MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS 2

LABORATORIO N° 01
“NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS
MESÓFILOS VIABLES”

I. INTRODUCCION:

El análisis de los alimentos está catalogado por diversas técnicas y

métodos para determinar microorganismos que se encuentran viables
en los alimentos ya sean sólidos como las carnes, verduras y frutas, o
líquidos ya sea leche y jugos de frutas; entre estos métodos tenemos la
numeración de microorganismos aerobios mesófilos, la cual nos
permite determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta
un alimento sobre su superficie o en su interior.

El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener

una idea del grado de frescura o pronta alteración de los alimentos,
dependiendo de la cantidad de bacterias presentes. En el grupo de los
mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras
capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En
este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o
no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera
un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Es por
ello que en la presente práctica se desea aprender a realizar el recuento
de los microorganismos mesófilos de distintas muestras de alimentos
los cuales consumimos casi a diario como estudiantes.

II. OBJETIVOS:

 Conocer el método para determinar el número de microorganismos

viables.

 Determinar el número de microorganismos aerobios mesófilos viables

que contiene un alimento.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO:

En el grupo de los mesófilos aerobios se incluyen todas las bacterias,

mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones
establecidas.

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Recuento Microorganismos Viables Totales:

Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en

el alimento. Este número no guarda relación con el de microorganismos
patógenos por lo que no puede usarse como índice de su presencia y sólo
debe considerarse un indicador de las características higiénicas
generales del alimento.

Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico,

medio limitado en nutrientes para medida de la flora no láctica de
alimentos fermentados) y de las condiciones de incubación (mesófilos,
psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de
poblaciones diferentes.

En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o

aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones
(alimentos envasados al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de
anaerobios totales. Se han desarrollado técnicas que hacen posible la
automatización del proceso, hay cuatro técnicas biológicas básicas
técnicas de recuento de viables:

 Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de

volumen conocido del alimento que se analiza. El resultado es
función de una serie de factores como son el método de muestreo,
el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las
características del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse
tanto en masa como en superficie, aunque hay que considerar
que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada
bacteria viable formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en
una placa normal o por medio de un plaqueador en espiral que
va depositando concentraciones progresivamente más diluídas
de la muestra.

 Filtros de membrana: Utilizados cuando el número de bacterias

es bajo. Son filtros con un poro de 0,45 mm que retienen las
bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro sobre
una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede
haber sido procesada para epifluorescencia previamente, lo que
facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar con
naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos
nucleicos).

 Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingñlés de

Direct Epifluorescence Filter Technique (técnica

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deepifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las

bacterias se filtran para retenerlas en una membrana apropiada
que posteriormente se trata con un agente fluorescente (como la
naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se
somete el filtrado a un tratamiento previo con detergentes para
destruir las células somáticas). La detección de los
microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de
fluorescencia o por cualquier otro método de medida de la
epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se incuban
para producir colonias que son más fácilmente dtectables.

 Contaje de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño

volumen de agar-cultivo a un porta y se incuba para seguir la
formación de microcolonias al microscopio.

 Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución

madre) y se depositan gotitas de 10 ml en una placa Petri
(gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las
colonias en las gotitas tras la incubación.

 Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios

de cultivos generales o selectivos en las que se deposita 1 ml de
la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación se hace el
recuento.

 Método del número más probable: Basado en series de diluciones

y cálculo estadístico del número de bacterias presentes en las
diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El método
es popular aunque poco exácto.

 Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de

metileno o resazurina. Colorantes reducidos por las bacterias; al
reducirse cambian de color y esto es medible. Usado en medios
líquidos (lácteos).

 Tubos rodantes: Son tubos herméticamente cerrados en los que

haciéndolos girar se forma una fina capa de agua. Utiles para
recuento de anaerobios.

 Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se

coloca un volumen determinado y se recuentan las bacterias.

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IV. EQUIPOS, MATERIALES Y MUESTRAS:

Equipos:
- 01 Cocinilla eléctrica.
- 01 Baño María:
- 01 Estufa.
- 01 Balanza.
- 01 Mechero Bunsen.
- Contador de Colonias.

Materiales:

- 19 placas Petri.
- 19 Tubos de Ensayo.
- 02 Matraces Erlenmeyer.
- 03 Morteros con sus timones.
- Pipetas.
- Agar Plate Count (PC).
- Agua Peptonada.
- Alcohol de 96 °C.

Muestras:

- 02 Sandwich de pollo.
- 01 Sandwich de hamburguesa.

V. PROCEDIMIENTO:

Preparación de la Muestra:

a) Preparar con anterioridad el agar PC,

según las indicaciones dadas por el
frasco y conservar en el refrigerador.

b) Prender la cocinilla eléctrica y poner ahí

el matraz con el agar PC, hasta que este
deje de estar gelatinizado y sea líquido.

c) Llevar el matraz con el agar líquido al

Baño María mientras seguimos
preparando nuestra muestra.

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d) Esterilizar la mesa de trabajo,

primero limpiar con el alcohol,
esperar un momento y luego pasar
con el mechero.

e) Triturar la muestra en el mortero.

f) Pesar 10 g de la muestra en un
matraz y agregar 90 ml de agua
peptonada.

g) Agitar nuestra muestra durante 1 min, y rotularemos con -1.

h) Rotular 5 tubos de ensayo con -2, -3, -4, -5 y -6 y agregar a cada uno
9 ml de agua peptonada.

i) Agregar 1 ml de -1 a -2, luego 1 ml de -2 a -3 y asi sucesivamente

hasta agregar 1 ml de -5 a -6.

j) Poner en orden las placas Petri e ir agregando a cada una en orden

1 ml de cada tubo de ensayo por placa,
empezando por el tubo -6 y por
incorporación una vez que este en la
placa agregaremos el agar a la altura
que no sobrepase la mitad del fondo de
la placa y realizaremos movimientos
de vaivén, luego continuar con la
placa -5 y sucesivamente.

k) Rotular la placa indicando el número de grupo, el agar usado y el

número de dilución realizado y dejar unos minutos para que el agar
gelatinice.

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l) En otra placa aparte solo agregaremos el agar y rotularemos con la

letra T que significa testigo, esto para comprobar que se realizo el
cultivo en un ambiente esterilizado.

m) Llevar las placas a la estufa a temperatura de 30 – 31 °C por 48

horas en posición invertida.

Recuento de colonias:

a) Poner las placas en orden y seleccionar las placas en las que se sea
posible contar sus colonias.

b) Elegir el método por el que contar las colonias, si estas son pocas,
entonces podemos contarlas mirando hacia la luz con la placa y en
caso de que sean muchas pero sea posible contar contaremos las
colonias en el contador de colonias.

VI. RESULTADOS:
Sandwich de pollo, grupo I:

Placas escogidas para el conteo: -3 y -4

- Placa -3: 49 Colonias. 49 000 +
- Placa -4 : 3 Colonias. 30 000
79 000 ÷ 2 = 39 500
=395x102ufc/g

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Sandwich de pollo, grupo II:

Placas escogidas para el conteo: -3 y -4

- Placa -4: 232 Colonias. 2 320 000 +
- Placa -5: 13 Colonias. 1 300 000
3 620 000 ÷ 2 = 1 810 000
=181x104ufc/g
Sandwich de hamburguesa, grupo III:

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Placas escogidas para el conteo: -4 y -5

- Placa -4: 18 Colonias. 180 000 +
- Placa -5: 1 Colonias. 100 000
280 000 ÷ 2 = 140 000
=14x104ufc/g

VII. CONCLUSIONES:

Se observó que en la muestra del sándwich de pollo a diferencia de la

hamburguesa esta posee mayor cantidad de colonias, esto debido a que
al momento de preparar ese sándwich el pollo pasa por un deshilachado
en el que no se toma un buen cuidado, mientras la hamburguesa pasa
por una plancha para poder cocinarla, lo cual elimina a algunos
microorganismos, esta práctica nos demostró que el recuento de
mesófilos nos puede indicar las condiciones de salubridad por las que
pasó un alimento.

VIII. RECOMENDACIONES:

Realizar cada procedimiento de la práctica al lado del mechero, esto

nos permitirá tener un ambiente mejor esterilizado y evitar errores al
momento de ver nuestros resultados.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 https://es.scribd.com/doc/232184397/Numeracion-deMicroorganismos-
Aerobios-Mesofilos-Viables-docx
 http://myslide.es/documents/determinacion-de-bacterias-aerobios
mesofilos-viables.html
 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioRecuento.htm
 https://es.scribd.com/doc/31881556/Numeracion-de-Microorganismos-
Aerobios-Mesofilos-Viables
 http://www.analizacalidad.com/docftp/fi178arm2004-4.pdf
 http://www.unavarra.es/genmic/curso%20microbiologia%20general/12
-metodos%20de%20recuento.htm

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