 Pengeringan dilakukan di tempat yang terlindung dari cahaya matahari langsung, hal ini

dilakukan untuk menghindari kemungkinan terjadinya kerusakan pada kandungan kimia

daun akibat pemanasan.

 Maserasi dipilih karena proses pengerjaan yang mudah dan peralatan yang cukup

sederhana.

 Etanol lebih efisien dalam degradasi dinding sel sehingga polifenol akan tersari lebih

banyak. Selain itu, flavonoid ditemukan lebih tinggi pada penggunaan etanol 70% pada

proses ekstraksi

 Maserasi merupakan metode kestraksi yang sederhana , tetapi masih digunakan secara

luas. Proses awal ekstraksi komponen-komponen aktif dari suatu jaringan tanaman adalah

dengan menghaluskan jaringan tanaman tersebut. Hal ini bertujuan untuk memperbesar

peluang terlarutnya komponen0komponen metabolit yang diinginkan. Tetapi sebelum

ekstraksi, jaringan tanaman dikeringkan untuk mempertahankan kandungan metabolit

dalam tanaman yang telah dipotong sehingga proses metabolism terhenti.

 Prosedur maserasi dilakukan dengan merendam bahan tanaman (simplisia) dalam pelarut

yang sesuai dalam wadah tertutup pada suhu kamar. Metode ini sesuai baik untuk

ekstraksi pendahuluan maupun untuk jumlah besar. Pengadukan seseskali atau secara

konstan (dengan menggunakan alat pengocok mekanik untuk menjamin kehomogenan)

dapat meningkatkan kecepatan ekstraksi. Proses ekstraksi dapat dihentikan ketika

tercapai keseimbangan antara konsentrasi metabolit dalam ekstrak dan dalam bahan

tanaman. Setelah ekstraksi, residu bahan tanaman (mserat) , harus dipisah dari pelarut.

Hal ini melibatkan proses pemisahan kasar dengan cara dekantasi, biasanya diikuti

dengan tahap penyaringan. Sentrifugasi mungkin diperlukan jika serbuk terlalu halus
 untuk disaring. Untuk memastikan ekstraksi yang menyeluruh, umumnya dilakuakan

maserasi pendahuluan, yang diikuti pemisahan dan penambahan pelarut baru ke maserat.

Hal ini bisa dilakuakn secara periodic dengan semua filtrate dikumpulkan

 Kelebihan maserasi: peralatan yang digunakan sederhana dan efektif untuk senyawa

senyawa yang tidak tahan panas karena dilakukan pada temperature kamar, sehingga

tidak menyebabkan degradasi senyawa0senyawa tidak tahan panas.

 Kelemahan: prosesnya memakan waktu yang cukup lama dan dapat berlangsung

beberapa jam sampai beberapa minggu. Ekstraksi secara menyeluruh juga dapat

menghabiskan sejumlah besar volume pelarut dan dapat berpotensi hilangnya metabolit,

selin itu, beberapa senyawa tidak terdetiksi secara efisian jika kurang terlarut dalam

temperature kamar. Baca aja

 Pengujian aktivitas antioksidan secara kuantitatif dilakuakn dengan metode DPPH.

Metode DPPH ini dipilih karena meruapakan metode yang sederhana, mudah, cepat dan

peka serta hanya memerlukan sedikit sampel untuk evaluasi aktivitas antioksidan dari

senyawa bahan alam

 Prinsip pengukuran aktivitas antioksidan secara kuantitatif menggunakan metode DPPH

ini adalah adanya perubahan intensitas warna ungu DPPH yang sebanding dengan

konsentrasi larutan DPPH tersebut. Radikal bebas DPPH yang memiliki elektron tidak

berpasangan akan memberikan warna ungu. Warna akan berubah menjadi kuning saat

elektronnya berpasangan. Perubahan intensitas warna ungu ini terjadi karena adanya

peredaman radikal bebas yang dihasilkan oleh bereaksinya molekul DPPH dengan atom

hidrogen yang dilepaskan oleh molekul senyawa sampel sehingga terbentuk senyawa

Difenil pikril hidrazin dan menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke
 kuning. Perubahan warna ini akan memberikan perubahan absorbansi pada panjang

gelombang maksimum DPPH menggunakan spektrofotometri UV-Vis sehingga akan

diketahui nilai aktivitas peredaman radikal bebas yang dinyatakan dengan nilai IC50

(Inhibitory concentration) (Molyneux, 2004).

 Aktivitas antioksidan dari ekstrak etanol yang tergolong sangat kuat berhubungan dengan

kandungan metabolit sekunder yang dikandungnya. Flavonoid merupakan antioksidan

eksogen yang mengandung gugus fenolik dan telah dibuktikan bermanfaat dalam

mencegah kerusakan sel akibat stres oksidatif. Mekanisme kerja dari flavonoid sebagai

antioksidan dapat secara langsung maupun secara tidak langsung. Flavonoid sebagai

antioksidan secara langsung adalah dengan mendonorkan ion hidrogen sehingga dapat

menstabilkan radikal bebas yang reaktif (Saija, et al., 1995; Arora, et al.,1998) dan

bertindak sebagai scavenger/penangkal radikal bebas secara langsung (Arora, et al.,1998;

Nijveldt, et al., 2001). Flavonoid sebagai antioksidan secara tidak langsung bekerja di

dalam tubuh dengan meningkatkan ekspresi gen antioksidan endogen melalui beberapa

mekanisme seperti peningkatan ekspresi gen antioksidan melalui aktivasi nuclear factor

eryhtrid 2 related factor 2 (Nrf2) sehingga terjadi peningkatan gen yang berperan dalam

sintesis enzim antioksidan endogen sepertiSOD (superoxide dismutase) (Sumardika,

Jawi, 2012).

 Isolasi senyawa fenolik seperti flavonoid umumnya dilakukan dengan metode

ekstraksi, yakni dengan cara maserasi atau sokletasi menggunakan pelarut yang dapat

melarutkan flavonoid. Proses preparasi dan ekstraksi ini tidak dengan menggunakan

pemanasan, hal ini dikarenakan proses pemanasan akan membuat kadar dari flavonoid

berkurang karena adanya proses oksidasi. Selain itu, proses pemanasan dapat
 mengakibatkan penurunan kadar total flavonoid. Flavonoid pada umumnya larut dalam

pelarut polar, kecuali flavonoid bebas seperti isoflavon, flavon, flavanon dan flavonol

termetoksilasi lebih mudah larut dalam pelarut semi polar. Oleh karena itu, pada proses

ekstraksinya, untuk tujuan skrining maupun isolasi, umumnya menggunakan pelarut

metanol atau etanol. Hal ini disebabkan karena pelarut ini bersifat melarutkakn senyawa-

senyawa mulai dari yang kurang polar sampai dengan polar (16,17).

 Untuk meningkatkan penyarinya biasanya menggunakan campuran etanol dan air.

Perbandingan jumlah etanol dan air terganutng pada bahan yang disari. Etanol dapat

melarutkan alkaloid basa, minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon,

flavonoid, steroid, damar dan klorofil. Lemak, malam, tannin dan saponin hanya sedikit

larut. Dengan demikian zat pengganggu yang terlarut hanya sedikit (16)

 Etanol lebih mudah untuk menembus membrane sel untuk mengekstrak bahan

intraseluler dari bahan tumbuhan, tidak menyebabkan pembengkakan membran sel dan

memperbaiki stabilitas bahan obat terlarut. Keuntungan lain dari etanol mampu

mengendapkan albumin dan menghambat kerja enzim. Etanol 70% sangat efektif dalam

menghasilkan jumlah bahan aktif yang optimal, dimana bahan pengganggu hanya skala

kecil yang turut ke dalam cairan pengekstraksi. Metanol lebih polar disbanding etanol

namun karena sifat yang toksik, sehingga tidak cocok digunakan untuk ekstraksi (14,16).

 Tujuan dikeringkan adalah untuk mengurangi agar kadar air, aktifitas mikroba dan

mencegah timbulnya jamur sehingga dapat di simpan lebih lama (pengawetan) dan tidak

mudah rusak serta komposisi kimianya tidak mengalami perubahan.

 Pengeringan tanpa menggunakan sinar matahari langsung bertujuan agar senyawa yang

terkandung tidak mengalami kerusakan.

 Sampel yang telah kering kemudian dihaluskan dengan blender agar diperoleh potongan

kecil (serbuk) daun. Hal ini dilakukan untuk memperluas permukaan, sehingga kontak

antara sampel dan pelarut semakin besar senyawa organik yang terdapat di dalam sampel

dapat terlarut sebanyak mungkin di dalam pelarut

 Selain bersifat antioksidan senyawa fenolik atau polifenol juga dapat menstimulasi

metabolisme tulang dalam proses osteogenesis. Penelitian Zhang (2008) menunjukkan

bahwa flavonoid dapat merangsang proliferasi dan deferensiasi osteoblastik

 SOR termasuk radikal superhidroksid, radikal hidroksil, hydrogen peroksidase dan lipid

peroksida radikal diperlukan oleh tubuh untuk proses signaling dan proses fagositosis

bakteri, akan tetapi adanya SOR yang berlebihan tidak baik oleh tubuh

 Mekanisme perusakan sel oleh radikal bebas berawal dari teroksidasinya asam lemak tak

jenuh pada lapisan lipis membrane sel, reaksi ini mengawali terjadinya oksidasi lipid

berantai yang menyebabkan kerusakan membrane sel, oksidasi lebih jauh akan terjadi

pada protein yang berakibat fatal dengan rusaknya DNA.

 Sebenarnya tubuh mempunyai sistem antioksidan termasuk superoksid dismutase,

katalase dan glutation akan tetapi jika terjadi paparan oksidan yang berlebihan

antioksidan tubuh ini tidak akan mampu mengatasinya, sehingga tubuh memerlukan

pasokan antioksidan dari luar seperti flavonoid, vitamin A, vitamin C, vitamin E,

selenium, seng dan L-sistein

 Ada bebrapa metode yang dapat digunakan dalam penetapan aktivitas antioksidan,

metode penangkapan radikal dengan radikal buatan stabil DPPH merupakan metode yang

hasilnya dapat dipercaya, sehingga digunakan dalam beberapa penelitian dalam jurnal-

jurnal ilmiah baru.

 Flavonoid dan derivate polifenol merupakan senyawa yang berfungsi sebagai antioksidan

karena ketiga senyawa tersebut adalah senyawa-senyawa fenol, yaitu senyawa

dengan suatu gugus –OH yang terikat pada karbon cicin aromatic, produk radikal

bebas senyawa-senyawa ini terstabilkan secara resonansi dan karena itu tak reaktif

dibandingkan dengan kebanyakan radikal bebas lain sehingga dapat berfungsi

sebagai antioksidan yang efektif

 Proses penangkapan radikal ini melalui mekanisme pengambilan atom hodrogen

dari senyawa antioksidan oleh radikal bebas, sehingga radikal bebas menangkap

satu electron dari antioksidan. Radikal bebas sintetik yang digunakan DPPH.

Senyawa DPPH bereaksi dengan senyawa antioksidan melalui pengambilan atom

hydrogen dari senyawa antioksidan untuk mendapatkan pasangan electron.

 Senyawa yang bereaksi sebagai penangkap radikal akan mereduksi DPPH yang

dapat diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning

ketika electron ganjil dari radikal DPPH telah berpasangan dengan hydrogen dari

senyawa penangkap radikal bebas yang akan membentuk DPPH-H tereduksi.

 Perhitungan yang digunakan dalam penentuan aktivitas penangkap radikal adalah

nila IC50, nilai tersebut menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang

dapat menangkap radikal sebesar 50%.

 Nilai IC50 diperoleh dengan menggunakan persamaan regresi linier yang

menyatakan hubungan antara konsentrasi sampel (senyawa uji) dengan symbol x

dengan aktivitas penangkap radikal rata-rata dengan symbol y dari seri replikasi

pengukuran. Semakin kecil nilai IC50 maka senyawa uji tersebut mempunyai

keefektifan sebagai penangkap radikal yang lebih baik.

 Operating time atau waktu reaksi dari berbagai konsentrasi juga bervariasi, maka

penentuan operating time dari senyawa uji yang paling tepat adalah menentukan

watu sempurna reaksi yang ditunjukkan dengan tidak ada lagi penurunan

absorbansi. Kecepatan waktu sempurnanya reaksi diindikasikan sebagai slah satu

parameter dalam penentuan aktivitas penangkap radikal.

 Vitamin C mudah mengalami oksidasi oleh radikal bebas karena mempunyai ikatan

rangkap dan dengan adanya 2 gugus –OH yang terikat pada ikatan rangkap tersebut,

radikal bebas akan mencabut atom hydrogen dan menyebabkan muatan negative pada

atom oksigen yang selanjutnya akan didelokalisasi melalui resonansi, sehingga

manghasilkan radikal bebas yang stabil dan tidak membahayakan.

 Molekul vitamin C mempunyai 2 tempat abstraksi hydrogen yang terhubung secara

internal, sehingga ada abstraksi lanjutan setelah abstraksi hydrogen pertama oleh radikal

DPPH, hal ini menyebabkan perbandingan stokimetrinya 2:1, artinya 2 molekul DPPH

ditangkap atau direduksi oleh satu molekul vitamin C.

 Vitamin C mudah mengalami oksidasi oleh radikal bebas karena mempunyai ikatan

rangkap dan dengan adanya 2 gugus –OH yang terikat pada ikatan rangkap tersebut,

radikal bebas akan mencabut atom hydrogen dan menyebabkan muatan negative pada

atom oksigen selanjutnya akan didelokalisasi melalui resonansi, sehingga menghasilkan

radikal bebas yang stabil dan tidak membahayakan.

- Simple random sampling: teknik pengambilan sampel yang memberikan kesempatan

yang sama kepada populasi untuk dijadikan sampel. Syarat: anggota populasi tidak

memiliki strata sehingga relative homogeny dan adanya kerangka sampel yaitu

merupakan daftar elemen: populasi yang dijadikan dasar untuk pengambilan sampel

- Validitas internal: mempertanyakan apakah suatu variable ekspertimental telah sungguh:

menyebabkan perbedaan. Sesuatu yang berkaitan dengan kendali/control terhadap

variable” lain di luar variable bebas. Menyakinkan pihak lain bahwa semua yg variable

luaran telah dikendalikan dan tidak menimbulkan efek. (replikasi dan perlakuan banding)

- Validitas eksterna: apakah hasil diperoleh dapat digeneralisasikan kepada populasi

(radomisasi)

- Uji normalitas data: untuk mengukur apakah data berdistribusi normal, sehingga dapat

digunakan dalam analisis statistic parametric, jika asumsi ini dilanggar, maka uji statistic

menjadi tidak valid atau bias terutama untuk sampelm kecil. Uji parametric dibangun dari

distribusi normal

- Shapiro-wilk: lebih sensitive dibandingkan menghitung koefesien varians, rasio skweness

dan rasio kurtosis, lebih objektif dibandingkan plots atau histogram

- Uji homogenitas: membandingkan data (data harus sejenis) untuk melihat sambel berasal

dari varian yang homogeny

- Anova: untuk menguji hipotesis rata” k samp;e yang berpasangan, data berbentuk interval

atau rasio. Syarat: sampel diambil secara random, berdistribusi normal, varian antar

sampel homogenyp.
- enelitian eksperimental: penelitian yang memungkinkan peneliti memberikan perlakuan

atau intervensi kepada subjek penelitian, kemudian perlakuan itu diukur dan diamati.

Pada dasarnya ungin menguji hubungan antar suatu sebab dan akibat.

- Beberapa unsur dalam penelitian eksperimental: adanya kelompok control dan kelompok

perlakuan, serta adanya perlakuan.

- Replikasi: banyaknya unit eksperimental yang mendapat perlakuan sama dengan pada

kondisi tertentu. Beberapa kali suatu perlakuan yang sama diberikan pada unit

eksperimental. Untuk mengestimasi kesalahan eksperimen, meningkatkan presisi hasil

eksperimental, memperluas jangkauan generalisasi hasil eksperimen. Jika tidak ada

replikasi maka tidak dapat disimpulkan bahwa ada perbedaan efek antarperlakuan

- Randomisasi: setiap unit eksperimen mempunyai kesempatan yang sama untuk

mendapatkan perlakuan atau tidak mendapatkan perlakuan. Menjaga validitas genralisasi

hasil eksperimen kepada populasinya

- Perlakuan control (control negative): air (tidak mempunyai efek) dapat menilai efek

mutlak

- Perlakuan banding (control positif): vit C (telah diketahui mempunyai sifat antioksidan),

untuk menilai efek realatif. Agar rancangan eksperimental menjadi lebih efektif. Dapat

menghasilkan uji kemaknaan menjadi lebih sensitive atau meningkatnya kuat uji karena

akan mengurangi besarnya kesalahan eksperimen

- Kriteria inklusi: karakteristik umum subjek penelitian dari suatu populasi, suatu target

dan terjangkau akan diteliti

- Kriteria eksklusi: keadaan yang menyebabkan subyek memenuhi kriteria inklusi namun

tidak dapat diikutsertakan dalam penelitian

- Definisi operasional: mendefinisikan variable secara operasional dan berdasarkan

karakteristik yang diamati, memungkinkan peneliti untuk melakukan observasi atau

pengukuran secara cermat terhadap suatu objek atau fenomena

 Plasebo:

 sebuah pengpbatan yang tidak berdampak atau penanganan palsi yang bertujuan

untuk mengontrol efek dari pengharapan

 zat yang secara fisik menyerupai obat akrif tetapi sebetulnya tidak memiliki

kandungan obat yang sesungguhnya

 dengan membandingkan efek dari obat aktif dan placebo, peneliti dapat

menentukan apakah obat memiliki efek khusus di luar yang diharapkan.

Senyawa flavonoid untuk obat mula-mula diperkenalkan oleh seorang Amerika bernama Gyorgy

(1936). Secara tidak sengaja Gyorgy memberikan ekstrak vitamin C (asam askorbat) kepada

seorang dokter untuk mengobati penderita pendarahan kapiler subkutaneus dan ternyata dapat

disembuhkan. Mc.Clure (1986) menemukan pula oleh bahwa senyawa flavonoid yang diekstrak

dari Capsicum anunuum serta Citrus limon juga dapat menyembuhkan pendarahan kapiler

subkutan. Mekanisme aktivitas senyawa tersebut dapat dipandang sebagai fungsi „alat

komunikasi‟ (molecular messenger} dalam proses interaksi antar sel, yang selanjutnya dapat

berpengaruh terhadap proses metabolisme sel atau mahluk hidup yang bersangkutan, baik

bersifat negatif (menghambat) maupun bersifat positif (menstimulasi).

Sastrohamidjojo, Hardjono. 1996. Sintesis Bahan Alam. Yogyakarta: Gadjah Mada University

Press.

Flavonoid adalah sekelompok besar senyawa polifenol tanaman yang tersebar luas dalam berbagai

bahan makanan dan dalam berbagai konsentrasi. Komponen tersebut pada umumnya terdapat dalam

keadaan terikat atauterkonjugasi dengan senyawa gula. Lebih dari 4000 jenis flavonoid
telahdiidentifikasi dan beberapa di antaranya berperan dalam pewarnaan bunga, buah,dan daun

(de Groot & Rauen, 1998).Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid (yaitu flavonoid tanpa gula

terikat)terdapat dalam berbagai bentuk struktur.

Berbagai sayuran dan buah-buahan yang dapat dimakan mengandungsejumlah flavonoid. Konsentrasi

yang lebih tinggi berada pada daun dan kulitkupasannya dibandingkan dengan jaringan yang

lebih dalam. Stavric dan Matula(1992) melaporkan bahwa di negara-negara Barat, konsumsi

komponen flavonoid bervariasi dari 50 mg sampai 1 g per hari dengan 2 jenis flavonoid terbesar

berupa quersetin dan kaempferol.Sebagai antioksidan, flavonoid dapat menghambat

penggumpalan keping-keping sel darah, merangsang produksi nitrit oksida yang dapat

melebarkan(relaksasi) pembuluh darah, dan juga menghambat pertumbuhan sel-sel kanker.

Flavonoid juga memiliki beberapa sifat seperti hepatoprotektif, antitrombotik,

antiinflamasi, dan antivirus (Stavric dan Matula, 1992). Sifat antiradikal flavonoid terutama

terhadap radikal hidroksil, anionsuperoksida, radikal peroksil, dan alkoksil (Huguet, et al., 1990;

Sichel,et al.,1991). Senyawa flavonoid ini memiliki afinitas yang sangat kuat terhadap ion Fe (Fe

diketahui dapat mengkatalisis beberapa proses yang menyebabkanterbentuknya radikal bebas). Aktivitas

antiperoksidatif flavonoid ditunjukkanmelalui potensinya sebagai pengkelat Fe (Afanas‟av,et al.,

1989 ; Morel,et al.,1993).

Istilah

radikal bebas merujuk ke atom atau gugus atom apa saja yangmemiliki satu atau lebih elektron

tak berpasangan. Karena jumlah elektron ganjil,maka tidak semua elektron dapat berpasangan.

Meskipun suatu radikal bebastidak bermuatan positif atau negatif, spesi semacam ini sangat

reaktif karenaadanya elektron tak berpasangan. Suatu radikal bebas biasanya dijumpai sebagaizat antara yang

tak dapat diisolasi usia pendek, sangat reaktif, dan berenergi tinggi(Fessenden, 1997 : 223).
Radikal bebas bisa terbentuk, misal ketika komponen makanan diubahmenjadi bentuk energi

melalui proses metabolisme. Pada proses metabolisme inisering kali terjadi kebocoran elektron.

Dalam kondisi demikian, mudah sekaliterbentuk radikal bebas, seperti anion superoksida,

hidroksil, dan lain-lain.Radikal bebas juga dapat terbentuk dari senyawa lain yang sebenarnya

bukanradikal bebas, tetapi mudah berubah menjadi radikal bebas. Misal, hidrogenperoksida

(H2O2), ozon, dan lain-lain. Kedua kelompok senyawa tersebut seringdiistilahkan sebagai

Senyawa Oksigen Reaktif (SOR) atau Reactive OxygenSpecies (ROS) (Winarsi, 2011 : 12).

Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman hijau, kecuali

alga. Menurut Markham (1988),

Teori radikal bebas pertama kali diajukan oleh hormone (1956), radikal bebas diartikan sebagai

molekul yang mempunyai satu atau lebih electron yang tidak berpasangan di orbit luarnya

sehingga relative tidak stabil. Untuk mendapatkan kestabilannya, molekul yang bersifat reaktif

tersebut mencari pasangan elektronnya, sehingga disebut juga reactive oxygen species (ROS).

Teori radikal bebas diperkenalkan pertama kali oleh Denham Harman pada tahun 1956. Radikal

bebas adalah senyawa kimia yang berisi electron tidak berpasangan. Radikal bebas tersebut

terbentuk sebagai hasil sampingan berbagai proses selular atau metabolisme normal yang

melibatkan oksigen. Sebagai contonh adalah reactive oxygen species (ROS) dan reactive

nitrogen species (RNS) yang dihasilkan selama metabolisme normal. Karena elektronnya tidak

berpasangan, secara kimiawi radikal bebas akan pasangan electron lain dengan bereaksi dengan

substansi lain terutama protein dan lemak tidak jenuh