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Facultad de Biología

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Departamento de Bioquímica Vegetal


y Biología Molecular

PROBLEMAS DE BIOQUÍMICA GRUPOS C y D


Curso 2003-2004

CINÉTICA ENZIMÁTICA
1. Se ha purificado una enzima a partir de hígado de rata. En la purificación se partió de 500 ml de extracto
crudo que contenía 2.000 mg de proteína. 50 µl de ese extracto crudo catalizaban, en condiciones
óptimas de ensayo, la producción de 1 nmol de producto en 1 segundo. Tras varios pasos de purificación
se obtuvieron 2 ml de una preparación de enzima pura que contenía 3 mg de proteína por mililitro y
presentaba una actividad total de 120 U.
a) Calcular la concentración de la enzima en el extracto crudo en U/ml y katales/ml.
b) Determinar la actividad específica, en U/mg de proteína, en el extracto crudo.
c) Calcular la recuperación del proceso de purificación y el número de veces que se ha purificado la
enzima.
Sol.: a) 1,2 U/ml o 0,02 µkatales/ml; b) AE = 0,3 U/mg; c) R= 20%, FP= 66,7 veces.

2. La descarboxilación enzimática de un ß-cetoácido, ensayada en 1 ml de mezcla de reacción, procede


con las siguientes velocidades iniciales a las concentraciones de sustrato que se citan:

v o (moles CO2/2 min) [cetoácido] (M)


0,588 2,500 x 10-3
0,500 1,000 x 10-3
0,417 0,714 x 10-3
0,370 0,526 x 10-3
0,252 0,250 x 10-3

A partir de estos datos calcular Vmáx y K M de esta reacción enzimática.


Sol.: KM = 0,5 mM; Vmáx = 0,35 µmol/min.

3. La velocidad inicial de una reacción enzimática se determinó a distintas concentraciones de sustrato.


Calcular KM y Vmáx por los distintos métodos gráficos a partir de los datos que se relacionan a
continuación:

[S] (M) v o(mmol/l min)


2,3 x 10 -3
0,95
3,0 x 10-3 1,13
4,5 x 10-3 1,42
12,0 x 10-3 2,14
38,0 x 10-3 2,64

Sol.: KM = 5 mM; Vmáx = 3 mmol/l min.

4. Para estimar los parámetros cinéticos de una determinada enzima se realizaron una serie de ensayos
utilizando 20 µl de una preparación de la misma y distintas concentraciones de su sustrato. Los valores
de v o obtenidos se recogen en la tabla siguiente (nmol/ml min)
[S] (M) v o (nmol/ml min)
3,15 10,0
4,16 12,5
8,30 20,0
12,50 25,0

Calcular las actividades total y específica de la preparación enzimática, sabiendo que su volumen total
era de 10 ml y su contenido en proteína de 200 µg/ml.
Sol.: AT= 25 U, AE= 12,5 U/mg.

5. Disponemos de una preparación de una enzima de la que queremos conocer sus parámetros cinéticos.
Para ello realizamos varios ensayos en los que cambiamos la concentración del sustrato y obtenemos
los siguientes resultados:

[S] (mM) v o (nmoles ml -1 min -1)


0,33 24,98
0,50 33,33
1,00 50,00
2,00 66,67

¿Cuáles son la KM y la Vmáx de la enzima? Si para los ensayos habíamos utilizado 20 µl de la


preparación enzimática y sabemos que ésta tiene una concentración de proteína de 5 mg/ml, ¿cuál es la
actividad específica de dicha preparación? ¿qué volumen de ella hemos de añadir a 1 ml de mezcla de
reacción con [S] = 0,2 M para que se formen 4,5 moles de producto en 10 min?
Sol.: KM = 1 mM, Vmáx = 0,1 mM/min., AE = 1 U/mg proteína; 90 l.

6. La KM de cierta enzima para su sustrato es 75 µM. Cuando se ensaya con una concentración inicial de
sustrato de 50 mM, se observa que al cabo de 15 minutos se ha transformado el 30% de sustrato.
a) Calcular la velocidad máxima de la reacción
b) Cuando se ensaya la actividad con distintas concentraciones de sustrato, en presencia de un cierto
inhibidor a una concentración de 50 µM, y se representan gráficamente los resultados mediante la
representación de dobles inversos, la pendiente de la recta obtenida es la misma que cuando el
experimento se hace en ausencia del inhibidor, pero la ordenada en el origen aumenta al doble. ¿Qué
tipo de inhibición se ha producido? Calcular la Ki.
c) Calcular el grado de inhibición cuando el ensayo se hace con una concentración de sustrato de 150
µM, en presencia de 100 µM del inhibidor anterior.
Sol.: a) 1 mM min-1; b) Incompetitiva; Ki = 50 µM; c) i = 0,57.

7. Una reacción enzimática se lleva a cabo, a distintas [S], en ausencia y presencia de dos inhibidores
diferentes. Decir qué tipo de inhibidor es cada uno y hallar todos los parámetros cinéticos.

[S] v0 v a'(+ Ia = 1,5 mM) v b'(+ Ib = 1,5 mM)


(mM) (µmol/l min) (µmol/l min) (µmol/l min)
0,2 1,67 0,625 0,83
0,4 2,86 1,176 1,43
0,8 4,44 2,110 2,22
1,6 6,15 3,48 3,08
3,2 7,62 5,16 3,81

Sol.: KM = 1 mM; Vmáx = 10 mol/l min; K'M(a) = 3 mM; Vmáx(b) = 5 mol/l.min; Ki(a) =0,75 mM; Ki(b) = 1,5 mM.

8. Una enzima se ensayó a distintas concentraciones de su sustrato específico en ausencia y presencia de


un inhibidor ([I]= 1 mM), obteniéndose los resultados que se presentan en la tabla. Calcular la K M y la
Vmáx en ambos casos y la Ki para el inhibidor.
[S] v 0 (µmol/1 min) v' 0 (µmol/1 min)
(mM) -Inhibidor +Inhibidor
0,02 8,33 6,25
0,05 16,67 10,00
0,10 25,00 12,50
0,50 41,67 15,62
0,80 44,44 16,00

Sol.: KM = 0,1 mM; Vmáx = 50 mol/l.min; K'M = 33,3 M; V'máx = 16,6 mol/l.min; Ki = 0,5 mM.

9. Al ensayar la actividad de una enzima con concentraciones saturantes de sustrato se obtuvo una
velocidad de catálisis de 300 µmol/l min en ausencia de inhibidores, y de 160 µmol/l min en presencia de
10 µM de un cierto inhibidor incompetitivo. Para [S] = 10 mM y en ausencia del inhibidor se obtuvo una
velocidad de 125 µmol/l min. Calcular K M y Vmáx, K' M, Ki y el grado de inhibición para [I] = 10 M y [S] =
10 mM. ¿Qué concentración de inhibidor conseguiría un grado de inhibición de 0,9 para la misma [S]?
Sol.: Vmáx = 300 mol/l min, V'máx = 160 mol/1.min, KM = 14 mM, K'M = 7,46 mM, Ki = 11,42 M, i = 0,27. I = 0,246 mM.

10. Se ha estudiado cinéticamente la reacción catalizada por la muermasa. Tras llevar a cabo una serie de
ensayos enzimáticos los datos de concentración de sustrato y v o fueron analizados mediante una
representación de dobles inversos y se obtuvo una recta que cortaba al eje Y en el valor 0,8 (µM/min) -1 y
al eje X en el valor -0,02 (µM) -1. Se ha estudiado igualmente el efecto del ß-muermol y la muermirulina,
sustancias supuestamente inhibidoras, sobre el transcurso de la reacción. En ambos casos la
representación de los datos por el método de dobles inversos daba como resultado una recta que cortaba
al eje Y en el valor 1,6 (µM/min) -1. Las rectas se diferenciaban en el valor de sus pendientes, que era de
40 min para el ß-muermol y de 80 min para la muermirulina.
a) ¿Cuáles son la KM y la Vmáx de la reacción sin inhibidor?
b) ¿Qué tipo de inhibidores son la muermirulina y el ß-muermol?
c) Si para los ensayos con inhibidor la concentración de éstos era de 5 mM (en ambos casos) ¿cuáles
son los valores de las Ki de estos inhibidores?
d) Calcula el grado de inhibición a una concentración de sustrato de 0,1 mM para el caso del ß-
muermol.
Sol.: a) Vmáx = 1,25 mol/l.min, KM = 50 M. b) Muermirulina, no competitivo; ß-
muermol, incompetitivo. c) Ki = 5 mM ambos casos. d) i = 0,4.

11. Un extracto enzimático crudo contiene 20 mg de proteína/ml. 20 µl de ese extracto crudo catalizan la
producción de 3 µmoles de producto en 1 min, en condiciones óptimas de ensayo. Calcular a) la
concentración de la enzima en el extracto crudo en U/ml; b) la actividad específica de esta enzima en el
extracto en U/mg de proteína; c) la actividad total del extracto si tenemos 100 ml del mismo.
Sol.: a) 150 U/ml; b) 7,5 U/mg de proteína; c) 15.000 U.

12. Se ha purificado la glutamina sintetasa de la cianobacteria Anabaena cylíndrica. En un extracto crudo


que contenía 4.200 mg de proteína había una actividad total de esta enzima de 186 U. Tras varios pasos
de purificación se obtuvo una preparación en la que la enzima estaba pura. En esta preparación, que
contenía 4 mg de proteína, la actividad total de glutamina sintetasa era de 37,5 U. Calcular cual ha sido
la recuperación en el proceso de purificación de la enzima y el número de veces que ésta se ha
purificado. Sabiendo que el peso molecular de la glutamina sintetasa es de 600.000, calcular su número
de recambio (Kcat).
Sol.: R: 20%; P: 212 veces; N.R.: 5.625 min-1.

13. Se dispone de dos preparaciones distintas de una enzima cuyo PM= 40.000. Una de las preparaciones
constituye un extracto crudo celular y en ella la actividad específica que se detecta es de 0,4 U/mg de
proteína. La otra constituye una preparación de la enzima pura y su actividad específica es de 65 U/mg
proteína. ¿Cuál de las dos preparaciones utilizarías para calcular el número de recambio de la enzima?
Justifica tu respuesta. Calcula el valor del mismo.
Sol.: En preparación de enzima pura; N.R. = 2.600 min-1.

14. Una enzima tiene un peso molecular de 60.000 y 6 sitios activos por molécula. La actividad enzimática
de una preparación pura es de 12 µmoles de sustrato cada 2 min en presencia de 18 µg de enzima.
Calcúlese la actividad molar por centro catalítico de la enzima.
Sol.: 3,3 x 10 3 min-1.
15. Una preparación enzimática de glutamato deshidrogenasa (P.M.= 60.000) contiene 10 mg de proteína
por ml. Si 20 µl de esta preparación se ensayan en condiciones estándar óptimas, pero variando la
concentración de sustrato, se obtienen las velocidades que se indican en la tabla para los casos de
ausencia y presencia de un inhibidor ([I] = 2 mM).

[S] v o(mol/mlmin)
(mM) -I +I (2 mM)
0,25 2,00 0,47
0,33 2,48 0,63
0,50 3,33 0,91
1,00 5,00 1,67
2,00 6,67 2,8

a) Determinar la Vmáx y la K M de la enzima en presencia y ausencia del inhibidor. Decir de qué tipo de
inhibición se trata.
b) Calcular la actividad enzimática de la preparación de glutamato deshidrogenasa, expresada como
U/ml.
c) ¿Cuál es la actividad específica de la glutamato deshidrogenasa en la preparación enzimática?
d) Considerando que la preparación enzimática es pura, calcular el número de recambio de la glutamato
deshidrogenasa.
e) Se llevan a ensayo 50 µl de la preparación enzimática, en presencia de 0,5 M de sustrato. Calcular la
cantidad de sustrato desaparecido en 3 min (el volumen estandar de reacción es de 1 ml).
Sol.: a) Vmáx = 10 µmol/mlmin; KM = 1 mM; V'máx = 8 µmol/mlmin; K'M = 4
mM; b) 500 U/ml; c) 50 U/mg proteína; d) 3.000 min-1; e) 75 µmoles/ml.

16. Una muestra de 0,25 ml de una preparación de una enzima pura (PM: 100.000) contiene 10 mg de
proteína/ml y presenta una actividad total de 1000 U. La K M de la enzima para su sustrato específico es
de 10-5 M. Al ensayar 10 µl de la preparación en presencia de 20 µM de un inhibidor incompetitivo, con
[S] = 2 x 10-3 M, se obtiene una velocidad inicial de 20 µmol/min.ml.
a) Calcular la Ki del inhibidor.
b) ¿Cuál será el grado de inhibición de la reacción enzimática cuando [S] = K' M?
c) ¿Y si aumentamos 3 veces la [I]?
d) Si partimos de [S] = 10-2 M, ¿qué cantidad de sustrato podrán transformar 50 µl de la preparación en 5
minutos?
e) Hallar la actividad específica de la preparación y el número de recambio de la enzima.
Sol.: a) Ki = 20 µM. b) 0.25. c) 0.73. d) 1 mmol. e) AE = 400 U/mg, NR = 40.000 min-1.

17. Un grupo de jóvenes investigadores ha conseguido purificar una enzima a partir de cloroplastos de
espinaca. En el proceso de purificación se partía de 250 ml de un extracto crudo que contenía 5.200 mg
de proteína. 100 µl de este extracto catalizaban la producción de 1,5 µmoles por minuto del producto de
la reacción enzimática en condiciones óptimas de ensayo. Al acabar la purificación se obtuvieron 5 ml
de una preparación que contenía 5 mg de la enzima pura. 10 µl de esta última preparación catalizaban
la aparición de 5 µmoles de producto en un minuto por ml de mezcla de ensayo.
Calcular la actividad total y específica antes y después de la purificación, la recuperación del proceso y
el grado de purificación.
Si el PM determinado para la enzima es de 40.000, calcular su número de recambio.
Al ensayar la actividad de la enzima a distintas concentraciones de sustrato, y en presencia o ausencia
de 1 mM del inhibidor 2'-ADP, se obtuvieron los siguientes resultados:

[S] mM v 0(µM/min) v i (µM/min)


200 300 299
100 299 297
10 291 273
1 231 150

Determinar qué tipo de inhibición ejerce el 2'-ADP sobre la enzima, la Ki y el grado de inhibición para [S]
= 1 mM.
Sol.: AT inicial= 3.750 U, AE inicial= 0,72 U/mg, AT final= 2,500 U, AE final= 500 U/mg. Recuperación=
66,66%, purificación = 694 veces. NR = 20.000 min-1. Competitiva. KM = 0,3 mM, Ki = 430 M.
18. Una enzima (PM: 50.000) tiene una actividad por centro catalítico de 10.000 min -1 y presenta tres sitios
activos. Se ha purificado la enzima, obteniéndose 1,5 ml de solución, que contiene 2 mg de proteína/ml.
La enzima presenta una KM para su sustrato de 1 mM.
Se ensayan 40 µl de esta solución, en un volumen de ensayo de 10 ml, con [S] = 0,1 M, y en presencia
de 1 mM de un inhibidor no competitivo, obteniéndose una velocidad de transformación de sustrato de
2,4 mM/min.
a) Determinar Ki y el grado de inhibición de la reacción.
b) Si en la purificación se partió de 5 litros de extracto crudo, con una actividad de 0,6 U/ml y 1 mg
de proteína/ml, determinar la recuperación del proceso y el número de veces que se ha purificado la
enzima.
c) Determinar el tiempo de un ciclo catalítico.
Sol.: a) Ki = 1 mM; 0.5; b) 60%; 1000 veces; c) 2.10-3s.

19. La actividad de una enzima se ensayó a distintas concentraciones de sustrato y de un compuesto X,


que inhibía la reacción, a una concentración de 50 mM. Los resultados obtenidos fueron:

[S] M v 0 (µmoles/ml min)


-X +X
12,5 13,3 3,45
16,7 17,2 4,55
25,0 22,2 6,45
50,0 33,3 11,76
100,0 40,0 20,00

a) Calcular la KM y la Vmáx de la reacción.


b) Determinar el tipo de inhibición que ejerce X.
c) Determinar la Ki y el grado de inhibición para una [S] = K M.
Sol.: a) KM = 43 µM; Vmáx = 60 mM/min; b) competitiva; c) Ki = 14,4 mM; 64%.

20. Una preparación homogénea de triosa-fosfato isomerasa (PM: 60.000) contiene 10 mg de proteína por
ml. Para determinar los parámetros cinéticos de la enzima se midió la velocidad inicial de la reacción a
distintas concentraciones de sustrato, utilizando 20 µl de la preparación de enzima en 1 ml de volumen
de ensayo. En las mismas condiciones se analizó también el efecto de un inhibidor. Los resultados
obtenidos fueron:

[S] (mM) v o (mol/ml.min)


-I +I (2mM)
0,25 2,00 0,47
0,33 2,48 0,62
0,50 3,33 0,91
1,00 5,00 1,67
2,00 6,67 2,75

Determinar:
a) La KM y la Kcat de la enzima.
b) La actividad específica de la preparación de triosa-fosfato isomerasa.
c) El tipo de inhibición que se ha producido.
d) La Ki de la enzima para el inhibidor ensayado.
Sol.: a) KM = 1 µM, Kcat = 3.000 min-1; b) 50 U/mg; c) competitiva; d) Ki = 0,5 mM.

21. Una aldolasa de músculo de rata se ensayó a diversas concentraciones de sustrato, en presencia y
ausencia de iodoacetamida, obteniéndose los siguientes resultados:

[Fru 1,6 BP] v 0(moles/ml min)


(M) -I +I
5 0,063 0,0156
10 0,102 0,0267
20 0,160 0,0410
50 0,244 0,0620
100 0,286 0,0710

Sabiendo que la concentración de enzima en el ensayo fué de 10 nM y la del inhibidor fué de 7,5 nM:
a) determinar la KM y la Kcat de la enzima.
b) discutir el posible tipo de inhibición que ejerce la iodoacetamida en esta reacción, y cómo podría
demostrarse esa hipótesis experimentalmente.
22. Se han determinado las velocidades iniciales de una reacción enzimática a distintas concentraciones
del único sustrato de la reacción. Los resultados obtenidos fueron:

[S] (mM) v o (µmol/ml.min)


2,0 13,9
3,0 17,9
4,0 21,3
10,0 31,3
15,0 37,0

Sabiendo que la concentración de enzima en el ensayo era de 0.5 nM, determina la K M y la Kcat de la
enzima y la Vmáx de la reacción, y discute como se afectarían cada uno de estos parámetros cuando:
a) La concentración de enzima en el ensayo se triplica.
b) La reacción se lleva a cabo en presencia de un inhibidor competitivo a una concentración equivalente
a la Ki.
c) La reacción se lleva a cabo en presencia de un inhibidor no competitivo a una concentración
equivalente a la Ki.
d) La reacción se lleva a cabo en presencia de un inhibidor incompetitivo a una concentración
equivalente a la Ki.
Sol: Vmáx = 48 mM min-1; KM = 5 mM; Kcat = 96.106 min-1.

23. Una enzima monosustrato se ensayó a diversas concentraciones de sustrato en ausencia y presencia
de un inhibidor. Los resultados obtenidos fueron:

[S] v 0 (nmol/ml.min)
(µM) -I +I
2,5 31,5 7,8
5,0 51,0 13,3
10,0 80,0 20,5
25,0 122,0 31,0
50,0 143,0 35,7

Calcúlese:
a) La KM de la enzima y la Vmáx de la reacción.
b) La concentración de enzima (actividad enzimática en U/ml) utilizada en el ensayo.
c) El tipo de inhibición producida.
Sol: a) KM = 11 µM; Vmáx = 167 µM min-1; b) 0,167 U/ml; c) no competitiva.

24. Se ha conseguido purificar una enzima 2000 veces, obteniéndose al final del proceso 2 ml de
preparación enzimática pura, que contiene 3 mg de proteína, a partir de un extracto crudo de 1000 ml
de volumen, que tenía una actividad enzimática de 5 U/ml y una concentración de proteína de 10
mg/ml. El PM de la enzima es 30.000 y presenta 3 sitios activos. Se toman 20 µl de esta preparación y
se ensayan a una [S] = 5x10-5 M. La KM de la enzima para su sustrato específico es de 10-5 M:
a) Suponiendo que la enzima sigue una cinética hiperbólica, calcular v 0 en estas condiciones.
b) ¿Qué concentración de inhibidor competitivo (K i=2x10-5 M) será necesaria para conseguir el 40% de
inhibición de la actividad enzimática?
c) ¿Cuántas veces habría que aumentar la concentración de inhibidor para doblar el procentaje de
inhibición?
d) Si ensayamos 5 µl de la preparación a [S] = 0,1 M, y en un volumen de reacción de 2 ml, ¿qué
concentración de sustrato quedará a los 5 minutos de reacción?
e) ¿Cuál ha sido la recuperación en el proceso de purificación?
f) Calcular la actividad por centro catalítico de la enzima.
Sol.: a) vo = 25 µmoles/min; b) [I] = 8 x10-5 M; c) 6 veces; d) 81,25 mM; e) 60%; f) 10.000 min-1

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