potencial, por su alto contenido de azúcares, pectinas y ácidos orgánicos ( Asociación
Nacional del Café, 2015).

1.2.JUSTIFICACIÓN

A nivel nacional el café se encuentra entre los diez cultivos con mayor superficie del país y sexto lugar en
exportaciones de productos no petroleros. Uno de los subproductos obtenidos del procesamiento del café
es el mucilago que se lo encuentra en las plantas procesadoras de este bien además el costo de su
adquisición no es alto. Estos dos aspectos hacen que exista en aprovechamiento potencial de este residuo
para la elaboración de productos innovadores tales como pectinas, mieles y proteína unicelular.

Existe gran cantidad de desechos orgánicos de origen agrícola lo que ha atraído la investigación para su
manejo y aprovechamiento de las cuales una opción biotecnológica es la producción de proteína
unicelular para la alimentación animal o humana gracias a sus propiedades funcionales, siendo así una
alternativa para convertir estos desechos en derivados útiles y que generen rubros extras para la empresa.

La proteína unicelular obtenida a partir del mucilago de café puede remplazar algunas fuentes de proteína
para el consumo animal e incluso en porciones para humanos después de ser tratada adecuadamente por
lo que dispone para su investigación y formulación de alimentos.

1.3.OBJETIVOS
1.3.1. OBJETIVO GENERAL

 Extraer proteína unicelular con la levadura kluyveromyces marxianus a partir del mucilago de
café.
1.3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar parámetros de crecimiento de la levadura kluyveromyces marxianus.

 Evaluar las características físico-químicas del producto obtenido al final de la extracción.
 Cuantificar la biomasa obtenida de la extracción de proteína unicelular a partir del mucilago de
café.

CAPITULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1.MUCILAGO DE CAFÉ

El mucilago es un subproducto del beneficio del café que representa alrededor del 5 % en peso seco de
este. Este subproducto constituye una capa de aproximadamente ½ a 2 mm de espesor que esta
fuertemente adherida a la cáscara del grano de café. Desde el punto de vista físico el mucilago es un
sistema coloidal líquido, desde el punto de vista químico este contiene agua, pectinas azúcares y ácidos
orgánico.

Durante la maduración del café, el pectato de calcio, localizado en la laminilla media y la protopectina de
la pared celular son convertidos en pectinas.

Esta transformación o hidrólisis de las protopectinas resulta en la desintegración de la pared celular

dejando un plasma libre. En este plasma además de pectinas, se encuentran azúcares y ácidos orgánicos
derivados del metabolismo y la conversión del almidón en azúcares (Carbonell & Vilanova , 1952).

2.2.COMPOSICIÓN QUÍMICA DEL MUCILAGO DE CAFÉ

Las sustancia pécticas totales pueden alcanzar valores de 39 % en base húmeda. La mayoría de los
azúcares totales están en la forma reductora. La composición química del mucílago se ha estudiado e
indica que este material contiene 84,2% de agua, 8,9% de proteína, 4.1% de azúcar 0,91% de ácido
péctico y 0,7% de ceniza. Esta fracción aparentemente no contiene taninos ni cafeína, pero contiene
enzimas pectonolíticas las cuales hasta el momento no han sido perfectamente identificadas.

Se ha encontrado que también el pH del mucílago varia de acuerdo con el grado de madurez, asícom con
el contenido usado para el procesamiento de. En Coffea arabica el procesamiento manual de los granos
de café maduro result en un pH del mucilago de cerca de 5,6 a 5,7, mientras que el procesamiento
mecánico que usa agua con un pH de 6, 4 resulta en un material con valores de pH de 5,0 a 5,2. Las
variaciones en valores del pH deben tener una influencia significativa sobre la actividad de las enzimas en
el proesode fermentación, así como sobre los componentes de estos subproductos.

2.3.USOS DEL MUCÍLAGO DE CAFÉ

El mucilago es rico en sustancias pécticas de las cuales se podría obtener pectina. Sin embargo estas
sustancias son difíciles de recuperar debido a que el despulpado y lavado, operaciones inmersas en la
producción de café, deben llevarse a cabo utilizando grandes cantidades de agua y casi siempre en estado
de fermentación. Por lo tanto si se desea obtener estas sustancias pecticás será necesario reciclar el agua
utilizada en estas partes del proceso.

En estudios realizados para la obtención de sustancias pécticas a partir del mucilago de café se acidifico
este subproducto del procesamiento a café a un pH inmediatamente después de la extracción para así
reducir la separación enzimática. El material fue entonces centrifugado para separar las impurezas de las
sustancias pécticas y luego se trató con alcohol etílico para precipitar la pectina. La recuperación de las
pectinas se logró por medio de filtración seguida de un secado a temperaturas bajas. El total de pectinas
obtenidas, expresada como ácido galacturónico, fue 17g/100g de mucílago. El problema con este proceso
es el costo del alcohol etílico.

El mucílago contiene elevada cantidad de azúcares reductores debido a este aspecto y a la factibilidad de
ser utilizados por los microrganismos, se le confiere al mucilago una importancia industrial como sustrato
de fermentaciones para la producción de metabolitos de interés económico.

2.4.PROTEÍNA UNICELULAR

De acuerdo (Molk, y otros, 2004), se denomina proteína unicelular ó bioproteína a aquella obtenida de la
biomasa microbiana de algas, bacterias, levaduras y hongos filamentosos, cultivados en condiciones
fermentativas apropiadas y controladas que garanticen una adecuada tasa de crecimiento, por medio del
aprovechamiento de sustratos baratos compuestos por o enriquecidos con carbono, nitrógeno y fósforo.

El término proteína unicelular deriva de la contracción de “proteína de organismos unicelulares”, que

sería el término más adecuado. La literatura científica se refiere a la proteína unicelular empleando el
término SCP, el cual deriva del término “single cell protein”.

2.5.USOS DE LA BIOMASA Y LA PROTEÍNA UNICELULAR.

El principal e inmediato uso de la proteína unicelular es en piensos para alimentación animal, para la
utilización de la SCP es necesario un secado previo de la biomasa antes de la ingesta. Para el consumo
humano el proceso es más tecnificado en el cual implica la remoción de riesgos nutricionales como lo son
los ácidos nucleicos de esta manera garantizar la calidad y seguridad alimenticia del producto.

A partir de la biomasa microbiana pueden desarrollarse muchos productos derivados dada su riqueza
composicional: carbohidratos, lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, vitaminas, etc. (Rojas, 1995)
Cuadro 1. Derivados posibles a partir del aprovechamiento industrial de los principales componentes de
la biomasa bacteriana.

Fuentes: (Rojas, 1995)

2.6.BIOQUÍMICA BÁSICA Y PRETRATAMIENTO DE OBTENCIÓN DE LA SCP

La obtención de proteína unicelular involucra una variedad de procesos bioquímicos de acuerdo al tipo de
microrganismo utilizado en el proceso.

Los microorganismos deben además ser inoculados en un medio particularmente favorable tanto en
condiciones de competencia (medio previamente "esterilizado"), como en condiciones nutricionales. Por
ello es requerido un pretratamiento inicial que no altere indeseablemente al substrato y que garantice que
el mismo favorezca el desarrollo de la SCP. Este pretratamiento generalmente implica (Crueger y Crueger
1989)

a) Reducción del tamaño y homogeneizado mecánico de modo que sea más accesible al
microrganismo y más fácil
b) Eliminado de agentes inhibidores del crecimiento microbiano tales como toxinas y trazas de
residuos químicos. Así mismo debe garantizarse la inexistencia de substancias que puedan causar
efectos tóxicos en la SCP obtenida posteriormente.
c) En algunos casos, cuando el microrganismo a emplear necesita metabolizar formas orgánicas más
simples, debe hidrolizarse enzimática o químicamente al substrato empleando ácidos, álcalis ó
enzimas como amilasas ó diastasas.
 d) Suplementación del medio con nutrientes como fósforo y sales nitrogenadas que sirvan de fuente
mineral a la SCP de manipular en la fermentación.
e) Ajuste del pH y de la humedad del substrato de modo que favorezcan el crecimiento de los
microorganismos involucrados. Generalmente se requiere regular constantemente las condiciones
de pH empleando un buffers. El ajuste del pH se mantiene a lo largo del proceso fermentativo y
no solo durante el pretratamiento del substrato. En la mayoría de los casos el pH suele ser ácido y
ronda valores de 4 ó 5 a lo largo del proceso.
f) Tratamiento térmico del substrato para eliminar la flora bacteriana patógena y/o competitiva de la
matriz. El tratamiento puede ser de pasteurizado en matrices destinadas a fermentación en
substrato líquido o esterilización en substratos sólidos. En general los parámetros del proceso
térmico rondan los 122-123 ºC por un tiempo de 30-45 minutos (Buccino, Connors, Kirschne, &
Pollard, 2001)

2.7.VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL USO DE PROTEÍNA UNICELULAR EN

PROCESOS PRODUCTIVOS

2.7.1. Ventajas

 Los requerimientos de crecimiento son fáciles de implementar obteniendo alta productividad ya

rápidas tasas de crecimiento siendo de 0,3 – 2 h, 1 – 3 h, 2 – 6 h, y 4 – 12 h, para bacterias,
levaduras, algas y hongos filamentosos respectivamente. Además es posible producir y
seleccionar fácilmente cepas de alta productividad.
 La SCP puede hacerse crecer en substratos baratos, muchos incluso objeto de desecho
agroindustrial, para lo cual se pueden emplear muy variadas metodologías.
 Prácticamente cualquier substrato que sea fuente de carbono orgánico puede ser utilizado.
(F.A.O, 2003)
 Las instalaciones de producción suelen tener áreas reducidas y son muy eficientes.
 La (University of Indiana, 2003) menciona que la biomasa obtenida tiene un contenido proteico
de apreciable valor nutricional de entre 44 % a 88 % en peso seco y hasta un 15% de ácidos
nucleicos también en base seca.
 Estudios demuestran que la eficiencia en la producción de leche aumentó significativamente
cuando la dieta de animales como las cabras fue suplementada con SCP.

2.7.2. Desventajas

 Muchas veces la SCP no presenta las características de olor, textura, color y sabor necesarias para
garantizar una buena aceptación. Las algas suelen ser las más problemáticas en color y sabor. El
mejoramiento sensorial puede implicar procesos de transformación posteriores de complejidad y
costos tales que representan un verdadero desafío.
  El alto contenido de ácidos nucleicos (4-6% en algas; 10-16% en bacteria; 6-10% en levadura y
2,5-6% en hongos), puede ser un riesgo para la salud de los animales monogástricos y para el
hombre.
 La digestión lenta ó nula de la pared celular en el tracto digestivo del ser humano y otros
animales, especialmente en cuanto a algas puede ser causa de indigestión y reacciones alérgicas.
 Según (Bergquist & Jurgenson, 2003) afirman que pesar de la alta productividad, en un proceso
de producción de SCP efectuado en un medio de fermentación líquido, la proteína se obtiene en
concentraciones muy diluidas (menos del 5% de sólidos), por lo que se requiere de procesos de
concentración

2.8.AMINOACIDOS PRESENTES EN LA PROTEINA UNICELULAR

Los métodos convencionales para producir alimentos ricos en proteínas no son suficientes para cubrir la
alta demanda de estos a nivel mundial. Por consiguiente, la exploración de fuentes no convencionales
como la proteína microbiana representa una alternativa de importancia fundamental para complementar
dietas en alimentación animal de acuerdo a (Ferrer, y otros, 2004)

La levadura utilizada para alimentación animal es un producto rico en proteínas y en vitaminas, la cual no
fermenta por que presenta un metabolismo exclusivamente respiratorio sobre sustratos carbonados. Los
valores promedios de proteínas, expresados en porcentajes de materia seca, para Candida utilis, Candida
lipolytica, Candida rugosa, Schawaniomyces cerevisiae y Kluyveromyces marxianus varía entre 33 y 45
%. Estas proteínas tienen en común un alto porcentaje de lisina (del 7 al 9 %) y un bajo porcentaje de
aminoácidos azufrados (de 0,7 a 1,7 % de cisteína y de 1 a 2 % de metionina) (Ferrer, y otros, 2004).

2.9.PERSPECTIVAS FUTURAS DE LA PROTEÍNA UNICELULAR

La SCP trata de buscar un nicho en un mercado sumamente competitivo, donde en este momento
económico no encuentra la mejor de las perspectivas. Quizás fue por esta misma dificultad económica
que fueron fuertes y consolidadas compañías petroleras las que iniciaron la investigación y no empresas
de alimentos. Ellas tenían la tecnología, la infraestructura y hasta el lujo de no esperar ganancias
sustanciales en el proceso.

La verdad es que los esfuerzos que se han hecho para emplear la SCP como suplemento seco en dietas
animales y humanas con la finalidad de combatir el hambre y aumentar la productividad no han dado los
resultados esperados de acuerdo a (Israelidis, 2003).

Según (Chacón, 2004) afirma que solo existe un camino para que la SCP tenga un suceso futuro: los
problemas correspondientes al campo organoléptico deben ser solucionados por el tecnólogo de
alimentos, y el proceso debe llegar a ser competitivo en comparación con las otras ofertas existentes. Así
mismo deben contemplarse posibilidades donde la SCP se produzca a un bajo costo en procesos donde se
experimente con combinaciones simultáneas de muchos microorganismos, o bien, recoger la SCP cuando
esta sea un subproducto de otras actividades más rentables.
 CAPITULO II

3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.DISEÑO DEL PROYECTO

3.1.1. Diseño experimental

Se utilizó un diseño completamente al azar con tres factores de estudio siendo estos: cantidad de sulfato
de amonio (factor A), temperatura (factor B) y agitación (factor C).

3.1.2. Factores y niveles

FACTOR A FACTOR B FACTOR C

Sulfato de amonio (ml) Temperatura (°C) Agitación (rpm)

Nivel bajo Nivel alto Nivel bajo Nivel alto Nivel bajo Nivel alto

100 150 25 30 200 300

3.2. MÉTODOS

3.2.1. Preparación del mucílago de café

Para la presente investigación se ajustó el pH del mucilago a 4.5 posteriormente se esterilizo 2000 l de
mucilago obtenido del beneficio húmedo del café en autoclave a 121 °C por 20 min posteriormente fue
enfriado y congelado hasta su utilización.

3.2.2. Tipo de levadura y condiciones de almacenamiento.

Kluyveromices marxianus levadura liofilizada de la casa comercial Chr. Hansen.

3.2.3. Preparación del inóculo

Se inoculo en un Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de caldo Saborou Glucosado y se incubo a la

temperatura de 30 °C durante 24 horas previas al proceso de fermentación. La concentración optima
previa a la fermentación es de 10 7 células/ml la cual se midió por medio de conteo al microscopio
utilizando una cámara de Neubauer.

3.2.4. Esterilización del equipo e inoculación

Se esterilizo las mangueras y filtros acoplados al fermentador en autoclave a 121 °C por 20 min.
3.2.5. Proceso de fermentación

Una vez que el quipo este frío se procede a la inoculación en 2000 ml de mucilago de café ya esterilizado
con la levadura (100 ml), 100 ml de sulfato de Amonio a una temperatura de 25 °C y 200 rpm.

Se repite este procedimiento con 2000 ml de mucilago de café, 150 ml de Sulfato de amonio a una
temperatura de 30 °C con 100 ml del inóculo realizando 3 repeticiones por cada tratamiento.

Se toma muestras de la solución a los 15, 30 minutos, 1 hora y luego cada 2 horas.

3.2.6. Evaluación del rendimiento de la biomasa.

Cuando el proceso fermentativo llegue a la fase estacionaria se tomaran muestras de 40 ml de la biomasa,

en tubos de plástico y se procede a la centrifugación a 3000 rpm por un tiempo de 30 minutos.

Terminada la centrifugación se obtiene la biomasa húmeda la cual se coloca en cajas Petri y se secan e la
estufa a 60 °C hasta obtener un peso contante.

Se calcula el rendimiento, por medio de un balance de materiales.

Bibliografía
Asociación Nacional del Café. (2015). Los subproductos del café. Obtenido de ANACAFÉ:
https://www.anacafe.org/glifos/index.php/BeneficioHumedo_Subproductos#El_muc%C3%ADla
go

Bergquist , B., & Jurgenson, J. (2003). Utilisation of polyvinyl alcohols for the production of single cell
protein by microbial fermentation in enclosed systems.

Buccino, R., Connors, N. C., Kirschne, & Pollard, D. J. (2001). Real-time monitoring of a fungal
fermentation, at pilot scale, using in situ mid-infrared spectroscopy.

Carbonell, R. J., & Vilanova , T. (1952). Beneficiado rápido y eficiente del café mediante el uso de soda
cáustica. San Salvador: Santa Tecla Ed.

Chacón, A. (2004). Perspectivas actuales de la proteína unicelular (scp) en la agricultura y la industria.

Agronomía Mesoamericana, 100-104.

F.A.O. (2003). Single cell protein.

Ferrer, J., Davalillo, Y., Chandler, C., Páez, G., Mármol , Z., & Ramones, E. (2004). Producción de
proteína microbiana a partir de los desechos del procesamiento de bagacillo de caña de azucar.
Laboratorio de Tecnología de Alimentos.

Israelidis, C. (2003). Single cell protein nutrición, twenty years later.

Molk, J. N., Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Evans, J. G., Salmon, E. D., Pellman, D., & Bloom, K. (2004).
The Differential Roles of Budding Yeast Tem1p,Cdc15p, and Bub2p Protein Dynamics in
Mitotic Exit. Molecular Biology of de cell.

Rojas, A. (1995). Obtención de proteína unicelular a partir de residuos de destilería.

University of Indiana. (2003). Single cell protein.