9.1 Introducción...

187
9.2 l-Glutamic ácido... 191
9.2.1 Antecedentes históricos y nuevos retos... 191
9.2.2 Enfoque biotecnológico y producción... 192
9.2.3 Uso industrial y papel terapéutico... 194
9.3 l-lisina... 194
9.3.1 Antecedentes históricos y nuevos retos... 194
9.3.2 Enfoque biotecnológico y producción... 198
9.3.3 Uso industrial y papel terapéutico... 199
9.4 Metionina... 199
9.4.1 Antecedentes históricos y nuevos retos... 199
9.4.2 Enfoque biotecnológico y producción... 201
9.4.3 Uso industrial y papel terapéutico... 203
9.5 Triptófano... 203
9.5.1 Antecedentes históricos y nuevos retos... 203
9.5.2 Enfoque biotecnológico y producción... 203
9.5.3 Uso industrial y papel terapéutico... 205
9.6 Estudio de caso: producción de l-lisina en medio glucosa y miel de caña
suplementados con harina de pescado bajo condiciones sumergidas en fermentador tarro
mini... 205
9.6.1 Cultivo de C. glutamicum FRL Nº 61989... 205
9.6.2 Aislamiento, extracción y purificación de l-lisina... 206
Efecto de parámetros de composición y fermentación de los medios de
9.6.3 comunicación sobre la l-lisina
producción... 207
9.7 Conclusión... 209
Agradecimientos... 209
Referencia
s ..................................................................................................................................... 209

9.1 Introducción
Los aminoácidos son los componentes constructivos (subunidades) de proteínas y péptidos y así son
considerados como los pilares de la vida. Los aminoácidos contienen un alto porcentaje de nitrógeno (~ 16%),
que los distingue de las grasas y los hidratos de carbono (Mahmood 2010). Los aminoácidos se clasifican en
dos categorías: aminoácidos esenciales, que no son synthe-tamaño en el cuerpo; y aminoácidos no esenciales,
que son sintetizados por el organismo (tabla 9.1). Los aminoácidos tienen gran demanda y aplicación debido a
su importancia en la , alimentación, cuidado personal, industria alimentaria y farmacéutica como nutrientes,
aditivos, rejuvena-tors y drogas. Sus papeles son muy importantes y específicos en diferentes aplicaciones
como

187
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188 Zafar Alam Mahmood

Tabla 9.1 Lista de aminoácidos esenciales y no esenciales

S. no Los aminoácidos esenciales S. no Aminoácidos no esenciales
01 Arginina 01 Alanina
02 Histidina 02 Asparragina
03 Isoleucina 03 Aspartato de
04 Leucina 04 Cisteína
05 Lisina 05 Glutamato
06 Metionina 06 Glutamina
07 Fenilalanina 07 Glicina
08 Treonina 08 Prolina
09 Triptófano 09 Serina
10 Valina 10 Tirosina
así como en potencial terapéutico. Durante las últimas dos décadas, la demanda mundial de algunos
aminoácidos esenciales, por ejemplo, la lisina y la metionina, ha aumentado enormemente debido a su extenso
uso en la alimentación, alimentos y las industrias farmacéuticas. La addi-ción de estos aminoácidos en la
alimentación animal no sólo optimiza el crecimiento de los animales, sino que también mejora la calidad y
cantidad de carne. La disponibilidad de estos productos de origen animal sin duda ha ayudado mucho en la
superación de la deficiencia de aminoácidos esenciales, que es muy prominente en los productos alimenticios
primarios de zonas subdesarrolladas y superpobladas del mundo. La demanda de aminoácidos no esenciales,
por ejemplo, el ácido glutámico, ha aumentado en los últimos años debido a su amplia aplicación en la
industria alimentaria. La demanda global se pretende también aumentar en las próximas décadas, que
requieren investigación-ers para concentrarse más en desarrollar técnicas de fabricación avanzadas
herramientas biotechno-lógico para satisfacer la demanda difícil de varios aminoácidos.

El objetivo de este capítulo es presentar información completa en algunos de los aminoácidos antes
mencionados, tales como lisina, metionina, triptófano y ácido glutámico (Figura 9.1) con respecto a sus
antecedentes históricos, nuevos retos junto con la

O
O
S
H 2N H 3C OH
OH
NH 2
NH 2

L -Lisina, C 6 H 14 N 2 O 2 Metionina, C 5 H 11 NO2 S

O O O

OH HO OH
NH 2 NH 2
HN
L - Glutamic ácido,
L -Triptófano — C 11 H 12 N 2O 2 C 5 H9 NO 4

Figura 9.1 Estructura y fórmula molecular del ácido glutámico, lisina, metionina y triptófano.
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de 2014

Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 189

utilización de herramientas para aumentar la producción capabil-dad de cepas bacterianas, sus aplicaciones
industriales y terapéuticas roles y enfoques biotecnológicos.

La utilización de microorganismos para el desarrollo de productos comerciales se supone que han

iniciado en los tiempos primordiales. Esto ha resultado en la producción de bebidas fermentadas y alimentos
pero sin el verdadero concepto de fermentación. Fue Pasteur quien introdujo la palabra fermentación por
primera vez y niega la teoría de la generación espontánea. Estudios posteriores sobre estas líneas han sido
realizados por un gran número de investigadores con bacterias y hongos filamentosos. Sin embargo, la
interpretación de la scien-científico de la fermentación comenzada solamente cuando la percepción y la
comprensión de la fisiología microbiana y procesos metabólicos fueron completamente entendido (Mahmood
2010).

La biotransformación de moléculas orgánicas en productos útiles proporciona un nuevo con-cept en la

historia de la fermentación y, como resultado, se identificaron una serie de metabolitos tales como antibióticos
y aminoácidos. Los continuos estudios sobre el tema resultaron en el descubrimiento de un inmenso número
de productos farmacéuticos y bioquímicos. Al mismo tiempo, los avances en la ingeniería de fermentación
proporcionan gran ayuda en la producción de estos productos útiles a escala comercial. Con conocimientos
avanzados de fisiología microbiana, biología molecular e ingeniería genética, la fermentación indus-prueba ha
crecido considerablemente en cuanto a la introducción de algunos productos nuevos, que tienen grandes
aplicaciones industriales y médicas. Estos avances han aportado más conocimientos signifi cativos acerca de
estos microorganismos, su aislamiento y modificación y sus condiciones de crecimiento junto con la
posibilidad de mejorar la productividad del producto deseado a través del proceso de Optimización o por la
adición o sustracción de un nutriente particular.

Avance inicial en cuanto a la mutación de las cepas y la utilización de physiol microbiana-ogy para
desarrollar la composición de medios convenientes para el mayor rendimiento de productos fue el comienzo
de la biotecnología moderna. La evaluación de nuevos productos biológicos que podrían utilizarse como
productos farmacéuticos, nutracéuticos y cosmecéuticos ha producido progreso de phe-nomenal — con
Microbiología industrial en un lado y fermentación Ingeniero-ing por otro. La explotación industrial
intensificación de prácticas biológicas aboga por que biotecnología será una industria cada vez más
importante en un futuro cercano y que alterará la vida y la prosperidad de las personas en todo el mundo.

En los últimos 50 años, el conocimiento de la fisiología microbiana y biología molecular ha aumentado

sustancialmente en términos de producción de aminoácidos y su utilización en la nutrición humana así como
en los animales domésticos. La aplicación diversificada de los aminoácidos como materia prima en las
industrias alimentaria, farmacéutica y cosmética tiene un papel signifi cativo en el fomento de las actividades
de investigación en este campo en particular. Los métodos antiguos, como la extracción de aminoácidos de
origen natural o producción a través de síntesis química, en gran parte han sido sustituidos por procesos
biotecnológicos como la producción a través de la fer-mentación o por catálisis enzimática. Investigación
organizada en la producción microbiana de los aminoácidos al parecer comenzó durante la última década de
1940, y a finales de la década de 1950, un num ber de los aminoácidos se elaboran utilizando fuentes
microbianas. El mejor ejemplo es de fermentación ácido l-glutámico directa usando Glutamicum del
Corynebacterium (figura 9.2) en Japón por Kyowa Hakka Kogyo Company (Kinoshita et al., 1957a).

Este curso tuvo un gran efecto económico en el campo de la producción de aminoácidos y, en

consecuencia, l-lisina con éxito fue producido y comercializado utilizando una cepa mutante de C.
glutamicum (Kinoshita et al., 1958). Esto ha resultado en un nuevo concepto de producción fermen-
interpretativa de los aminoácidos con la introducción de una serie de mutantes auxotrófica o reglamentarias
derivadas artificialmente para la producción de otros aminoácidos, tales como metionina, triptófano y
otros. Durante las últimas tres décadas, un gran número de

190 Zafar Alam Mahmood

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1 μm

Figura 9.2 Micrográfo de electrón de de C. glutamicum ATCC 13032. (Adaptado de Wittmann, C., y Becker, J. La
historia de l-lisina: de vías metabólicas para la producción industrial. Microbiología Monografías DOI
10.1007/7171_2006_089/Published en línea: 24 de febrero de 2007.)

cepas mutantes de C. glutamicum han desarrollado para producir y satisfacer la demanda del mercado de
varios aminoácidos. Biotecnología sin duda ha jugado un papel importante en la producción fermentativa de
varios aminoácidos.
 Con el desarrollo de nuevas aplicaciones para los aminoácidos en la alimentación, alimentaria y phar-
maceutical, se hicieron enormes mejoras en tecnología de producción durante la segunda mitad del siglo
XX. Tecnología de fermentación sumergida desempeña un papel clave en este proceso, y la producción
fermentativa de los aminoácidos representan actualmente los principales productos de la biotecnología en
cuanto a volumen y valor. El campo es muy competitivo y el costo de producción es un factor importante, que
sin duda puede apoyar a los fabricantes para mantenerse en el mercado con negocio rentable. Para la
producción rentable de fermen-TORIZADO, muchas metodologías biotecnológicas se han aplicado para
establecer la alta productividad y la mejora en los procesos de recuperación de producto. Ahora se está
utilizando el papel de la ingeniería genética relacionadas con cepas productoras de aminoácidos para el
desarrollo-biosíntesis y transporte capacidad de organismos para la producción mejorada. Además, el rápido
progreso en el análisis del genoma se espera revolucionar técnicas para mejorar la cepa microbiana. Con estos
avances, la producción mundial y con-sumption de aminoácidos se espera que aumente más en el futuro y, por
tanto, tendrá gran efecto sobre las industrias basadas en aminoácidos en términos de inversión. En la
actualidad, los principales productores de aminoácidos se basan en Japón, Estados Unidos, Corea del sur,
China y Europa. Sin embargo, algunos otros países asiáticos, como Indonesia, Malasia, Tailandia y Vietnam
también están entrando en el negocio del aminoácido. Las fabricación importantes compa-Nei incluyen grupo
Ajinomoto, Archer Daniels Midland Company, Cheil Jedang, COFCO bioquímicos (Anhui) Ltd. Co.,
Corporación Daesang, Evonik, Global Bio-Chem Technology, Novus International Inc., Royal DSM N.V.,
Sekisui médica Ltd. co., Shandong Zhengda Linghua biotecnología Ltd. Co., Toronto Research Chemicals
Inc., Vedan y VitaLys I / S. El mercado mundial de los aminoácidos ha sido pronosticado para llegar a US$
11,6 billones para el año 2015. La demanda de varios aminoácidos se espera que aumente en la producción
del ani-mal alimentación, alimentos, productos de suplemento dietético, edulcorantes artificiales y cosméticos
en los años subsecuentes (José 2011; Wippler 2011). Patrón de consumo del mundo en 2011 para lisina,
metionina y triptófano se muestra en la figura 9.3, que es autoexplicativa

Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 191

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Lisina
Metionina
 Triptófano

Estados
China Europa occidental Otros países asiáticos Unidos
Central América del sur Europa oriental central México Canadá
África Japón Medio Oriente

Figura 9.3 Consumo mundial de metionina, lisina y triptofano durante el año 2011.

y proporciona una idea integral sobre el consumo de estos aminoácidos en las regiones de ent se diferencian
del mundo (IHS química 2012).

9.2 l Ácido L-glutámico

9.2.1 antecedentes y nuevos retos
De una aplicación industrial o punto de vista comercial, ácido l-glutámico es uno de los aminoácidos más
importantes. Los iones carboxilato y las sales del ácido glutámico se conocen como glutamato. Su
descubrimiento inicial es bastante antiguo y primero fue divulgado en 1866 por un científico alemán, Karl
Heinrich Leopold Ritthausen, en el gluten de trigo tratado con ácido sulfúrico (Plimmer y Hopkins, 1912). En
1907, la primera producción comercial exitosa de ácido glutámico realizó en la Universidad Imperial de
Tokio Kikunae Ikeda, quien desarrolló y patentó un método para producir una sal cristalina de ácido
glutámico, glutamato monosódico (MSG). Posteriormente, MSG fue patentado por la Corporación Ajinomoto
de Japón en 1909. El punto de inflexión en la historia de la producción de ácido glutámico fue el
descubrimiento de Micrococcus glutamicus (más tarde identificado como C. glutamicum en 1957), que
produce 30 g/L de l-glutámico ácido en medio de la glucosa a través de la fermentación (Kinoshita et al.,
1957b). El interés en la fermentación ácido l-glutámico a gran escala se desarrolló principalmente debido a la
creciente demanda de MSG, lo que fue y todavía es utilizado como agente de mejora de sabor. Ácido
glutámico y su MSG sal representan el mayor segmento de producto en el mercado del aminoácido. En 2007,
el volumen del producto mundial fue indicado como 1,6 millones de toneladas (Demain 2007); en 2009, la
cifra llegó a 2 millones de toneladas (Sano 2009), y en 2012, informó de la cifra a 2,2 millones de toneladas
(Abdenacer et al., 2012).
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192 Zafar Alam Mahmood

Glucosa

Phosphoenol
piruvato Piruvato

CO 2

Oxaloacetato CO 2

CO 2
Acetil – CoA
Ácido cítrico Citrato de
ciclo
 Α-cetoglutarato CO2

Glutamato deshidrogenasa

-Glutámico ácido

Figura 9.4 Biosíntesis de ácido l-glutámico en C. glutamicum usar la glucosa como fuente de carbono.

La demanda del mercado está aumentando continuamente y está creando un desafío para los fabricantes,
para aumentar la capacidad de las plantas existentes o utilizar herramientas biotecnológicas avanzadas para
aumentar la producción en términos de mejora de la tensión y modificación en el medio de fermentación. La
biosíntesis de ácido l-glutámico con glu-tamicum C. implica relativamente simples vías de metabolismo. La
glucosa es principalmente metabo-lized a través de las vías glicolíticas. Piruvato y phosphoenol piruvato
desempeñan papeles importantes en la producción de oxaloacetato y α-cetoglutarato. El α-cetoglutarato se
convierte en l-glutamic ácido en presencia de la enzima glutamato deshidrogenasa (Figura 9.4). La etapa de
fosforilación es muy importante porque los genes que controlan este proceso de conversión se encuentran
adyacentes a los genes de síntesis de pared celular y división celular. Por lo tanto, cualquier trastorno en los
mecanismos de síntesis de pared celular o división celular, puede inhibir la actividad de actividad de la α-
cetoglutarato deshidrogenasa. Como resultado, la con-versión de α-cetoglutarato a ácido glutámico puede ser
afectada (Eggeling y Sahm 2011).

9.2.2 producción y enfoque biotecnológico de

Una gran cantidad de herramientas biotecnológicas se han utilizado por varios investigadores con una
comprensión de la fisiología microbiana para modificar las tensiones de aumento de la producción de ácido
glutámico, especialmente utilizando C. glutamicum (Ikeda y Takeno 2013). Avanza, con respecto a las
capacidades de las diferentes cepas de C. glutamicum para producir ácido glutámico, se han divulgado de vez
en cuando en las últimas décadas. Esto se hizo hav-ing amplio conocimiento de la biología, vías biosintéticas,
mutación, requerimientos nutricionales y mechanosensitive supuestos canales asociados a este
organismo. Producción microbiana de ácido l-glutámico ha sido extensamente estudiada por un gran número
de
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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 193

los investigadores de la investigación con diferentes cepas de especies Coryneform y el proceso de cepas
específicas han sido patentados. Las especies más populares de Coryneform incluyen C. glutam-icum,
Corynebacterium lilium, herculis del Corynebacterium, Brevibacterium flavum, Brevibacterium
lactofermentum, divarticum del Brevibacterium, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium thio-
genetalis, saccharoliticum del Brevibacterium, y Brevibacterium roseum (Kinoshita 1999). Otros organismos
productores de ácido glutámico son Escherichia coli, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus cir-
culans y Sarcina lutea. Industrialmente, se fabrican generalmente ácido glutámico por/fed lote sumergido
procesos de fermentación utilizando modificadas genéticamente cepas
de Corynebacterium o Brevibacterium. Producción a escala comercial se lleva a cabo en fermentadores
grandes equipados con todas las facilidades para controlar diferentes parámetros y optimizar la producción
como la provisión de la refrigeración, medición de oxígeno disuelto y pH y otros. Un ejemplo típico del
proceso de fermentación sumergida en una escala de laboratorio para la producción de ácido l-glutámico
utilizando una cepa mutante de C. glutamicum ha sido suma-marized abajo.

Los organismos se mantienen generalmente en agar inclinado de Hottinger con digestión de la tripsina de
carne, cloruro de sodio, fosfato dipotásico y agar a baja temperatura. Después de subcultivos, un cultivo de 24
h de edad se utiliza para inocular 25 mL de medio estéril semilla en matraces Erlenmeyer de 250 mL por
triplicado. Puede utilizarse la siguiente composición media de la semilla: glucosa (8%), NH4Cl (0.5%), licor
escarpado del maíz (0.3%), K 2 HPO4 (0.5%), KH2 PO4 (0.5%), MgSO4·7H2O (0.03%), CaCO3 (1.0%) y agua
desionizada para hacer el 100%. El pH del medio puede ajustarse a 7.2 con NaOH. Los frascos inoculados se
cultivan en una incubadora de Agitador orbital mantenida a 30° C y 230 rpm por 15 h. Todo el contenido de
un frasco es entonces transferido a un fermentador de cordero Mini tarro de capacidad de 2.0 L con 500 mL
de estéril melaza con medio nutritivo (20%), KH 2PO4 (0.5%), KH 2PO4 (0.5%), MgSO 4·7H2O (0.3%), urea
(0,8%), CaCO3 (1.0%) y agua para hacer 100%. En la mayoría de los casos el pH óptimo del medio se
registró como 7.0. La fermentación se inicia generalmente con agitación y aireación durante 48 h a 30° C. Al
final de la incubación, se separa el caldo de cultivo de las células por centrifugación a 10.000 rpm por 5 min a
4° C y el sobrenadante se diluye 50 veces con el 7% (v/v) de ácido acético glacial. La muestra diluida más
luego se centrifuga a 10.000 rpm por 5 min a 4° C. El sobrenadante es luego finalmente se filtra a través de
una membrana de nylon de tamaño de poro de 0,22 μm y luego recopilado para el análisis de la piel-ther y
cristalización (Khan et al., 2013a, b; Pasha et al. 2011).

Desde el descubrimiento de la cepa original de C. glutamicum, un gran número de cepas, que son capaces
de producir cantidades significativas de ácido glutámico, ha sido adelantados de devel a través del proceso de
la ingeniería genética. Rendimientos ahora han superado los 100 g/L y aún más con cepas modificadas en
comparación con las cepas salvaje originales, que produjo solamente 10 g/L. Se observaron cepas productoras
de ácido glutámico más originales de C. glutamicum como auxotrophs de biotina. Por lo tanto, creciendo estas
cepas en un medio deficiente en biotina fue encontrado para "desencadenar" la producción de ácido
glutámico. El medio de la deficiencia de biotina tiene la propiedad de alterar la membrana celular del
organismo debido a la biosíntesis de ácidos grasos subóptima y es así responsable del aumento de la
producción. Teniendo en cuenta esta hipótesis, se cree que algunos otros factores fisicoquímicos como la
fermentación a temperaturas más altas, la adición de surfactantes (p. ej., Tween 40) o antibióticos (p. ej.,
penicilina) en el medio de cultivo también puede provocar la excreción de ácido glutámico. Estos factores se
han relacionado con un mecanismo de gatillo-gering resultando en una disminución o represión de la enzima
α-cetoglutarato deshidrogenasa. Así, finalmente causando redistribución de metabolitos en el punto de
bifurcación en el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) que va de α-cetoglutarato a succinil-CoA o gluta-mate
(figura 9.4). Sin embargo, este mecanismo tiene limitaciones, por lo tanto, un mayor aumento o
sobreproducción de glutamato puede lograrse a través de la optimización del flujo metabólico
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194 Zafar Alam Mahmood

mediante la regulación de la actividad de la deshidrogenasa del glutamato (Asakura et al. 2007). l-Glutamic
ácido pro-ducción también se logró a través de células inmovilizadas de C. glutamicum. Usando más de 93
g/L, se lograron buenos rendimientos a través de la fermentación por lotes pero con baja productividad (3,8
g/L/h), mientras que 73 g/L de ácido glutámico se recuperó a través de la fermenta-ción continua con alta
productividad de aproximadamente 29,1 g/L/h (Amin y Al-Talhi 2007). Un num ber otros estudios también se
han publicado, que documentan el papel de las células inmovilizadas en la producción de ácido l-
glutámico. Se ha reportado que inmovilización de células microbianas en los procesos biológicos puede
ocurrir como un fenómeno natural o a través de procesos artifi-cial. Aunque las células adjuntas en su hábitat
natural exhiben un crecimiento significativo, las células artificialmente inmovilizadas también permiten
reestructuración de crecimiento. Los autores divulgaron obtener 48,5 g/L de l - glutamic ácido por las células
inmovilizadas de una cepa mutante de C. glutamicum (Pasha et al. 2011; Prasad et al. 2009). El uso de células
inmovilizadas para la producción de ácido l-glutámico y algunos otros aminoácidos está progresando
rápidamente y se espera que tenga algunos datos más valiosos y útiles para la explotación comercial en un
futuro cercano.

9.2.3 aplicación industrial de y papel terapéutico

La mayor aplicación del ácido glutámico y su sal es en la industria alimentaria como un potenciador del
sabor. Una cantidad considerable de ácido glutámico libre, o su mensaje sal, está presente en diferentes
alimentos, por ejemplo, en diferentes tipos de quesos y salsas de soja. Además, porque el glutamato es un
compuesto clave en el metabolismo celular, por lo tanto sirve como un cerebro único combustible y realiza
otras funciones importantes como la desintoxicación de amoníaco, como agente hepatoprotector (glutamina),
para ayudar en la úlcera péptica curación y oth-ers (Chaitow 1985; Zareian et al. 2012).

Uno de los papeles principales del ácido glutámico en productos farmacéuticos es el de un neurotrans-
mitter. l - ácido glutámico se distribuye extensamente en sistema nervioso central (SNC) y se divulga para
actuar como un neurotransmisor. Además, puede tener un efecto estimulante sobre el metabolismo de la
corteza cerebral, mejorando así el rendimiento mental y la memoria func. La concentración de ácido
glutámico en el SNC es más alta que cualquier otro neurotransmisor comúnmente reconocida. Además, los
datos bioquímicos y electrofisiológicos sugieren también que el ácido glutámico o su análogo actúa como un
neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central. Hay una alta concentración de N-metil-d-receptor de
aspartato (NMDA) en la cadera-pocampus (floración 2001). El bloqueo de los receptores NMDA puede
afectar en gran medida la memoria y funcionamiento mental general de un individuo. El ácido glutámico y
ácido aspártico tienen la capacidad para combinar con los receptores NMDA así aumentar la conductancia de
cationes, depolar español la membrana celular y desbloqueo de los receptores NMDA. El resultado final de
estas características bioquímicas conducen a mejoras en la función de memoria y rendi-miento mental
(McEntee y Crook, 1993).

9.3 l -Lisina
9.3.1 Historical background and new challenges
l-lisina es uno de los principales y más explotación del aminoácido entre la lista de los aminoácidos
esenciales. Tiene grandes aplicaciones y papel en la nutrición humana y animal. Iniciado la investigación de
sistema-atic para explorar la posibilidad de producción de aminoácidos a través de microorganismos durante
la última década de 1940, y durante la última parte de la década de 1950, algunos frutos fueron divulgados
(Mitchell y Houlahan 1948; Windsor 1951). En consecuencia, un número
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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 195

de la investigación los investigadores publicaron sus resultados que l-lisina puede ser sintetizado de α-
aminoadipic ácido por la levadura y el moho Neurospora , o de ácido diaminopimélico (DAP) por e.
coli (Davis 1952; Dewey y trabajo 1952; Mitchell y Houlahan 1948; Windsor 1951). Sin embargo, la
producción microbiana de l-lisina a través de la descarboxilación del DAP por Chas Pfizer y Company Inc. en
los Estados Unidos fue mirado como la primera producción a escala comercial (Casida y Baldwin 1956). Un
proceso modificado (Figura 9.5) utilizando un solo organismo, que produce el DAP y se convierte en l-lisina,
luego fue descubierto al mismo tiempo y (Kita et al., 1958).

La introducción de la fermentación de ácido l-glutamic usando C. glutamicum tuvo un gran efecto eco-
nómica en el campo de la fermentación de l-lisina. La investigación adicional en este sentido resultó en el
desarrollo de un eficiente mutante de C. glutamicum para la producción comercial de l-lisina (Kinoshita et al.
1957b, 1958). Este método modificado fue utilizado también con éxito para producir algunos otros
aminoácidos (Mahmood 2010). A pesar de los desafíos comerciales, la producción de l-lisina utilizando cepas
mutantes trajo un nuevo concepto en la producción de la fermenta-TiVo de los aminoácidos. Con la aparición
de nuevos enfoques biotecnológicos y herramientas, más énfasis fue dado a la mejora de las cepas y tomar
artificialmente derivados a mutantes auxotrófica y reglamentarios que eran resistentes a la inhibición de la
regeneración. Con estas genéticamente organismos modificados, aumento de la producción de l-lisina se logró
control-ling las vías biosintéticas. El bloque biosintético más propicio para la acumulación efectiva de l-lisina
en mutantes auxotrófica observó que aquéllos que necesitan Homoserina o treonina y metionina en el
crecimiento de organismos (figuras 9.6 y 9.7).

Modificaciones en el camino biosintético extendido uno de las mayores ventajas al producir algunos otros
aminoácidos junto con l-lisina mediante C. glutamicum, B. flavumy B. lactofermentum.
 Escherichia coli DAP-decarboxilasa

Medio de cultivo adecuado

Proporción
Ácido diaminopimélico 4:1 Aerobacter aerogenes

Lisis de la célula a
liberación de la enzima por

adición de:

(a) tolueno o butanol

(b) mediante el uso de ultrasonido

CO 2

COOH−CH−CH 2 −CH 2 −CH 2 −CH−COOH CH2−CH2−CH2−CH2−CH−COOH

NH 2 NH 2 NH NH2

DAP -Lisina

Figura 9.5 Producción de l-lisina a través de la conversión de su precursor inmediato DAP (dos pasos proceso).
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196 Zafar Alam Mahmood

Aspartato de
quinasa
Aspartato
de
Aspartato de Aspertyl semi- Home- reonine
fosfato de serina
aldehído
 Dihydrodi-
El picolinato

Metionina

Diamino
pimelate

Lisina

Figura 9.6 Vías de reglamentación de vías biosintéticas de l-lisina en C. glutamicum.

Ácido aspártico
 Aspartil Aspártico
fosfato de semialdehído -Homoserina reonine

Α-Ketobutyric
Dihydropicolinic
ácido

Diaminopimélico
ácido

-Lisina -Metionina -Isoleucina

Figura 9.7 Producción de l-lisina por los mutantes auxotrófica (proceso de un solo paso).
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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 197

El aislamiento de auxotrophs puede realizarse mediante el uso de penicilina selección-técnicas seguido

por la radiación ultravioleta (Adelberg y Myers 1953; Nakayama y Kinoshita 1961). La identificación de
factores de crecimiento (como las vitaminas y los aminoácidos) de las auxotrophs se puede hacer
auxanographically (Pontecorvo 1949). Más momentos de avance en la producción de l-lisina se lograron
mediante la introducción de analógico-resistente

C. glutamicum y B. flavum. Una l-lisina analógico, S-(2-aminoethyl)-l-cisteína (AEC), es el mejor ejemplo de

desarrollo de esas cepas resistentes a la analógica. El desarrollo de una cepa resistente a la AEC se basa
principalmente en el tratamiento de un auxotroph Homoserina adecuado en un medio de cultivo
convenientemente completo que contiene extracto de carne, peptona, extracto de levadura, cloruro de sodio y
agar. El medio se complementa con N- metil -N- nitro -N- nitrosoguanidine en tampón fosfato. El tiempo de
tratamiento es corto (30 min) y a muy baja temperatura (0° C). Esto es seguido por el tratamiento de células
con AEC después de lavado con solución salina en un medio mínimo había suplementado con glucosa como
fuente de carbono, sales inorgánicas, aminoácidos, por ejemplo, l-treonina y dl-metionina. Ahora es evidente
que auxotrophy y resistencia a la inhibición de la regeneración, cuando genéticamente combinados en una
sola cepa (es decir, mutantes resistentes a AEC), resultados en aumento de produc-ción de l-lisina. La
superproducción de l-lisina puede ser debido a la inanición de threo-nueve, que disminuye la inhibición de la
regeneración de quinasa de aspartato, la primera enzima clave en la biosíntesis de l-lisina (figura 9.6). Por
supuesto es muy importante la inducción genética de un auxotropic o un regulador mutante que puede
producir l-lisina. Sin embargo, al mismo tiempo, también es indispensable para la producción de commer-cial
de l-lisina optimización de procesos (sobre todo la composición del medio y la adición de ciertos factores de
crecimiento y condiciones de cultivo).

La creciente demanda mundial de l-lisina sin duda ha creado una difícil situ-ación para los investigadores
más mejorar las cepas existentes o desarrollar nuevos organismos genéticamente modificados capaces de
producir cantidades excepcionales de l-lisina. Los principales productores de l-lisina en el mundo son
Ajinomoto (con instalaciones de fabricación en Japón, Francia, Italia, Estados Unidos, Brasil, China y
Tailandia), Archer Daniels Midlands (Estados Unidos), Changchun Dacheng (China), Cheil Jedang (con
instalaciones en China, Indonesia y Brasil), Global tecnología bioquímica (China) y COFCO bioquímicos
(China). En términos de tonelaje, estos fabricantes principales junto a otras empresas produjeron 1.755.300
toneladas de l-lisina en 2011 y las previsiones para 2013 es alrededor de 2.376.300 toneladas, que se espera
que alcance 2.518.000 toneladas, correspondientes a unos US$ 5,9 billones a finales de 2018. China es el
mayor productor y seguirá dominando como el país del mundo más grande producción de l-lisina son
responsables de aproximadamente el 65% de la capacidad de producción de lisina de mundo (IHS química
2012; Wippler 2011).

Basado en la demanda de l-lisina, que sigue aumentando, la demanda de producción rentables materias
primas y procesos de recuperación es bastante difícil y jugará un papel importante en su éxito. En la
producción fermentativa de l-lisina, todas las materias primas son sustancias naturales o biológicamente
disponibles. No hay subproductos nocivos se han encontrado en la fermentación de l-lisina. Por el contrario,
sustancias útiles quedan en el caldo pasado de que podrían recuperar muchos subproductos. El caldo pasado
todavía contiene varias sustancias útiles como com-libras de nitrógeno orgánico e inorgánico, compuestos de
fósforo y sales de potasio, que podrían ser utilizados como fertilizantes o aditivos de alimentación animal. Un
proceso reciente que consiste en el secado por pulverización del caldo fermentado todo al final de la
incubación también se ha divulgado para producir clorhidrato de l-lisina de grado de la alimentación con éxito
(Eggeling y Sahm 2011). Esto sin duda reduce el costo de producción de grado de la alimentación l-lisina así
como la disposición de material de desecho.
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noviembre
de 2014

198 Zafar Alam Mahmood

9.3.2 Biotechnological approach and production

A pesar de los enormes avances en la producción de l-lisina, los investigadores aún tratan de desarrollar un
proceso de fermentación rentable utilizando nuevas metodologías biotecnológicas. También, las empresas de
biotecnología son continuamente buscando desarrollos de nuevas investigaciones y tratando de usar modelos
de gestión multifacético y negocios se acerca hacia el liderazgo en el mercado en el campo de la l-lisina y
otros aminoácidos producción alcanzable-ing. Junto con cepas altamente productivas, el uso de materias
primas rentables y pro-cesos de recuperación se ha convertido altamente esencial para diversos fabricantes
competir y permanecer en el mercado. Las cepas genéticamente modificadas, que se han introducido para la
producción de l-lisina, pueden producir tanto como aproximadamente 170 g/L. Con el uso de enfoques engi-
neering metabólicos, se pueden realizar desarrollos más avanzados y específicos para mejorar aún más la vía
biosintética de la l-lisina y su secreción. Control sobre estas dinámicas sin duda garantiza entrega de precursor
eficaz y garantizar las necesidades de energía de las células. Se ha indicado que junto con la ingeniería
genética de la central energía metabólica de las vías, vías biosintéticas y sistemas de transporte, metabolismo
y osmo-regulación también están ganando interés entre los investigadores como nuevos objetivos a ser
diseñado para la superproducción de l-lisina. Además, las cepas que no sean de C. glutamicum, tales
como Bacillus methanolicus (bacterias methylotropic) también están ganando interés por la producción de l-
lisina utilizando metanol y lignocelulosa como materia prima alternativa (Brautaset y Ellingsen 2011).

Con los avances en biología molecular e ingeniería genética, algunos focus ha sido impulsada para
asegurar un óptimo carbono y flujo de energía en el metabolismo central (CCM) de las células bacterianas
para lograr optimiza producción metabólica. Un ejemplo específico es el de C. glutamicum en que la CCM
involucra glucólisis, la vía del fosfato de pentosa y el TCA y el anapleróticas reacciones gluconeogénicos. Se
espera que el conocimiento en profundidad de CCM junto con las actividades de la enzima específica de las
vías sin duda proporcionará una oportunidad para crear fábricas de celulares ideal para la producción de no
sólo l-lisina, pero también algunos otros industrialmente importante metabolitos, así (Papagianni 2012).

En la producción industrial de l-lisina, derecho de la selección de cepas bacterianas, la composición de

los medios de comunicación, optimización de procesos y recuperación de producto final tiene una gran
importancia en el rendimiento general y economía del proceso. Un equilibrio entre fuentes de car-bon y
nitrógeno junto con los requerimientos nutricionales de la cepa y la adición de ciertos precursores debe
tenerse en cuenta. Además, un suministro suficiente de oxígeno para satisfacer la necesidad de oxígeno de la
célula es muy esencial para el aumento del rendimiento de l-lisina. A escala industrial, fermentación
sumergida es altamente eficaz y es el método más ampliamente utilizado en todo el mundo. Las principales
materias primas tales como almidón, glu-cose, melaza y otros utilizados en la fermentación de l-lisina son
bastante comunes y se utilizan en otras industrias de fermentación, así. El organismo más comúnmente
utilizado para la fermentación de l-lisina es C. glutamicum. Por lo tanto, para entender su producción, un
ejemplo concreto ya se ha mencionado a continuación utilizando una cepa genéticamente modificada de C.
glutamicum.

Los organismos generalmente se mantienen a baja temperatura, alrededor de 6° C a 8° C, en nutri-ent

agar inclina en un programa de transferencia mensual. Una cultura de 24 h, producida por subcultur-ción del
cultivo, se utiliza generalmente para las semillas, seguidas por la fermentación. Puede utilizarse un medio
sintético o natural que tiene la capacidad para cumplir con los requisitos de la cepa particular. En escala
comercial almidones, melazas y glucosa se utilizan sobre todo como fuente de car-bon. Debe tenerse cuidado
para crear un equilibrio entre fuentes de carbono y nitrógeno como maíz empinado licor, hidrolizado ácido de
la torta de soja, extracto de levadura, peptona y similares, junto con la adición de sales inorgánicas tales como
KH2PO 4, K2HPO4, MgSO4·7H2O,
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Alam
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de 2014

Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 199

FeSO 4 ·7H 2 O, ZnSO 4 ·7H 2 O, MnSO 4 ·7H 2 O, (NH4) 2 Por lo tanto 4 y otros. Otros nutrientes necesarios
son la biotina y la vitamina B1. En algunos casos, la producción de l-lisina puede mejorarse mediante el uso
del licor de fermentación de leucina (0.2% – 15%) en el medio de producción. En la mayoría de los casos el
pH óptimo del medio ha sido grabado como 7,2 y la temperatura a 30° C. El cultivo de la etapa de semilla
requiere alrededor de 24 h, mientras que la etapa de fermentación es completa por aproximadamente 96
h. Después de esto, la cosecha se realiza y el producto, l-lisina, es recuperada mediante algún método
adecuado y económico. Pueden obtener más detalles sobre el tema a través del estudio de caso en el final del
capítulo.

9.3.3 Industrial application and therapeutic role

l-lisina tiene uno de la mayoría de aplicaciones diversificadas y roles en las industrias de alimentación,
alimentos y pharma ceutical. Es el aminoácido más importante para los animales monogástricos y es
considerado como el primer aminoácido limitante para los cerdos y el segundo aminoácido limitante para aves
de corral. Por lo tanto, es un importante aditivo para piensos para optimizar el crecimiento de cerdos y
pollos. El destino metabólico de l-lisina se destaca en la figura 9.8.

En la industria alimentaria, l-lisina se utiliza en un número de suplementos dietéticos o nutricionales que

son popularmente utilizados por atletas, levantadores de peso, los culturistas e incluso algunos individu-als
para aumentar su nivel de energía y proteger los músculos de deterioro. Suplementos nutricionales con una
alta cantidad de l-lisina están disponibles en diversas formas farmacéuticas como jarabes, comprimidos
recubiertos, cápsulas y polvo para bebidas instantáneas. l-lisina es necesaria por el organismo para sintetizar l-
carnitina, que es una sustancia necesaria para la conversión de ácidos grasos en energía. l-lisina también
ayuda en la absorción del calcio y la formación de colágeno, que son importantes para la salud muscular y
ósea. También soporta o actúa como un precursor en la síntesis de enzimas, anticuerpos y algunas hormonas
también.

Además, l-lisina también se recomienda para el tratamiento de algunas infecciones virales, por ejemplo,
herpes simple, herpes labial, culebrilla e infecciones de virus del papiloma humano como las verrugas
genitales y herpes genital. Se ha también habría utilizado el manage-ment de la migraña y algunos otros tipos
de dolor y la inflamación. Su deficiencia puede causar severos problemas de salud, crecimiento y problemas
de desarrollo, formación de cálculos renales, producción de la hormona de tiroides baja, asma e infección
viral crónica. Los síntomas incluyen náuseas, fatiga, mareos, anemia, pérdida de apetito y energía,
incapacidad de concentración-trate, irritabilidad, ojos inyectados de sangre, pérdida del cabello, retraso en el
crecimiento (especialmente en niños) y trastornos de la reproducción. La dosis terapéutica reportada de l-
lisina para el mantenimiento de un efecto antiherpético es 500 a 1500 mg y hasta 3000 mg en etapas activas
en una era de dos dividida con una dieta baja-arginina. Requerimientos diarios del cuerpo humano de l-lisina
son 103 mg/día para lactantes, 1600 mg/día para niños, 800 mg/día para machos y 500 mg/día para mujeres
adultas (Balch y Balch, 1990; Chaitow 1985; Mahmood 1996, 2010).

9.4 metionina
9.4.1 Historical background and new challenges
El descubrimiento de la bacteria productora de ácido glutámico, C. glutamicum, desembocó en procesos de
fer-mentación para la producción de varios aminoácidos. Sin embargo, durante la fase temprana, no mucha
atención fue dada a la producción fermentativa de metionina. Hay una grave escasez de publicaciones
científicas relacionadas con la producción de metionina por microorgan-ismos. Hasta 1967, disponía de muy
pocas referencias sobre el tema. En este periodo, informó de una cepa de leucina-requerir de Ustilago
maydis para acumular 6 g/L de metionina en
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200 Zafar Alam Mahmood

Dieta alta en proteínas como un

Cadena larga
fuente de - lisina
ácidos grasos

Transporte a
Digestión/analiza
mitocondrias
de proteína y Actuando como
disponibilidad de la lisina- precursor
En
CH 2 OH biosíntesis de la
C de - carnitina
H OH OH
H Glucosa OH OH
C +
C OH H N
C –
C HO H O

H OH
-Carnitina
Hidratos de Lípidos (=
carbono grasa)

metabolismo 6%metabolismo

De Krebs
ciclo Energía
Morir de De la producción
hambre alimentación y otros
Proteína y aminoácidos metabólicas
metabolismo del ácido
 Enzimas funciones

O Actuando
-Lisina como
C Cetona precursor
R R para la
síntesis de la
péptido
Péptido
hormonas
Transporte y hormonas
utilización en la
síntesis de la
colágeno y elastina Prolactina LH, FSH,
ACTH, GH, ADH,
Oxitocina, ANP o
ANF, insulina,
Gastrina,
Colecistoquinina,
Leptina
Colágeno

Esqueléticos La arteria

Lisina de tejido

Elastina
 Figura 9.8 Destino metabólico: aplicación y papel de la l-lisina.

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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 201

medio sintético y una cepa de Pseudomonas SP. G-132-13 acumulan 13,2 g/L de metionina (Dulaney 1967).
 Durante 1990 a principios de 2001, un número de contribuciones constructivas fueron hecho por varios
investigadores relativos a la producción comercial de metionina (Odunfa et al. 2001; Pham et al.,
1992; Umerie et al. 2000). Sin embargo, el proceso fermentativo todavía necesita elaborar más estudios para
su reproducibilidad y mejor rendimiento antes de ser implementada a gran escala. Actualmente, la metionina
se produce por síntesis química o por hidrólisis enzimática de proteínas. Ambos procesos son bastante
caros. Síntesis química ofrece una mezcla de dextro y levo metionina rotatorio, mientras que la hidrólisis
enzimática de las proteínas produce una mezcla compleja de la que metionina debe ser separado a través de
un proceso de recuperación costosa. Isómeros de metionina producidos a través de reacciones químicas
pueden resolverse con la ayuda de hongos enzima aminoacilasa utilizando biorreactores de enzima
inmovilizada de flujo continuo (Tosa et al. 1967). Sin embargo, el proceso químico de fabricación de manu es
todavía no es adecuado debido a la peligrosidad de productos químicos como acroleína, metil mercaotan y
amoníaco, que se utilizan durante etapas diferentes manufactur-ing (Fong et al. 1981).

Es realmente un reto para los investigadores, así como los fabricantes superar los problemas asociados a
la síntesis química. Que necesitan para encontrar una solución óptima para estos problemas y buscar en la
introducción de la producción fermentativa utilizando geneti-camente organismos modificados a escala
comercial. En bacterias, como otros aminoácidos esenciales, metionina se sintetiza a partir de oxaloacetato-
derivado de aspartato. Junto con l-lisina, la metionina es también un aminoácido dominante usado en la
alimentación animal. Sin embargo, es casi la mitad del volumen de mercado de l-lisina. El mercado de
metionina global para la alimentación animal se ha divulgado como 850.000 toneladas en 2011 y vale US$
2,85 billones (Roquette 2012). Dos grandes empresas, Cheil Jedang (Corea del Sur) y Arkema SA (Francia),
establecen una gran planta en Malasia para la fabricación de biomethionine. La operación se espera que
comience en la segunda mitad del 2013 y producirá 80.000 toneladas por año (Saidak 2012).

9.4.2 Biotechnological approach and production

Se han aplicado herramientas biotecnológicas para la producción de metionina a través auxo-trófica,
reglamentarios o auxotrófica mutantes regulatorios. Auxotrófica mutantes son generalmente menos factibles
para la metionina (aminoácidos ramificados vía) y por lo tanto, son reglamentario auxotrófica más
conveniente, porque metionina sí mismo no inhibir o reprimir su propia producción. Microorganismos como
la Brevibacterium heali pueden acumular cantidades más altas (hasta 25 g/L) de metionina (Mondal et al.
1994a, b). Regulación de la biosíntesis de la metionina en Corynebacterium y Brevibacterium se muestra en
la figura 9.9.

Mutantes regulatorios también se utilizan para la producción de metionina (Kumar et al. 2003; Kumar y
Gomes, 2005). Recientemente, un nuevo enfoque a la investigación para producir metionina bac-teria informó
mediante auxotrophs de metionina de e. coli (Ozulu et al 2012), mientras que otro estudio relativo a la
producción de l-metionina utilizando aislados de B. cereus muestras de suelo fue también reportado (dique y
Ekwealor 2012). La regulación de la bio-síntesis de la metionina en e. coli se muestra en la figura 9.10.

Corynebacterium y Brevibacterium, el mecanismo de biosíntesis para la producción de metionina es

bastante simple (figura 9.9) en comparación con el mecanismo de biosíntesis en e. coli (figura 9.10) en que
todas las enzimas son inhibidas o reprimidas por el producto final.

Mayoría de los investigadores registrados aproximadamente glucosa 10% o 5% maltosa como la fuente
de carbono complementada con sales inorgánicas y diferentes concentraciones de biotina y vita-min B 1 para
la producción fermentativa de l-metionina (Banik y Majumdar 1975; Kase
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202 Zafar Alam Mahmood

Aspartato Aspartil Aspartato de

de fosfato de semialdehído Homoserina reonine
 Dihidro-

dipicolinate

Metionina Isoleucina

Diaminopimelate

Lisina

Figura 9.9 Biosíntesis de regulación de la metionina en C. glutamicum. Las flechas azules muestran inhibi-ción y
flechas punteadas representan represión.
 Aspartil Aspartato de
Aspartato
de Homoserina reonine
fosfato de semialdehído

Dihidro-

dipicolinate

Metionina Isoleucina

Diaminopimelate

Lisina

Figura 9.10 Biosíntesis de regulación de la metionina en e. coli. Las flechas azules muestran inhibición
y las flechas punteadas muestran represión.
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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 203

y Nakayama 1975). Recuperación del producto se basa en el tratamiento con resinas de intercambio
iónico. Metionina cristalino puede obtenerse concentrando bajo vacío, tratar-ción con alcohol absoluto, y
secado a baja temperatura de aproximadamente 4° C por 24 h (Kumar y Gomes, 2005).

9.4.3 Industrial application and therapeutic role

La aplicación de la metionina se divulga sobre todo en algunas formulaciones farmacéuticas y ganado. Ya que
es un aminoácido esencial, por lo tanto se requiere en las dietas de los seres humanos y en
animales. Metionina es un agente excelente lipotróficos natural pro-cesos y elimina las grasas desde el hígado
y actúa como un agente desintoxicante natural, remov-ing los metales pesados del cuerpo y exceso histamina
en el cerebro. Además, tiene propiedades antioxidantes, así y así protege el cuerpo contra los radicales libres
(Chaitow 1985). Proteínas vegetales son con frecuencia deficientes en metionina y, por consiguiente, una
dieta vegetariana de exclu-siado puede fallar cumplir requisitos nutricionales. Deficiencia de la metionina se
ha relacionado con el desarrollo de varias enfermedades y complicaciones. Estos incluyen toxemia, la fiebre
reumática infantil, parálisis muscular, pérdida de cabello, depresión, schizophre-nia, Parkinson hígado
deterioro y retraso del crecimiento (Chaitow 1985). Estos síntomas-toms aparecen debido a las deficiencias
que pueden ser superadas mediante la incorporación de metionina en la dieta (Parcell 2002). Metionina se
utiliza extensivamente en las industrias de aves de corral y ganado (Funfstuck et al. 1997; Neuvonen et al.
1985).

9.5 Triptófano
9.5.1 Historical background and new challenges
Hasta 1967, no hay informes científicos estaban disponibles relativos a la produc-ción directa microbiana del
triptófano. Durante este período, más atención fue dada por los investigadores estudiando la posibilidad de la
producción de triptófano a través de la conversión del ácido antranílico, acoplamiento de indol y la serina, la
transaminación del ácido 3-indolepyruvic y la conversión de Ácido β-indolyllactic (Dulaney 1967). El método
químico para producir triptófano fue el primer método utilizado para la fabricación de la escala industrial
(Sidransky 2001). Esto fue seguido por la producción a través de reacción enzimática y fermentación (Potera
1991). Una variedad de microorganismos como Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y otros que
contengan triptófano sintasa (TSase; EC 4.2.1.20) o tryptophanase (TPase; CE 4.1.pp.1) puede utilizarse para
la reacción enzimática. E. coli contiene triptófano sintasa y tryptophanase (Austin y Esmond 1965; Hamilton
et al. 1985). Con la introducción de eficientes cepas de Corynebacterium y e. coli, ahora triptófano es en gran
parte producido por la fermentación. El mercado de que el triptófano no es grande. La figura de 2012 indica
que la producción de 8.400 toneladas, y las principales empresas involucradas son Ajinomoto, Cheil Jedang y
Evonik. Sin embargo, se espera que China dominan el mercado (Dong 2013; Gunderson y Koehler 2012).

9.5.2 Biotechnological approach and production

El método de producción comercial inicial se basó en síntesis química. Sin embargo, a finales de 1980, otros
métodos como la producción a través de reacción enzimática y fermentación también se incluyeron debido a
la creciente demanda de triptófano, espe-cialmente por la industria farmacéutica y alimentación. Así, los
intentos de continuados ahora se hacen, especialmente utilizando el enfoque biotecnológico para satisfacer la
producción deseada
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204 Zafar Alam Mahmood

demanda. Entre diferentes opciones, ingeniería metabólica para el l-triptófano mayor pro-ducción se ha
prestado especial atención. Los resultados fueron alentadores cuando se utilizaron e.
coli y Corynebacterium . La vía biosintética del triptófano de e. coli se muestra en la Figura 9.11.

Se han desarrollado cepas superproductoras de e. coli y C. glutamicum que contiene genes overexpressed,
que puede producir 40,2 g/L de triptófano en el adecuado medio con formación glucosa como fuente de
carbono en 40 h (Shen et al., 2012). También se informó de una cepa genéticamente de e. coli para producir
aproximadamente 10,15 g/L del l-tryptophan en 48 h (Gu et al., 2012). Se cree que más investigación
utilizando herramientas biotecnológicas más avanzadas serán capaces de aumentar la productividad de
triptófano.

a comprender el fenómeno de la fermentación de triptófano, un método breve ha sido destacada, que

refleja el uso de una cepa genéticamente modificada de C. glutamicum que es capaz de producir
triptófano. Los organismos se mantienen generalmente en un programa de transferencia mensual en sesgos de
agar nutritivo suplementado con cloruro de sodio 0,5%. Un medio de semillas que contiene peptona (5.0),
extracto de levadura (1.0), glucosa (20.0), cloruro de sodio (0,5), KH 2PO4 (0,5), K2HPO4 (1.5), MgSO4 (0,5),
NHSO44 (5.0), and calcium carbonate, (5.0 g/L) can be used. Optimum pH was observed at 6.8. Cultivation
can be done in Erlenmeyer flasks of 250 mL capacity containing 30 mL of the above sterilized medium.
Inoculation can be done with a loopful of culture grown on nutrient agar slant for 24 h. The flask should be
shaken at 200 rpm at 30°C for 24 h in an orbital shaker-incubator to prepare the seed culture.

Puede preparar un medio de fermentación de melaza (30%), licor de maíz-escarpado (0,7%),

KH2PO4 (0.05%), K2HPO4 (0,15%), MgSO4·7H2O (0,025%), (NH4)2hasta4 () 1.5%) y coche-bonate de calcio
(1%). En gramos por litro se añada una mezcla de los siguientes ingredientes: vitamina B 1 (1000.0), biotina
(50.0), l-fenilalanina (200.0) y l-tirosina (175.0). El pH de los medios de comunicación de semilla y
fermentación permanecen invariables, es decir, ajustado a 6.8, mientras que se añade 1.0 mL de silicio 20%
RD en agua desionizada como antiespumante. Para la escala de laboratorio, fermentadores mini frasco de 2 L
de capacidad que contiene 1 L de medio pueden utilizar. Serialización puede ser afectada en autoclave durante
15 min a 15 psi. Después de enfriar, el fermentador se inocula

Phosphoenol- Erythrose 4-
piruvato + fosfato de Corismato

N-(5-phosphoribosyl)- Antranilato
anthralite

Fosfato de indol 3-glicerol

Triptófano

sintasa

Triptófano

Figura 9.11 Vía biosintética del triptófano en e. coli.

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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 205

por frasco de una semilla y se agitó a 400 rpm con un flujo de aire de 1,0 vvm (aire/líquido volumen vol-ume
por minuto) a 30° C. Los fermentadores pueden cosecharse después de 72 h. producto recuperación se suele
realizar mediante ultracentrifugación a alrededor de 10.000 rpm, seguido por tratamiento con resina de
intercambio catiónico y la decoloración con carbón activado. Después de más centrifuga-ción, la mezcla
puede ser sometida a secado en un secador de vacío. El producto rendimiento generalmente oscila entre 10 y
25 g/L.

9.5.3 Industrial application and therapeutic role

Triptófano tiene una amplia gama de aplicaciones en las industrias farmacéuticas y alimentación. Como un
aminoácido esencial con una cadena lateral único indol, que indica su uso como un pre-cursor para una serie
de neurotransmisores en el cerebro, por ejemplo, serotonina, melatonina y niacina asociada con apetito, sueño,
estado de ánimo y la percepción del dolor. Su aplicación en la síntesis química de algunos medicamentos
antidepresivos y en el tratamiento de la schizophre-nia es muy prominente (Chaitow 1985; Porter et al.,
2005; Van der Heijden et al. 2005).
9.6 estudio de caso: producción de l -lisina en medio glucosa y
melaza suplementada con harina de pescado bajo
condiciones sumergidas en fermentador tarro mini
La importancia de la l-lisina ha sido destacada por muchos investigadores basados en su aplicación-cación en
las industrias de alimentos, piensos y productos farmacéuticos. La deficiencia de l-lisina puede afectar en gran
medida el crecimiento y desarrollo del hueso en los niños; en los adultos, l-lisina ayuda a la absorción de
calcio y mantiene el equilibrio de nitrógeno. Por lo tanto, puede también ayudar a prevenir la pérdida ósea
asociada con osteoporosis. Además, desempeña un papel en la mejora de la defensa mech-anisms del cuerpo,
actúan especialmente contra el herpes labial y herpesvirus y como ayuda en anticuerpos, hormonas, enzimas y
la formación de colágeno; sus beneficios en la reparación de los tejidos también no pueden ser ignorado
(Mahmood 2010).

La demanda de l-lisina es continuamente aumentando, pidiendo a los investigadores para responder al

desafío aumentando la capacidad de producción utilizando cepas bacterianas de alto rendimiento y el mejor
posible fuente económica de materias primas, especialmente carbón y nitrógeno para su producción. Este
estudio de caso es también parte de este programa. En el experimento actual, producción de l-lisina se evaluó
con dos tipos diferentes de medios de comunicación utilizando a un mutante auxotrófica Homoserina de C.
glutamicum FRL Nº 61989, que también es resis-tant a AEC. Los mutantes auxotrófica y reglamentarios son
buenas opciones para la producción de l-lisina mayor. Aislamiento del mutante auxotrófica se basa en el
tratamiento de la cepa silvestre de C. glutamicum con radiación ultravioleta, seguida por un método de selec-
ción de penicilina, mientras que cepas resistentes a la AEC fueron desarrolladas por el tratamiento de la
Homoserina auxotrófica mutante con N- metil -N- nitro -N- nitrosoguanidine, seguido del crecimiento de las
células en un medio suplementado con AEC. Las colonias que aparecieron en la superficie de la placa de agar
durante 2 a 7 días de incubación fueron recogidas como mutantes resistentes a la AEC (Mahmood 1996).

9.6.1 cultivo de C. glutamicum FRL Nº 61989

El organismo mantuvo en un programa de transferencia mensual en sesgos de agar nutritivo. Se

utilizó un medio de semilla de la siguiente composición en gramos por litro: glucosa (30.0),
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206 Zafar Alam Mahmood

peptona (10.0), extracto de levadura (5,0), cloruro de sodio (3.0), KH 2 PO 4 (0,5), K 2 HPO 4 (1.5),
MgSO 4 (0,5), NH 4 Por lo tanto 4 (0,5), acetato de sodio (0.1) y 25,5 μg/L de biotina. Se ajustó el pH a
7.2. Se inocularon matraces erlenmeyer de 250 mL que contenga 30 mL de medio esterilizado con un asa
llena de cultura en slant agar nutritivo durante 24 h. Los frascos fueron sacudidos a 200 rpm a 30° C durante
24 h en una orbital shaker-incubadora para preparar el cultivo de semillas.

Medios de fermentación I y II con la siguiente composición en gramos por litro fuimos utilizados para
estudios comparativos en términos de rendimiento y costo efectividad. Yo medio contiene glucosa (110.0),
extracto de levadura (5.0), peptona (10.0) y el extracto de carne (5.0). Medio II con contiene melaza (400.0),
harina de pescado (25.0) y licor escarpado del maíz (5.0). Ambos medios fueron complementados con los
siguientes ingredientes en gramos por litro: KH2PO4 (0,5), K2HPO4 (1.5), MgSO4·7H2O (0,5),
(NH4)2para 4 (15.0), calcio carbonato (10.0), MnSO 4·4H2 O (0.01), sulfato ferroso 4 H2O (0.01), acetato de
sodio (2.0) y vitamina B1 (0.001). La concentración-tration de biotina fue de 125.0 y 25.0 μg/L en los medios
de comunicación I y II, respectivamente. Se ajustó el pH a 7.2 para los medios de comunicación y 1,0 mL de
silicio 20% RD en agua desionizada se agregó como antiespumante.

Un litro de media I y II se transfirieron por separado a 2.0 L capacidad jarra mini fer-menters y
serializado en autoclave durante 15 min a 15 psi. Los fermentadores respectivos con formación medios de
comunicación I y II fuimos inoculados con el contenido del frasco una semilla y agitó a 400 rpm con un flujo
de aire de 1,0 vvm a 30° C. Los fermentadores se cosechan después de 96 h.

9.6.2 aislamiento, extracción y purificación de l -lisina

Después de la incubación, la temperatura de los fermentadores fue aumentada a 60° C durante 15 min y el
cultivo líquido fue transferido para separar matraces de Erlenmeyer de capacidad 3.0 L. Caldos eran se
centrifugó a 10.000 rpm mediante una centrifugadora de alta velocidad por 20 min a las células de tipo sepa y
otros materiales precipitados y luego sometidos al método de intercambio iónico para la separación y
purificación. Los sobrenadantes de ambos fermentadores se ajustaron a pH 2.0 con HCl 6N y pasa a través de
una columna independiente 30 cm de largo y 6 cm de diámetro, lleno de 250 g de Amberlite IR-120, una
resina de intercambio catiónico fuerte. La tasa de flujo del sobrenadante a través de la columna se fija en
aproximadamente 100 gotas/min para la l-lisina. Después de esto, 250 mL de agua desionizada fue pasado dos
veces por ambas columnas y eluida con 500 mL de amoníaco diluido. El líquido entero de cada columna
luego se pasa a través de Amberlite IRC-50, una resina de intercambio catiónico débil. El tamaño de la
columna, cantidad de resina y tasa de flujo de líquido se mantuvieron igual. Finalmente, columnas se lavaron
dos veces con una cantidad de 250 mL de agua desionizada y la solución fue ajustada a pH 5.5 y tratada con
10 g/L de carbón activado durante 6 h. El carbono con formación de lodos y la lisina se filtró en vacío y
concentra aproximadamente el 30% bajo presión reducida y noche izquierda en 10° C a desarrollar cristales
de l-lisina. El material se filtró y, después de lavar con agua fría desionizada, el mate-rial cristalino fue secado
en un secador de vacío.

La pureza del material se comprobó al realizar la cromatografía en capa fina en una mezcla de n-propanol
y amoniacal fuerte (67:33), utilizando ninhidrina como un reactivo del aerosol, así como al comparar el
espectro de absorción infrarrojo con estándar l-lisina. La pureza se registró como 98.9% y 98.2%,
respectivamente. También se realizó un ensayo de l-lisina y determinó el punto final
potenciométricamente. El promedio de tres experimentos produce 67.80 y 65,20 g/L de l-Lisina
Monoclorhidrato por medio glucosa y miel de caña con una producción correspondiente (Yp/s) de gg
0.6116−1 (61.6% rendimiento de conversión) y gg 0.592−1 (eficiencia de conversión de 59,2%),
respectivamente.
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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 207

9.6.3 efecto de parámetros de composición y fermentación de

los medios de comunicación en l -producción de lisina

Un proceso microbiológico complejo se observa en la fermentación de l-lisina, que es influenciado por varios
parámetros bioquímicos y físicos. Por lo tanto, un profundo conocimiento de la fisiología bacteriana y
bioquímica es esencial para alcanzar altos rendimientos del producto eligiendo la fuente más adecuada de
carbono y nitrógeno junto con la optimización de los parámetros de fermentación. En el presente estudio de
caso, después de varios estudios, de dejar de lado los parámetros nutricionales de requisito y fermentación
fueron establecidos para una cepa de C. glutamicum FRL Nº 61989 y por consiguiente aplica un estudio
comparativo final observar el capacidad de producción en medio glucosa y melaza. La cepa FRL Nº 61989
fue desarrollada por tratar una Homoserina auxotroph con AEC.

Durante la producción industrial de l-lisina, la elección de las materias primas, especialmente la fuente de
carbono y nitrógeno, depende en gran medida de la contraprestación económica. Por lo tanto, es esencial para
determinar el nivel óptimo de la fuente de carbono y nitrógeno dependiendo de las características
nutricionales de la cultura de producción. En el presente estudio, se utilizó un método que utiliza agitar frasco
experimentos con medio que contiene diferentes concentraciones de azúcar con una suficiente cantidad de
fuente de nitrógeno para satisfacer la demanda impuesta por aumentar el nivel de carbono. Un análisis de la
cantidad de l-lisina producida y la cantidad de azúcar restante después de que el proceso proporciona lo datos
necesario necesario para calcular el porcentaje de rendimiento del producto. La concentración de azúcar, que
proporciona el máximo porcentaje de rendimiento de l-lisina, puede ser tratada como la concentración óptima
del azúcar más proceder (Daoust 1976). Además, el método general utilizado para la extracción y purificación
del producto, incluyendo el tiempo de fermentación, producción y tratamiento de residuos debe tenerse en
cuenta. Del mismo modo, la optimización de
 Papel de la
Papel de la
biotina vitamina B 1

Glucosa Glucosa

Piruvato Piruvato

CO2 CO 2

Acetil – COA
Acetil – COA

OAA ASP OAA

Ciclo TCA Ciclo TCA

ASA CO 2 Α-KGA

DAP

LYS

Figura 9.12 Efecto de la biotina y la vitamina B 1 en la producción de l-lisina.

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Glucosa Antiespumante Compresor de aire

o Crecimiento
melaza Inorgánica factores
sales

Inoculación Estéril
aire
Aire
filtro

Cultivo de
Cultivo puro semilla
 Fermentadora

Centrifugación
Sobrenadante Frasco de cosecha

Lavado Elución

Vacío
Ion filtración
intercambio
 columnas

Amberlite Amberlite Carbón activado

IR-120 IRC-50
Lavado
con
frío
agua

Vacío Cristalización Evaporación bajo

-Lisina secador presión reducida

Figura 9.13 Producción a escala de laboratorio de l-lisina.

condiciones de cultivo en relación con el retiro del suministro y dióxido de carbono del oxígeno han jugado
un papel clave en la producción masiva y económica de l-lisina. Estos factores determinaron tanto la
velocidad de formación de producto y crecimiento celular.

Por el presente estudio de caso, nuestro hallazgo es que la producción de l-lisina es más o menos similar
en medio glucosa y melaza. Por lo tanto, comparar el coste de la glucosa y la melaza, la composición del
medio II justifica el uso de la melaza como fuente de carbono
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Capítulo nueve: producción microbiana de los aminoácidos 209

para la producción de l-lisina. Además, porque la melaza contiene una cantidad suficiente de biotina, el costo
del producto se puede por lo tanto reducir disminuyendo la con-centration de biotina en el medio de
melaza. Del mismo modo, el uso de harina de pescado como una fuente de nitrógeno también fue justificada
teniendo en cuenta el alto costo de hidrolizado ácido de la proteína de soja, levadura extracto, peptona y
extracto de carne. Por lo tanto, un l-lisina substancialmente menos costoso fermenta-ción puede realizarse
utilizando tales materiales razonablemente barato.

Las concentraciones de biotina y vitamina B 1 se establecieron como 125 μg/L y 1.0 mg/L,
respectivamente. Las funciones de la biotina y la vitamina B 1 en la fermentación de aminoácidos son muy
estab-publica. La biotina se divulga para ser implicados en la oxidación de la glucosa y en la síntesis de
proteínas, así como en la permeabilidad de la célula (Tosaka et al. 1979) y como un portador de dióxido de
carbono de enlaces covalentes (musgo y Lane 1971). Además, las enzimas que contiene biotina proporcionan
ácidos aspártico, un intermediario importante que conduce a la síntesis de l-lisina (Tosaka y Takinami
1978). Vitamina B1 se divulga para tomar parte en la descarboxilación oxidativa de piruvato y α-ketoglutaric
ácido en el sistema bacteriano, conduce a aumento de la formación de acetil-CoA y ácido oxaloacético,
participando así en la aumento de la formación de l-lisina (Koike y Reed 1960; Mahmood, 1996). El efecto de
la biotina y la vitamina B1 se destaca en la figura 9.12. Además, el mecanismo general de la producción de l-
lisina en la escala de laboratorio se presenta en la figura 9.13.

9.7 Conclusión
La producción microbiana de los aminoácidos ha ganado considerable atención en los últimos años debido a
su amplia aplicación en alimentos, piensos y las industrias farmacéuticas. Por lo tanto, la evaluación del tema
a la vista de recientes avances biotecnológicos está plenamente justificada para que aumentar la producción
satisfacer la demanda del mercado. Algunos aminoácidos muy específicos como el ácido glutámico, lisina,
triptófano y metionina fueron seleccionados para la revisión en este chap-ter, y que son de considerable
importancia por el papel que desempeñan en nuestra vida cotidiana. Se espera que la selección de materias
primas rentables y la utilización de un enfoque biotecnológico traerá sin duda una revolución con la
introducción de nuevas cepas microbianas capaces de producir cantidades crecientes de la
aminos ácidos. También, un profundo conocimiento de la fermentación sumergida para la producción de
aminoácidos tendrá una contribución significativa. Con este enfoque, el capítulo ha sido escrito para
proporcionar información completa sobre la producción, aplicación y mercado dimen-nes cubriendo cuatro
aminoácidos importantes para estudiantes e investigadores interesados o trabajando en estos temas. Se espera
que la información citada ayudará a analizar y comprender la dinámica del tema y para superar los desafíos
que se espera que durante el proceso de diseño y optimización para la fermentación de aminoácidos.